Ultimo aggiornamento: agosto 17, 2026
Il succinato extracellulare derivato dai macrofagi autorizza le cellule staminali neurali a sopprimere la neuroinfiammazione cronica
Punti salienti
•Le NSC provenienti dai tessuti somatici o la riprogrammazione diretta reprimono ugualmente la neuroinfiammazione
•Il succinato extracellulare attiva SUCNR1/GPR91 sulle NSC
•Le NSC attivate secernono PGE2 e eliminano il succinato, quindi riprogrammare il tipo 1 parlamentari
•Le NSC mutanti sucnr1 hanno ridotto l'attività antinfiammatoria dopo il trapianto
Riepilogo
Cellula staminale neurale (NSC) il trapianto può influenzare le risposte immunitarie e sopprimere l’infiammazione nel sistema nervoso centrale. Metaboliti, come il succinato, modulare il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie, ma non è chiaro se e come le NSC vengano attivate anche da tali immunometaboliti per controllare l’immunoreattività e le risposte infiammatorie. Qui, mostriamo che le NSC somatiche trapiantate e indotte direttamente migliorano l'infiammazione cronica del sistema nervoso centrale riducendo i livelli di succinato nel liquido cerebrospinale, diminuendo così i fagociti mononucleari (deputato) infiltrazione e danno secondario al sistema nervoso centrale. I MP infiammatori rilasciano succinato, che attiva il recettore succinato 1 (SUCNR1)/GPR91 sulle NSC, portandoli a secernere la prostaglandina E2 e ad eliminare il succinato extracellulare con conseguenti effetti antinfiammatori. Così, il nostro lavoro rivela un ruolo inaspettato per l'asse succinato-SUCNR1 nelle NSC somatiche e indotte direttamente, che controlla la risposta delle cellule staminali ai segnali metabolici infiammatori rilasciati per tipologia 1 MP nel cervello cronicamente infiammato.
Introduzione
I progressi nella biologia delle cellule staminali hanno alimentato la speranza che le malattie del sistema nervoso centrale possano essere migliorate dai farmaci a base di cellule staminali non emopoietiche (Martino e Pluchino, 2006). Abbiamo fornito prove convincenti dell'efficacia del trapianto di cellule staminali neurali somatiche (NSC) migliora le caratteristiche clinico-patologiche dei modelli animali di disturbi infiammatori del sistema nervoso centrale. Oltre la sostituzione strutturale delle cellule del sistema nervoso centrale danneggiate, il nostro lavoro ha dimostrato che le NSC trapiantate si impegnano in complessi programmi di comunicazione dal trapianto di cellule staminali all'ospite, nel complesso portando al supporto trofico e alla modulazione delle risposte immunitarie adattative e innate (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino and Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009B). Nello specifico, I trapianti di NSC riducono il carico di infiammazione nel sito della lesione (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009UN), diminuire il numero di tipi 1 fagociti mononucleati infiammatori (parlamentari) (Cusimano et al., 2012), e promuovere la guarigione del sistema nervoso centrale danneggiato attraverso meccanismi ancora poco caratterizzati.
Tuttavia, la traduzione clinica delle terapie sperimentali per le NSC è ancora limitata dalle fonti da cui provengono le NSC umane (hNSC) sono derivati (Anderson et al., 2017), l’immunogenicità intrinseca delle linee allogeniche hNSC (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Riso et al., 2013), e la stabilità del cosiddetto “lotto di cellule cliniche previste” (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). NSC indotte direttamente autologhe e stabilmente espandibili (iNSC) dai fibroblasti dermici dei pazienti stanno emergendo come una valida alternativa alle terapie per le NSC (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). La riprogrammazione diretta in iNSC evita la laboriosa progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione in lignaggi desiderati descritti per le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) tecnologia (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Perciò, produrre iNSC stabilmente espandibili da cellule somatiche rappresenta il modo più fattibile per ottenere cellule staminali cerebrali autologhe per applicazioni cliniche a valle (Wörsdörfer et al., 2013). Tuttavia, l’efficacia delle iNSC direttamente riprogrammate nel trattamento dei disturbi infiammatori del sistema nervoso centrale non è stata ancora testata.
Nelle forme progressive di sclerosi multipla (SM), L'infiammazione cronica del sistema nervoso centrale è sostenuta da un'attivazione diffusa di MP che includono sia la microglia residente nel sistema nervoso centrale che i macrofagi infiltranti derivati da monociti (Mallucci et al., 2015). Le MP si trovano nelle lesioni della materia grigia, vicino ai neuriti degenerati e ai corpi cellulari neuronali (Peterson et al., 2001), e nelle lesioni della sostanza bianca, dove il bordo esterno della microglia attivata è associato a danno tissutale cronico (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Aree di sostanza bianca apparentemente normale sono caratterizzate anche da accumulo di MP, che porta alla formazione di noduli microgliali che guidano la patologia della malattia indipendentemente dalla concomitante attivazione delle cellule T (Moll et al., 2011). Il ruolo dannoso dell’infiammazione cronica guidata da MP nella SM progressiva è supportato anche da prove in modelli di malattie animali, dove il suo carico complessivo è correlato alla compromissione della funzione neuronale (Planche et al., 2017), atrofia cerebrale (Albero et al., 2015), e risposte rigenerative ridotte (Jiang et al., 2014).
