巨噬细胞衍生的细胞外琥珀酸盐授权神经干细胞抑制慢性神经炎症

 

亮点
•来自体组织的神经干细胞或直接重编程同样可以抑制神经炎症
•细胞外琥珀酸激活 NSC 上的 SUCNR1/GPR91
•激活的 NSC 分泌 PGE2 并清除琥珀酸, 因此重新编程类型 1 国会议员
• Sucnr1 突变型 NSC 移植后抗炎活性降低
概括
神经干细胞 (国家安全委员会) 移植可以影响免疫反应并抑制中枢神经系统的炎症. 代谢物, 例如琥珀酸, 调节免疫细胞的表型和功能, 但神经干细胞是否以及如何被此类免疫代谢物激活以控制免疫反应性和炎症反应尚不清楚. 这里, 我们发现，移植的体细胞和直接诱导的 NSC 通过降低脑脊液中的琥珀酸水平来改善慢性中枢神经系统炎症, 从而减少单核吞噬细胞 (国会议员) 浸润和继发性中枢神经系统损伤. 炎症议员释放琥珀酸, 激活琥珀酸受体 1 (苏克NR1)/NSC 上的 GPR91, 导致它们分泌前列腺素 E2 并清除细胞外琥珀酸，从而产生抗炎作用. 因此, 我们的工作揭示了琥珀酸-SUCNR1 轴在体细胞和直接诱导的 NSC 中的意外作用, 它控制干细胞对不同类型释放的炎症代谢信号的反应 1 慢性发炎大脑中的 MP.

介绍
干细胞生物学的进展带来了非造血干细胞药物可以改善中枢神经系统疾病的希望 (马蒂诺和普卢基诺, 2006). 我们提供了令人信服的证据证明体细胞神经干细胞移植 (神经干细胞) 改善炎症性中枢神经系统疾病动物模型的临床病理特征. 超越受损中枢神经系统细胞的结构替代, 我们的工作表明，移植的 NSC 参与复杂的干细胞移植物与宿主的通讯程序, 总体上导致适应性和先天免疫反应的营养支持和调节 (巴库拉普等人。, 2009, 巴库拉普等人。, 2016, 普卢基诺和科塞蒂, 2013, 普卢奇诺等人。, 2005, 普卢奇诺等人。, 2009乙). 具体来说, NSC 移植减轻损伤部位的炎症负担 (普卢奇诺等人。, 2005, 普卢奇诺等人。, 2009一个), 减少类型数量 1 炎性单核吞噬细胞 (国会议员) (库西马诺等人。, 2012), 并通过尚不清楚的机制促进受伤的中枢神经系统的愈合.

然而, 实验性 NSC 疗法的临床转化仍然受到人类 NSC 来源的限制 (人神经干细胞) 派生出 (安德森等人。, 2017), 同种异体 hNSC 系的内在免疫原性 (拉莫斯-祖尼加等人。, 2012, 赖斯等人。, 2013), 以及所谓的“预期临床细胞批次”的稳定性 (安德森等人。, 2017, 赖特等人。, 2006). 自体且可稳定扩增的直接诱导 NSC (神经干细胞) 来自患者真皮成纤维细胞的细胞正在成为 NSC 疗法的有效替代品 (卢等人。, 2013, 迈耶等人。, 2015, 蒂尔等人。, 2012). 直接重编程为 iNSC，避免了通过多能状态的费力进展以及随后分化为诱导多能干细胞描述的所需谱系的过程 (诱导多能干细胞) 技术 (迈耶等人。, 2015, 蒂尔等人。, 2012). 所以, 从体细胞中制备稳定可扩增的 iNSC 是获得自体脑干细胞用于下游临床应用的最可行的方法 (沃尔斯多弗等人。, 2013). 然而, 直接重编程 iNSC 治疗炎症性中枢神经系统疾病的功效尚未得到测试.

多发性硬化症的进展形式 (多发性硬化症), 慢性中枢神经系统炎症是通过 MP 的广泛激活来维持的，这些 MP 包括中枢神经系统驻留的小胶质细胞和单核细胞衍生的浸润性巨噬细胞 (马卢奇等人。, 2015). MPs 存在于灰质病变中, 接近退化的神经突和神经元细胞体 (彼得森等人。, 2001), 以及白质病变, 激活的小胶质细胞的外缘与慢性组织损伤有关 (布拉莫等人。, 2010, 普里尼亚斯等人。, 2001). 正常白质区域也具有 MP 积累的特征, 这会导致小胶质细胞结节的形成，从而驱动疾病病理学，而与伴随的 T 细胞激活无关 (莫尔等人。, 2011). 动物疾病模型中的证据也支持慢性 MP 驱动的炎症对进行性多发性硬化症的有害作用, 其总体负担与神经元功能受损相关 (普朗什等人。, 2017), 脑萎缩 (寡妇是al。, 2015), 并减少再生反应 (江等人。, 2014).

促炎刺激激活 MPs 导致代谢转变为糖酵解并减少氧化磷酸化 (氧化磷) (凯利和奥尼尔, 2015). 最近的证据表明, 在这种代谢重新布线中, 类型 1 炎性 MP 积聚琥珀酸, 具有重要的病理生理学意义 (坦纳希尔等人。, 2013). 细胞内琥珀酸抑制脯氨酰羟化酶的活性 (博士生), 从而稳定缺氧反应元件 (高强度IF)-1α并诱导白细胞介素的转录 (伊尔)-1乙 (坦纳希尔等人。, 2013). 此外, 琥珀酸脱氢酶氧化琥珀酸 (SDH) 将线粒体从 ATP 合成重新调整为活性氧 (活性氧) 作为额外的促炎信号的产生 (米尔斯等人。, 2016). 类型 1 炎症 MP 也会在细胞外释放琥珀酸并上调其同源琥珀酸受体 1 (苏克NR1), G蛋白偶联受体 (也称为 GPR91), 作为自分泌和旁分泌传感器来增强 IL-1β 的产生 (利特尔伍德-埃文斯等人。, 2016).

像这样, 代谢正在成为调节巨噬细胞激活的重要治疗靶点 (凯利和奥尼尔, 2015) 和小胶质细胞 (奥里韦拉等人。, 2016), 和琥珀酸相关途径对急性和慢性炎症性疾病具有关键的免疫调节功能 (柳等人。, 2003, 坦纳希尔等人。, 2015).

鉴于 NSC 已确定的免疫调节特性 (普卢基诺和科塞蒂, 2013), 我们假设 NSC 可能通过调节 MP 代谢来减少继发性 CNS 损伤，从而发挥其对慢性神经炎症的治疗作用.

在这项工作中, 我们研究了支持体细胞能力的分子机制，并直接诱导 NSC 抵消类型的代谢变化 1 体内和体外炎症 MP. 我们发现，移植的 iNSC 和 NSC 在改善实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的慢性神经炎症方面具有相同的功能 (EAE). 移植的 iNSC/NSC 将中枢神经系统驻留小胶质细胞和单核细胞衍生的浸润巨噬细胞的激活谱转变为抗炎表型, 以及降低脑脊液中免疫代谢物琥珀酸盐的水平 (脑脊液). iNSC/NSC 还减少按类型释放的细胞外琥珀酸 1 炎症 MP 在体外将其代谢重新编程为 OXPHOS. 机械地, 我们表明琥珀酸按类型分泌 1 MP 在 iNSC/NSC 中引发下游 SUCNR1 信号级联, 这使得它们具有抗炎活性. iNSCs/NSCs 的这种琥珀酸盐​​许可的抗炎功能是由前列腺素的分泌介导的 (PG) E2, 以及通过大量清除细胞外琥珀酸. EAE 移植后 NSCs 中 Sucnr1 功能的丧失导致体外和体内抗炎活性显着降低.