L’attivazione delle MP da parte di stimoli proinfiammatori provoca uno switch metabolico verso la glicolisi e una ridotta fosforilazione ossidativa (OXPHOS) (Kelly e O'Neill, 2015). Prove recenti lo suggeriscono, all’interno di questo ricablaggio metabolico, tipo 1 i MP infiammatori accumulano succinato, con importanti implicazioni fisiopatologiche (Tannahill et al., 2013). Il succinato intracellulare inibisce l'attività degli enzimi prolilidrossilasi (Dottorati di ricerca), stabilizzando così l'elemento reattivo all'ipossia (HIF)-1α e inducendo la trascrizione dell'interleuchina (IL)-1B (Tannahill et al., 2013). Inoltre, ossidazione del succinato da parte della succinato deidrogenasi (SDH) ripropone i mitocondri dalla sintesi di ATP alle specie reattive dell'ossigeno (ROS) produzione come ulteriore segnale proinfiammatorio (Mills et al., 2016). Tipo 1 I MP infiammatori rilasciano anche succinato extracellulare e sovraregolano il suo recettore succinato affine 1 (SUCNR1), un recettore accoppiato a proteine G (noto anche come GPR91), che funziona come sensore autocrino e paracrino per migliorare la produzione di IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).
Come tale, il metabolismo sta emergendo come un importante bersaglio terapeutico per modulare l'attivazione di entrambi i macrofagi (Kelly e O'Neill, 2015) e microglia (Orihuela et al., 2016), e i percorsi correlati al succinato hanno funzioni chiave di modulazione immunitaria per le malattie infiammatorie acute e croniche (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).
Date le comprovate proprietà immunomodulatorie delle NSC (Pluchino and Cossetti, 2013), abbiamo ipotizzato che le NSC possano esercitare i loro effetti terapeutici nella neuroinfiammazione cronica modulando il metabolismo delle MP verso la riduzione del danno secondario al sistema nervoso centrale.
In questo lavoro, abbiamo studiato i meccanismi molecolari che sono alla base della capacità delle NSC somatiche e direttamente indotte di contrastare i cambiamenti metabolici di tipo 1 MP infiammatorie sia in vivo che in vitro. Mostriamo che le iNSC e le NSC trapiantate sono funzionalmente equivalenti nel migliorare la neuroinfiammazione cronica nei topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EEA). Le iNSC/NSC trapiantate cambiano il profilo di attivazione delle microglia residenti nel sistema nervoso centrale e dei macrofagi infiltranti derivati da monociti verso un fenotipo antinfiammatorio, così come ridurre i livelli dell'immunometabolita succinato nel liquido cerebrospinale (QCS). Le iNSC/NSC riducono anche il succinato extracellulare rilasciato per tipo 1 MP infiammatori per riprogrammare il loro metabolismo verso OXPHOS in vitro. Meccanicisticamente, mostriamo che il succinato viene secreto per tipo 1 Le MP suscitano nelle iNSC/NSC una cascata di segnali a valle di SUCNR1, che consente la loro attività antinfiammatoria. Questa funzione antinfiammatoria con licenza succinata delle iNSC/NSC è mediata dalla secrezione di prostaglandine (PAG) E2, così come da una notevole eliminazione del succinato extracellulare. La perdita della funzione Sucnr1 nelle NSC porta ad attività antinfiammatorie significativamente ridotte in vitro e in vivo dopo il trapianto nell'EAE.
Il nostro studio scopre un asse succinato-SUCNR1 che chiarisce come le NSC rispondono ai segnali metabolici infiammatori per inibire l'attivazione del tipo 1 MP nella neuroinfiammazione cronica.