我们的研究揭示了琥珀酸-SUCNR1 轴，阐明了 NSC 如何响应炎症代谢信号以抑制类型的激活 1 MPs在慢性神经炎症中的作用.

结果
NSC 移植可改善慢性神经炎症，并减少脑脊液中的免疫代谢物琥珀酸盐
我们首先评估了脑室内的影响 (智能车) 疾病高峰期移植 (PD) MOG35-55 诱导的慢性 EAE 小鼠中的 iNSC 或 NSC 的研究，并将其与 PBS 处理的对照 EAE 小鼠进行比较. 移植前, iNSC 和 NSC 得到扩展, 特征化的 (图S1), 并标记有法尼基化 (f)体外荧光蛋白. 在 30 移植后天数 (dpt), iNSC 和 NSC 移植存活, 分布式, 并整合到 EAE 大脑和脊髓中 (图S2). 仅回收了少数 fGFP+ 细胞 (神经干细胞: 2.1% ± 0.9%; 神经干细胞: 1.7% ± 0.1%) 正在激增 (图1A) 或表达神经元 (图1B), 星形胶质细胞 (图1C), 或少突胶质细胞 (图1D) 谱系标记 (图S2). 大多数 (～75%) 移植后存活的 iNSC 被发现不表达任何测试的神经谱系标记物，并且定位于靠近 F4/80+ 内源性 MP 的脑膜血管周围生态位样区域 (图1E), 正如在体细胞 NSC 移植物中所观察到的 (库西马诺等人。, 2012, 普卢奇诺等人。, 2003). iNSCs 移植诱导了显着且持久的 (最多 90 dpt) 改善EAE分数, 从开始 15 到 20 继续前进 (图1F​​和S2). 计算机辅助自动步态分析也证实了功能恢复 (图S2). 全面的, icv 移植的 iNSC 是安全的，并且可以导致行为和病理恢复.

然后，我们通过 iNSC 中的离体流式细胞术分析了 CNS 炎症浸润的组成- 和 NSC 移植与 PBS 处理的对照 EAE 小鼠相比. iNSCs或NSCs的移植对CNS浸润T细胞的比例没有影响, B细胞, 和国会议员总数, 以及 CD3+/CD4+ T 细胞亚群 (包括Th1, 周一, 调节性T细胞, ThGM集落刺激因子, 和 Th17 亚群) 在 30 dpt (图S3). 反而, 神经干细胞- 或 NSC 移植的 EAE 小鼠显示 CX3CR1+ 细胞的激活谱发生显着变化，CD80+ 类型减少约 1.5 倍 1 炎症小胶质细胞和 MRC1+ 抗炎小胶质细胞的平行增加 (图1G). 同样地, 中枢神经系统浸润 (单核细胞来源) 来自 iNSC 的 CCR2+ 巨噬细胞- 或 NSC 移植的 EAE 小鼠经历了显着的表型转变，CD80+ 类型减少约 1.3 倍 1 炎症巨噬细胞和 MRC1+ 抗炎巨噬细胞平行增加约 1.8 倍 (图1H). 这种效应伴随着该类型表达的显着减少 1 炎症性 MP 标记物诱导型一氧化氮合酶 (诱导型一氧化氮合酶) 体内 F4/80+ MP (图1I和S3).

然后我们分析了主要pro的表达水平- 以及整个中枢神经系统的抗炎基因. 神经干细胞- 和 NSC 移植的 EAE 小鼠均表现出白细胞介素 1 β 水平显着降低 (Ⅱ1b) 大脑和脊髓中的甘露糖受体 C 型水平增加 1 (先生1) 在脊髓中, 都在 10 dpt (图1J).