Risultati
Il trapianto di NSC migliora la neuroinfiammazione cronica ed è associato alla riduzione dell’immunometabolita succinato nel liquido cerebrospinale
Abbiamo prima valutato gli effetti dell'intracerebroventricolare (ICV) trapianto al picco della malattia (PD) di iNSC o NSC nei topi con EAE cronica indotta da MOG35-55 e confrontato con topi EAE di controllo trattati con PBS. Prima del trapianto, Le iNSC e le NSC sono state ampliate, caratterizzato (Figura S1), ed etichettato con farnesilato (F)GFP in vitro. A 30 giorni post-trapianto (dip), I trapianti di iNSC e NSC sono sopravvissuti, distribuito, e integrato nel cervello e nel midollo spinale dell'EAE (Figura S2). Solo una minoranza di cellule fGFP+ recuperate (iNSC: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) stavano proliferando (Figura 1A) o esprimendo neuronale (Figura 1B), astrogliale (Figura 1C), o oligodendrogliali (Figura 1D) indicatori di lignaggio (Figura S2). La maggioranza (∼75%) delle iNSC sopravvissute al trapianto si è invece scoperto che non esprimevano nessuno dei marcatori del lignaggio neurale testati e si localizzavano attorno ad aree meningee perivascolari simili a nicchie vicine alle MP endogene F4/80+ (Figura 1E), come osservato negli innesti di NSC somatici (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). Il trapianto di iNSC ha indotto un effetto significativo e duraturo (fino a 90 dip) miglioramento dei punteggi EAE, da cui è partito 15 A 20 dpt in poi (Figure 1F e S2). Il recupero funzionale è stato confermato anche dall'analisi automatizzata dell'andatura assistita da computer (Figura S2). Complessivamente, Le iNSC trapiantate con icv erano sicure e hanno portato a un recupero comportamentale e patologico.
Abbiamo quindi analizzato la composizione degli infiltrati infiammatori del sistema nervoso centrale tramite citometria a flusso ex vivo in iNSC- e topi EAE di controllo trapiantati con NSC rispetto a quelli trattati con PBS. Il trapianto di iNSC o NSC non ha avuto effetti sulla frazione di cellule T infiltranti il sistema nervoso centrale, Cellule B, e parlamentari totali, così come in quello dei sottoinsiemi di cellule T CD3+/CD4+ (compreso Th1, Lunedi, Tregg, ThGM-CSF, e sottoinsiemi Th17) A 30 dip (Figura S3). Invece, iNSC- o topi EAE trapiantati con NSC hanno mostrato un cambiamento significativo nel profilo di attivazione delle cellule CX3CR1+ con una diminuzione di circa 1,5 volte del tipo CD80+ 1 microglia infiammatoria e aumento parallelo della microglia antinfiammatoria MRC1+ (Figura 1G). Allo stesso modo, Infiltrante nel sistema nervoso centrale (derivato dai monociti) Macrofagi CCR2+ da iNSC- o topi EAE trapiantati con NSC sono stati sottoposti a un significativo cambio di fenotipo con una diminuzione di circa 1,3 volte del tipo CD80+ 1 macrofagi infiammatori e parallelo aumento di circa 1,8 volte dei macrofagi antinfiammatori MRC1+ (Figura 1H). Questo effetto è stato accompagnato da una significativa riduzione dell'espressione del tipo 1 marcatore MP infiammatorio ossido nitrico sintasi inducibile (iOS) da deputati F4/80+ in vivo (Figure 1I e S3).
Abbiamo quindi analizzato i livelli di espressione dei principali professionisti- e geni antinfiammatori in tutto il sistema nervoso centrale. iNSC- e i topi EAE trapiantati con NSC hanno entrambi mostrato livelli significativamente ridotti di interleuchina-1 beta (II1b) nel cervello e nel midollo spinale e aumento dei livelli del recettore del mannosio di tipo C 1 (Mrc1) nel midollo spinale, entrambi a 10 dip (Figura 1J).
Non abbiamo trovato differenze significative nella barriera ematoencefalica (BBB) permeabilità a 30 dpt confrontando iNSC-/NSC-trapiantati con topi EAE di controllo trattati con PBS (Figura S3).
Finalmente, iNSC- e i topi EAE trapiantati con NSC hanno accumulato una perdita assonale significativamente ridotta (Figura 1K) e demielinizzazione (Figura 1L) nel midollo spinale.
Data l'importanza accertata del metabolismo nella regolazione del fenotipo e della funzione delle MP, abbiamo studiato se i trapianti di NSC influenzassero il microambiente metabolico neuroinfiammatorio. A tal fine, abbiamo eseguito un profilo metabolico non mirato dei metaboliti polari mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) di campioni di liquido cerebrospinale e plasma corrispondenti (Tabella S1). I topi EAE di controllo trattati con PBS hanno mostrato un aumento significativo di diversi CSF (ma non al plasma) metaboliti, tra i quali il succinato ha raggiunto solo il picco 45 giorni post-immunizzazione (dpi) (corrispondente a 30 dip; Figura 1M). EAE mice not subjected to surgery also showed a significant increased succinate only in the CSF at 45 dpi (versus healthy control mice), which was not different from the levels of succinate in the CSF PBS-treated control EAE mice (Figura S3).
Whereas we did not detect any significant change in plasma metabolite levels between iNSC/NSC-transplanted and PBS-treated control EAE mice (Tabella S1), we found that the transplantation of iNSCs or NSCs led to a significant drop in CSF succinate at 30 dip (Figura 1M; Tabella S1).
Ulteriore, we found no significant differences in CSF succinate when comparing PBS-treated EAE mice versus EAE mice injected icv with mouse fibroblasts (MFs) as control cells (Figura S3).