我们发现血脑屏障没有显着差异 (血脑屏障) 渗透率在 30 dpt 将 iNSC-/NSC 移植小鼠与 PBS 处理的对照 EAE 小鼠进行比较 (图S3).

最后, 神经干细胞- 和 NSC 移植的 EAE 小鼠积累的轴突损失显着减少 (图1K) 和脱髓鞘 (图1L) 在脊髓中.

鉴于代谢在调节 MP 表型和功能中的重要性已被证实, 我们研究了 NSC 移植是否影响神经炎症代谢微环境. 为此, 我们通过液相色谱与质谱联用对极性代谢物进行了非靶向代谢分析 (液质联用) 匹配的脑脊液和血浆样本 (表S1). PBS 处理的对照 EAE 小鼠显示数个 CSF 显着增加 (但不是等离子) 代谢物, 其中琥珀酸仅在 45 免疫接种后天数 (分辨率) (对应于 30 dpt; 图1M). 未接受手术的 EAE 小鼠也仅在脑脊液中显示出显着增加的琥珀酸盐。 45 分辨率 (与健康对照小鼠相比), 这与 CSF PBS 处理的对照 EAE 小鼠中的琥珀酸水平没有差异 (图S3).

然而我们没有检测到 iNSC/NSC 移植小鼠和 PBS 处理对照 EAE 小鼠之间血浆代谢物水平有任何显着变化 (表S1), 我们发现iNSCs或NSCs的移植导致脑脊液琥珀酸显着下降 30 dpt (图1M; 表S1).

更远, 当比较 PBS 处理的 EAE 小鼠与静脉注射小鼠成纤维细胞的 EAE 小鼠时，我们发现脑脊液琥珀酸没有显着差异 (MF) 作为对照细胞 (图S3).

因此, iNSCs 和 NSCs 直接注入 EAE CNS 诱导 MP 的特定表型转换, 仅与脑脊液中免疫代谢物琥珀酸盐的减少和慢性神经炎症的改善有关.

NSC 降低琥珀酸水平并重新编程类型的代谢 1 体外炎症 Mφ
然后我们研究了 iNSCs/NSCs 在类型上表现出抗炎活性的分子机制 1 国会议员, 使用体外系统来概括 MP 和 iNSC/NSC 之间的相互作用. 幼稚骨髓来源的巨噬细胞 (Mφ) 被极化成一种类型 1 LPS 炎症表型 (脂多糖), 如上所述 (坦纳希尔等人。, 2013). 然后将 MφLPS 与 iNSC 共培养 (MφLPS-iNSCs) 或 NSC (MφLPS-NSCs) 在避免细胞与细胞接触的跨孔系统中 (图2A). 使用非偏振 Mφ 作为对照.

微阵列基因表达谱显示 MφLPS 中显着的转录变化 7,401 受影响的基因 (与 Mφ; 调整后的p值 < 0.1; 图2B; 表S2) 和 51 MφLPS-iNSC 或 MφLPS-NSC 中差异表达的基因 (与 MφLPS; 调整后的p值 < 0.1; 图2B和2C; 表S2). 后一组基因富含与白细胞活化的正调节相关的生物过程 (去: 0002696), 髓系白细胞分化 (去: 0002761), 和免疫系统过程 (去: 0002376). 对选定的 Mφ 促炎基因的独立 qRT-PCR 验证证实了 Il12b 表达水平的显着下调, 伊尔15, 伊尔15ra, 和镉69, 以及经典炎症基因 Nos2, 肿瘤坏死因子 (肿瘤坏死因子), MφLPS-iNSC 和 MφLPS-NSC 中的 Il1b (与 MφLPS; 图2D). 这种效应与抗炎 Mφ 表型相关基因表达水平的上调相结合, 例如糖醛酰-2-磺基转移酶 (乌斯季) 和骨髓基质细胞抗原 1 (乙肝1) (沙巴尼等人。, 2016, 马丁内斯等人。, 2015), 以及精氨酸酶 1 (精氨酸1) 和 Mrc1 (与 MφLPS; 图2E). iNSCs/NSCs与脂多糖共培养时 (脂多糖)-像以前一样激活小鼠 BV2 小胶质细胞, 还观察到促炎基因 Nos2 和 Il1b 的表达水平显着降低 (图2F).