Così, iNSCs and NSCs directly injected into the EAE CNS induce a specific phenotype switch of MPs, che è associato alla riduzione dell'immunometabolita succinato solo nel liquido cerebrospinale e al miglioramento della neuroinfiammazione cronica.
Le NSC riducono i livelli di succinato e riprogrammano il metabolismo del tipo 1 Mφ infiammatorio in vitro
Abbiamo quindi studiato i meccanismi molecolari attraverso i quali le iNSC/NSC mostrano attività antinfiammatorie in base al tipo 1 parlamentari, utilizzando un sistema in vitro che riepiloga le interazioni tra MP e iNSC/NSC. Macrofagi ingenui derivati dal midollo osseo (Mφ) sono stati polarizzati in un tipo 1 fenotipo infiammatorio con LPS (MφLPS), come descritto (Tannahill et al., 2013). I MφLPS sono stati quindi co-coltivati con iNSC (MφLPS-iNSC) o NSC (MφLPS-NSC) in un sistema di pozzetti trans che evita i contatti cellula-cellula (Figura 2A). Come controlli sono stati utilizzati Mφ non polarizzati.
Il profilo di espressione genica del microarray ha mostrato cambiamenti trascrizionali significativi in MφLPS con 7,401 geni colpiti (rispetto a Mφ; valore p modificato < 0.1; Figura 2B; Tabella S2) E 51 geni differenzialmente espressi in MφLPS-iNSC o MφLPS-NSC (rispetto a MφLPS; valore p modificato < 0.1; Figure 2B e 2C; Tabella S2). Quest'ultimo insieme di geni è stato arricchito nei processi biologici legati alla regolazione positiva dell'attivazione dei leucociti (ANDARE: 0002696), differenziazione dei leucociti mieloidi (ANDARE: 0002761), e processi del sistema immunitario (ANDARE: 0002376). La validazione indipendente della qRT-PCR di geni proinfiammatori Mφ selezionati ha confermato una significativa sottoregolazione dei livelli di espressione di Il12b, Il15, Il15ra, e Cd69, così come i classici geni infiammatori n.2, fattore di necrosi tumorale (Tnf), e Il1b in MφLPS-iNSC e MφLPS-NSC (rispetto a MφLPS; Figura 2D). Questo effetto è stato accoppiato con la concomitante sovraregolazione dei livelli di espressione dei geni associati a un fenotipo Mφ antinfiammatorio, come l'uronil-2-solfotransferasi (Ust) e antigene delle cellule stromali del midollo osseo 1 (Bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), così come l'arginasi 1 (Arg1) e Mrc1 (rispetto a MφLPS; Figura 2E). Quando le iNSC/NSC sono state co-coltivate con lipopolisaccaride (LPS)-cellule microgliali BV2 del topo attivate come prima, è stata inoltre osservata una significativa riduzione dei livelli di espressione dei geni proinfiammatori Nos2 e Il1b (Figura 2F).
Collegare i profili di espressione genica con gli stati metabolici funzionali, abbiamo valutato il tasso di consumo basale di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di MφLPS come letture del loro acido tricarbossilico (TCA) ciclo e attività glicolitica, rispettivamente. Abbiamo riscontrato una riduzione significativa dell'OCR e un aumento significativo dell'ECAR in MφLPS (rispetto a Mφs). Invece, MφLPS-iNSC e MφLPS-NSC hanno subito un significativo ripristino dei valori OCR ed ECAR (rispetto a MφLPS; Figure 2G e 2H), come osservato nel passaggio di Mφ a un fenotipo antinfiammatorio (O’Neill and Pearce, 2016).
In an effort to clarify the metabolic determinants of these anti-inflammatory effects, we performed an untargeted LC-MS analysis of the extracellular and intracellular small-molecule metabolite content of MφLPS. As expected, LPS stimulation profoundly changed the extracellular and intracellular metabolic milieu of Mφ (MφLPS) (rispetto a Mφ; Table S3). In co-cultures, MφLPS-iNSCs and MφLPS-NSCs both showed significant reduction of extracellular glutamate, GABA, and succinate (rispetto a MφLPS; Figure 2I; Table S3). Inoltre, MφLPS-iNSCs and MφLPS-NSCs also displayed a significant reduction of intracellular succinate and itaconate (rispetto a MφLPS; Figure 2J; Table S3).
Consistent with the reduction of succinate levels, we found that MφLPS-iNSCs and MφLPS-NSCs exhibited significantly reduced levels of HIF-1α, of the upstream protein pyruvate kinase isozyme M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figure 2K), as well as of IL-1β (rispetto a MφLPS; Figure 2L).
Altogether, these in vitro data provide evidence that iNSCs/NSCs reduce the accumulation of both intracellular and extracellular succinate in co-cultures with type 1 inflammatory MPs, reprogramming them toward an OXPHOS anti-inflammatory phenotype.
Succinate Signals via SUCNR1/GPR91 in Mouse and Human NSCs
Given the importance of succinate as immunometabolic signal, we investigated whether succinate released by type 1 pro-inflammatory MPs could regulate the activity of surrounding cells in situ, including that of transplanted iNSCs/NSCs.
We found that transplanted iNSCs/NSCs detected in proximity to meningeal perivascular areas (Figures 3A and 3B ) and F4/80+ MPs (Figure 3C) expressed SUCNR1 in vivo in the CNS. SUCNR1 è stato espresso anche a livello proteico sia sulle iNSC che sulle NSC in vitro, ma non in MF (Figura 3D).
Valutare ulteriormente se SUCNR1 nelle iNSC/NSC fosse funzionalmente attivato dal succinato, abbiamo studiato la sua cascata di segnalazione a valle in vitro. Quando esposto a succinato (Figura 3E; Rubik et al., 2008), 34.2% (±7,4%) delle iNSC e 31.7% (±6,5%) delle NSC hanno mostrato un rilascio di riserve di calcio intracellulare (Figure S4 e 3F). Questa risposta è stata seguita da una significativa sovraregolazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno fosfo-p38 (Figura 3G), indicativo della sua attivazione. Abbiamo confermato l'espressione di SUCNR1 e SUCNR1 anche nelle NSC fetali umane (hNSC) e iNSC umane (hiNSC) (Figure 3H e 3I). Come negli iNSC del mouse, la segnalazione p38 dipendente dal succinato è stata evocata nelle hiNSC, ma non nelle hiNSC pretrattate con l'inibitore selettivo di SUCNR1 4c (Figura 3J).
Così, le iNSC e le NSC murine e umane esprimono SUCNR1 funzionale, che induce una via di segnalazione a valle della sua stimolazione con l'immunometabolita succinato.
La stimolazione di SUCNR1 avvia la secrezione di prostaglandina E2 da parte delle NSC
Per chiarire le conseguenze funzionali della segnalazione di SUCNR1 nelle NSC, abbiamo generato NSC da topi privi di Sucnr1 (Sucnr1−/− NSC) (Rubik et al., 2008; Figura S4). Rispetto alle NSC di controllo, Le NSC Sucnr1−/− hanno mostrato curve di crescita e differenziazione simili in vitro (Figura S4). Tuttavia, quando esposto a succinato in diversi momenti e concentrazioni, Le NSC Sucnr1−/− non hanno mostrato alcuna sovraregolazione di fosfo-p38 (Figura S4). Stimolazione con glutammato o ATP + thapsigargin ha indotto nelle NSC Sucnr1−/− una risposta al calcio simile a quella delle NSC di controllo (Figura S4). Al contrario, succinate treatment did not elicit release of calcium from intracellular stores (Figura S4), which indicated a defective SUCNR1 signaling in Sucnr1−/− NSCs.
We then performed a gene expression profiling microarray following treatment with succinate in control NSCs and Sucnr1−/− NSCs (Table S4). We found that prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs2), the key enzyme in PG biosynthesis encoding the inducible PTGS2, was the most upregulated gene in succinate-stimulated control NSCs (log2 fold change 1.05), but not in succinate-stimulated Sucnr1−/− NSCs (log2 fold change −0.43; Figure 4A). We validated these results on Ptgs2 by qRT-PCR, confirming that its expression levels were significantly upregulated (2.1- to 2.7-fold change) in succinate-stimulated iNSCs and NSCs, whereas they were not in succinate-treated Sucnr1−/− NSCs (Figure 4B).
Given the role of PGE2 as regulator of the immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), we tested its accumulation in tissue culture media from iNSCs, NSC, and Sucnr1−/− NSCs after stimulation with succinate. iNSCs and NSCs, but not Sucnr1−/− NSCs, showed significant (>2.5-fold) increase of their basal release of PGE2 as early as 30 min after succinate. This succinate-induced effect was abolished by pre-treatment with the irreversible PTGS2 blocker SC-58125 (Figure 4C). Come negli iNSC del mouse, exposure of hiNSCs to succinate elicited a significant increase of PGE2 concentrations in tissue culture media, whereas again pre-treatment with either SC-58125 or 4c prevented its release (Figure 4D).
Estendere ulteriormente la rilevanza di questi risultati alle co-colture tra NSC e MφLPS, abbiamo analizzato i livelli di PGE2 nei terreni di coltura tissutale. Abbiamo scoperto che le MφLPS-NSC accumulavano livelli più elevati di PGE2 rispetto alle MφLPS, mentre il pretrattamento delle NSC in co-coltura con SC-58125 ha ridotto significativamente i livelli di PGE2 (Figura 4E). Il pretrattamento delle NSC con SC-58125 è stato anche associato a un aumento significativo dell'espressione di Il1b in MφLPS (Figura 4F) e con una riduzione dei valori OCR indicativi di un fenotipo proinfiammatorio (Figura 4G). Tuttavia, abbiamo notato che le NSC pretrattate con SC-58125 conservavano alcuni effetti antinfiammatori residui su MφLPS rispetto alle NSC Sucnr1−/− (Figura 4F). Al contrario, La perdita di funzione di Sucnr1 nelle NSC ha completamente abolito i loro effetti antinfiammatori su MφLPS (Figure 4F e 4G). We also show that the observed PGE2-dependent anti-inflammatory ability of NSCs is conserved and relevant for human NSCs.