将基因表达谱与功能代谢状态联系起来, 我们评估了基础耗氧率 (光学字符识别) 和细胞外酸化率 (埃卡) MφLPS 作为其三羧酸的读数 (三氯乙酸) 循环和糖酵解活动, 分别. 我们发现 MφLPS 中 OCR 显着降低，ECAR 显着增加 (与 Mφs). 反而, MφLPS-iNSC 和 MφLPS-NSC 的 OCR 和 ECAR 值均得到显着恢复 (与 MφLPS; 图2G和2H), 正如在 Mφ 转变为抗炎表型中所观察到的 (奥尼尔和皮尔斯, 2016).

努力阐明这些抗炎作用的代谢决定因素, 我们对 MφLPS 的细胞外和细胞内小分子代谢物含量进行了非靶向 LC-MS 分析. 正如预期的那样, LPS刺激深刻改变了Mφ的细胞外和细胞内代谢环境 (脂多糖) (与 Mφ; 表S3). 在共培养中, MφLPS-iNSC 和 MφLPS-NSC 均显示细胞外谷氨酸显着减少, 氨基丁酸, 和琥珀酸盐 (与 MφLPS; 图2I; 表S3). 此外, MφLPS-iNSC 和 MφLPS-NSC 还表现出细胞内琥珀酸和衣康酸的显着减少 (与 MφLPS; 图2J; 表S3).

与琥珀酸水平的降低一致, 我们发现 MφLPS-iNSC 和 MφLPS-NSC 的 HIF-1α 水平显着降低, 上游蛋白丙酮酸激酶同工酶 M2 (PKM2) (帕尔森-麦克德莫特等人。, 2015; 图2K), 以及 IL-1β (与 MφLPS; 图2L).

共, 这些体外数据提供的证据表明，iNSCs/NSCs 在与类型共培养物中减少了细胞内和细胞外琥珀酸的积累 1 炎症MP, 将它们重新编程为 OXPHOS 抗炎表型.

小鼠和人类 NSC 中通过 SUCNR1/GPR91 发出的琥珀酸信号
鉴于琥珀酸作为免疫代谢信号的重要性, 我们调查了琥珀酸是否按类型释放 1 促炎 MPs 可以原位调节周围细胞的活性, 包括移植的 iNSC/NSC.

我们发现移植的 iNSC/NSC 在脑膜血管周围区域附近检测到 (图3A和3B ) 和 F4/80+ MP (图3C) 在 CNS 体内表达 SUCNR1. SUCNR1 也在体外 iNSC 和 NSC 上以蛋白质水平表达, 但不在 MF 中 (图3D).

进一步评估 iNSCs/NSCs 中的 SUCNR1 是否被琥珀酸功能激活, 我们在体外研究了其下游信号级联. 当接触琥珀酸时 (图3E; 鲁比克等人。, 2008), 34.2% (±7.4%) iNSC 和 31.7% (±6.5%) NSCs 显示细胞内钙储备的释放 (图S4和3F). 这种反应之后，磷酸化 p38 丝裂原激活蛋白激酶显着上调 (图3G), 表明其激活. 我们证实了 SUCNR1 和 SUCNR1 在人类胎儿 NSC 中的表达 (人神经干细胞) 和人类 iNSC (神经干细胞) (图3H和3I). 与小鼠 iNSC 一样, hiNSC 中诱发琥珀酸依赖性 p38 信号传导, 但在用选择性 SUCNR1 抑制剂 4c 预处理的 hiNSC 中则不然 (图3J).