Come tale, hiNSCs induced a significant reduction of Il1b expression in MφLPS in co-cultures (Figure 4H), which was coupled with a restoration of OCR values (Figure 4I) and increased PGE2 levels in tissue culture media (Figure 4J). These effects were completely suppressed by pre-treatment of hiNSCs with the selective SUCNR1 inhibitor 4c (Figures 4H–4J).
Così, the activation of SUCNR1 signaling pathway in mouse and human NSCs triggers the release of PGE2 leading to anti-inflammatory effects on type 1 parlamentari.
Tuttavia, inhibition experiments targeting either PTGS2 or SUCNR1 anticipate that additional SUCNR1-dependent—PGE2-independent—mechanisms are likely to play a key role in the anti-inflammatory effects of NSCs.
La stimolazione di SUCNR1 innesca l'assorbimento del succinato da parte delle NSC
Lo hanno rivelato gli array di espressione genica delle NSC stimolate con succinato, oltre a Ptgs2, NaCT/Slc13a5 era tra i geni più sovraregolati nel wild-type (PESO) NSC (log2 piega cambiamento = 0.49), ma non nelle NSC Sucnr1−/− (variazione di piega log2 = −0,12). SLC13A5 è un co-trasportatore dicarbossilato noto per essere coinvolto nel trasporto del succinato (Srisawang et al., 2007). Data la consistente deplezione di succinato riscontrata sia in vivo che nel liquido cerebrospinale delle iNSC- o topi EAE trapiantati con NSC e in vitro in co-colture con MφLPS, abbiamo ipotizzato che le iNSC/NSC attivassero SLC13A5 per eliminare il succinato.
Abbiamo scoperto che l'espressione di SLC13A5, così come del co-trasportatore dicarbossilato ad alta affinità SLC13A3, erano significativamente aumentati nelle iNSC e nelle NSC, ma non nelle NSC Sucnr1−/−, dopo stimolazione succinata (Figure 5A). Allo stesso modo, hiNSCs exposed to succinate upregulated the protein expression levels of both these SLC13 co-transporters in vitro (Figure 5B).
We next investigated the role of these co-transporters by measuring succinate uptake in iNSCs and NSCs. We found that both iNSCs and NSCs significantly accumulated [14C]-succinate (Figure 5C) while reducing the amount of extracellular [14C]-succinate in tissue culture media (Figure 5D). Sucnr1−/− NSCs neither accumulated [14C]-succinate intracellularly nor did they deplete it extracellularly (Figures 5C and 5D). È interessante notare, Sucnr1−/− NSC, which we have shown to have no effects on Il1b expression in MφLPS (Figura 4F), failed to reduce the extracellular succinate levels in co-cultures with MφLPS (Figure 5E). As further proof of the importance of succinate depletion in modulating the phenotype of type 1 pro-inflammatory MPs, mostriamo quel trattamento con ricombinante attivo (R)La subunità A del complesso SDH è in grado di ridurre significativamente l'espressione di Il1b in MφLPS (Figura S5).
Così, La segnalazione di SUCNR1 nelle NSC stimola l'assorbimento dell'immunometabolita succinato, esaurendo così il pool extracellulare disponibile che sostiene l'attivazione autocrina e paracrina del tipo 1 parlamentari.
Il trapianto di NSC con perdita di funzione Sucnr1 mostra una ridotta capacità di migliorare la neuroinfiammazione cronica in vivo
Confermare il ruolo dell'asse succinato-SUCNR1 nel mediare la risposta degli innesti di NSC al succinato in vivo, abbiamo valutato gli effetti del trapianto icv di NSC Sucnr1−/− nei topi con EAE cronica.
A 30 dip, Le NSC Sucnr1−/− sono sopravvissute, distribuito, and integrated within the EAE brain and spinal cord with no significant differences compared to control NSCs (Figure S6). Tuttavia, the transplantation of Sucnr1−/− NSCs induced only a slight recovery of EAE behavioral deficits versus PBS-treated control EAE mice (EAE score—Sucnr1−/− NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), which was significantly less pronounced (50% of the effect) than that observed in EAE mice transplanted with control NSCs (EAE score—NSCs: 2.1 ± 0.3; Figure 6A).
Ex vivo flow-cytometry-based analysis of the composition of CNS inflammatory infiltrates showed that transplantation of EAE mice with Sucnr1−/− NSCs failed to shift the proportions of type 1 MP infiammatorie e antinfiammatorie, tra cui microglia CX3CR1+ e macrofagi infiltranti derivati da monociti CCR2+, in contrasto con gli effetti delle NSC di controllo (Figure 6B e 6C). La patologia tissutale post mortem ha ulteriormente confermato i ridotti effetti di protezione dei tessuti degli innesti di NSC Sucnr1−/− (Figure 6D e 6E).
Abbiamo quindi studiato i livelli di PGE2 e succinato in campioni di liquido cerebrospinale e plasma corrispondenti di topi EAE di controllo trapiantati con NSC e trattati con PBS. Abbiamo scoperto che sia le NSC Sucnr1−/− che le NSC di controllo non sono riuscite a indurre cambiamenti significativi nei livelli di PGE2 nel liquido cerebrospinale. La PGE2 plasmatica è aumentata significativamente solo nei topi EAE (rispetto ai controlli sani), senza alcun effetto del trattamento osservato (Figura 6F). È importante sottolineare che, mentre il trapianto di NSC di controllo ha ridotto il succinato del liquido cerebrospinale (HC: 5.524 × 107 au. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 au. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 au. ± 0.44), Gli innesti di NSC Sucnr1−/− non hanno mostrato effetti (Sucnr1−/− NSC: 10.40 × 107 au. ± 2.59; Figura 6G).
Questi dati confermano la necessità di una via di segnalazione SUCNR1 funzionale nella regolazione degli effetti antinfiammatori e neuroprotettivi dei trapianti di NSC in vivo e sottolineano l'importanza dello scavenging del succinato come meccanismo d'azione antinfiammatorio predominante delle NSC.
Discussione
Esiste un bisogno clinico insoddisfatto di sviluppare approcci cellulari e molecolari per colpire i fattori chiave della fisiopatologia delle condizioni neuroinfiammatorie croniche che includono forme progressive di SM (Volpe et al., 2016). In linea di principio, le cellule staminali possiedono un potenziale terapeutico distinto da quello delle piccole molecole e dei prodotti biologici e si estendono ben oltre l’ambito della medicina rigenerativa classica. In parte farmaco e in parte dispositivo, le cellule staminali potrebbero funzionare come agenti biologici modificanti la malattia (DMA) che percepiscono segnali diversi, migrano in siti specifici del corpo, integrare gli input per prendere decisioni, ed eseguire comportamenti di risposta complessi nel contesto di uno specifico microambiente tissutale (Fischbach et al., 2013). Tutti questi attributi potrebbero essere sfruttati per trattare diversi processi patologici, compresa l’infiammazione persistente guidata da MP e la degenerazione dei tessuti che si verificano nella SM progressiva.
Qui, abbiamo usato accessibile, autologo, e iNSC stabilmente espandibili (Thier et al., 2012), così come le NSC somatiche, studiare gli effetti del trapianto di cellule staminali cerebrali in un modello murino di neuroinfiammazione cronica, che imita la cascata infiammatoria osservata nella SM progressiva.
We found that the transplantation of iNSCs into the CSF circulation of EAE mice promotes equivalent outcomes to those previously observed in mice transplanted with somatic NSCs (Pluchino et al., 2003). Transplanted iNSCs or NSCs induced significant clinical amelioration, as well as reduced axonal and myelin damage, with no significant reduction of BBB permeability at 30 dip. Further studies will help clarify whether changes of BBB permeability or recruitment of inflammatory monocytes to the CNS occur immediately following the transplantation of iNSCs/NSCs. Whether such an effect is likely to change the main clinical outcomes of diseases with high prevalence of CNS infiltration by inflammatory cells, such as EAE/MS, is hard to anticipate.
Invece, abbiamo scoperto che il nostro paradigma di trapianto era associato a uno specifico cambiamento nel profilo di attivazione sia delle cellule microgliali CX3CR1+ che dei macrofagi infiltranti derivati da monociti CCR2+ con una diminuzione del tipo CD80+ 1 MP infiammatorie e aumento parallelo delle MP antinfiammatorie MRC1+. Le iNSC/NSC trapiantate si sono distribuite e sono sopravvissute nel sistema nervoso centrale dei topi EAE, mentre si accumula preferenzialmente a livello delle aree perivascolari meningee in contrapposizione alle MP endogene. Altogether, questi risultati implicherebbero la presenza di alcuni meccanismi ancora sconosciuti di accoppiamento intercellulare tra cellule staminali innestate e MP infiammatorie. Resta da chiarire se questa comunicazione iNSC/NSC-MP in vivo avvenga solo nelle nicchie perivascolari o anche a livello di altre strutture emergenti simili a sensori immunitari del cervello che includono il plesso coroideo. (Ge et al., 2017).
Abbiamo quindi studiato i meccanismi immunologici sottostanti che guidano gli effetti benefici delle NSC sulle MP durante la neuroinfiammazione cronica. L'analisi non mirata di piccole molecole di campioni di liquido cerebrospinale e plasma abbinati ha rivelato profondi cambiamenti metabolici nel liquido cerebrospinale dei topi EAE, con differenze tra la fase precoce e quella tardiva della malattia.
Carnitina, leucina + isoleucina, citrullina, allantoina, ornitina, e l'acido urico erano tutti significativamente aumentati nei topi EAE di controllo trattati con PBS al culmine della malattia. I nostri risultati sono coerenti con le prove pubblicate che dimostrano che la leucina, così come l'acido urico e il suo sottoprodotto allantoina, sono tutti aumentati nel liquido cerebrospinale dei soggetti con SM (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Mentre nella SM non è stato segnalato un aumento della carnitina nel liquido cerebrospinale, aumenti importanti sono stati descritti in condizioni infiammatorie del sistema nervoso centrale non correlate alla SM, come l'encefalite (Wikoff et al., 2008) e meningite (Shinawi et al., 1998).
Al contrario, solo il succinato ha mostrato un ritardo (i.e., 45 dpi) aumento del liquido cerebrospinale dei topi EAE di controllo trattati con PBS. Il succinato sta diventando un prezioso biomarcatore in vivo del disagio metabolico e dell'attività infiammatoria (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills e O'Neill, 2014). È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che il succinato era significativamente diminuito nel liquido cerebrospinale dei topi trapiantati con iNSC/NSC. The reduction of CSF succinate following iNSC or NSC transplantation was of interest and might have a prominent role in interfering with chronic neuroinflammation.
Succinate released from type 1 inflammatory MPs is a key inflammatory signal that interacts with its specific G-protein-coupled receptor SUCNR1. SUCNR1 acts as an early detector of metabolic stress in several physiological and pathological conditions, including renin-induced hypertension, ischemia/reperfusion injury, infiammazione, platelet aggregation, and retinal angiogenesis (de Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). In particolare, we found that the expression of SUCNR1 is required for the therapeutic effects of transplanted NSCs in vivo.
Succinate-mediated activation of SUCNR1 on rodent and human iNSCs and NSCs activates calcium signaling and mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation in vitro, thus eliciting the acquisition of a concerted anti-inflammatory phenotype in NSCs. Da un lato, SUCNR1 activated the secretion of PGE2, a well-established pleiotropic immune modulator, whose function targets multiple cell types within the inflamed microenvironment, including MPs (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). D'altra parte, succinate-SUCNR1 signaling in iNSCs and NSCs led to the upregulation of two members of the SLC13 family of co-transporters (i.e., SLC13A3 and SLC13A5) and uptake of extracellular succinate.
In vivo, we demonstrate effective scavenging of extracellular local succinate by NSCs injected in EAE mice through the CSF circulation, which is predominant, compared to the secretion of PGE2. The loss of SUCNR1-dependent signaling in transplanted NSCs led to significant reduction in their anti-inflammatory and neuroprotective effects, mentre gli innesti di NSC Sucnr1−/− non hanno mostrato differenze di sopravvivenza, distribuzione, e differenziazione rispetto alle NSC di controllo.
Ipotizziamo quindi che il succinato extracellulare sia secreto per tipo 1 Le MP infiammatorie avviano un comportamento di scavenging che le NSC trapiantate si adattano in risposta alla maggiore disponibilità di substrato (Srisawang et al., 2007). Questo nuovo accoppiamento metabolico intercellulare si adatta bene alla letteratura disponibile che lo dimostra, all’interno di specifici microambienti, le cellule competono per i nutrienti disponibili, influenzando le reciproche funzioni e il destino (Pearce e Pearce, 2013).
Prevediamo che la deplezione dei succinati da parte delle iNSC e delle NSC che esprimono SUCNR1 potrebbe svolgere un ruolo cruciale nel ridurre la disponibilità di un segnale metabolico chiave in contesti infiammatori in cui le interazioni tra cellule staminali trapiantate e cellule immunitarie ospiti diventano complementari (Pluchino and Cossetti, 2013). Più in generale, i nostri risultati sono in linea con la provocazione, eppure ancora emergente, concetto di NSC come guardiani ancestrali del cervello in grado di esercitare diversi effetti complementari immunomodulatori e trofici tissutali (Martino e Pluchino, 2007).
Sono necessari ulteriori studi per caratterizzare ulteriormente la funzione dell'asse succinato-SUCNR1 nelle interazioni neuro-immuni, fornire ulteriori approfondimenti sul ruolo critico del metabolismo cellulare per le cellule staminali/progenitrici neurali (Knobloch e Jessberger, 2017), e sviluppare interventi farmacologici complementari mirati a questo percorso nel cervello cronicamente infiammato.
Insomma, mostriamo qui che le NSC percepiscono il succinato extracellulare che si accumula nel sistema nervoso cronicamente infiammato per migliorare la neuroinfiammazione attraverso meccanismi dipendenti da succinato-SUCNR1. Our work identifies a novel anti-inflammatory mechanism that underpins the regenerative potential of somatic and directly induced NSCs, thus paving the way for a new era of personalized stem cell medicines for chronic inflammatory and degenerative neurological diseases.
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