因此, 小鼠和人类 iNSC 和 NSC 表达功能性 SUCNR1, 它在免疫代谢物琥珀酸的刺激下诱导信号通路下游.

SUCNR1 刺激启动 NSC 分泌前列腺素 E2
阐明 NSC 中 SUCNR1 信号传导的功能后果, 我们从缺乏 Sucnr1 的小鼠中生成 NSC (Sucnr1−/− NSC) (鲁比克等人。, 2008; 图S4). 与对照 NSC 相比, Sucnr1−/− NSCs 在体外表现出相似的生长曲线和分化 (图S4). 然而, 当在不同时间点和浓度暴露于琥珀酸盐时, Sucnr1−/− NSCs 未表现出磷酸-p38 的上调 (图S4). 谷氨酸或 ATP 刺激 + 毒胡萝卜素在 Sucnr1−/− NSC 中诱导与对照 NSC 相似的钙反应 (图S4). 相反, 琥珀酸盐处理不会引起细胞内储存的钙释放 (图S4), 这表明 Sucnr1−/− NSC 中的 SUCNR1 信号传导存在缺陷.

然后，我们在对照 NSC 和 Sucnr1−/− NSC 中用琥珀酸盐处理后进行了基因表达谱分析微阵列 (表S4). 我们发现前列腺素内过氧化物合酶 2 (目标2), 编码诱导型 PTGS2 的 PG 生物合成关键酶, 是琥珀酸刺激的对照 NSC 中上调最多的基因 (log2 倍数变化 1.05), 但在琥珀酸刺激的 Sucnr1−/− NSC 中则不然 (log2 倍数变化 -0.43; 图4A). 我们通过 qRT-PCR 在 Ptgs2 上验证了这些结果, 证实其表达水平显着上调 (2.1- 2.7倍的变化) 在琥珀酸刺激的 iNSC 和 NSC 中, 而它们不在琥珀酸处理的 Sucnr1−/− NSC 中 (图4B).

鉴于 PGE2 作为间充质干细胞免疫抑制作用调节剂的作用 (间充质干细胞) (瓦桑丹等人。, 2016, 亚涅斯等人。, 2010), 我们测试了它在 iNSC 组织培养基中的积累, 神经干细胞, 和 Sucnr1−/− NSCs 琥珀酸刺激后. iNSC 和 NSC, 但不是 Sucnr1−/− NSC, 表现出显着的 (>2.5-折叠) 早在 30 琥珀酸后分钟. 通过不可逆 PTGS2 阻断剂 SC-58125 预处理，消除了琥珀酸诱导的作用 (图4C). 与小鼠 iNSC 一样, hiNSC 暴露于琥珀酸盐引起组织培养基中 PGE2 浓度显着增加, 而用 SC-58125 或 4c 进行预处理再次阻止其释放 (图4D).

进一步扩展这些发现与 NSC 和 MφLPS 之间共培养的相关性, 我们分析了组织培养基中 PGE2 的水平. 我们发现与 MφLPS 相比，MφLPS-NSC 积累了更高水平的 PGE2, 而用 SC-58125 预处理共培养的 NSC 显着降低了 PGE2 水平 (图4E). SC-58125 对 NSC 的预处理还伴随着 MφLPS 中 Il1b 表达的显着增加 (图4F) OCR 值降低表明促炎表型 (图4G). 然而, 我们注意到，与 Sucnr1−/− NSC 相比，用 SC-58125 预处理的 NSC 对 MφLPS 保留了一些残留的抗炎作用 (图4F). 相反, NSCs 中 Sucnr1 功能丧失完全消除了其对 MφLPS 的抗炎作用 (图4F和4G). 我们还表明，观察到的 NSC 依赖 PGE2 的抗炎能力是保守的，并且与人类 NSC 相关.

像这样, hiNSC 在共培养物中诱导 MφLPS 中 Il1b 表达显着减少 (图4H), 与 OCR 值的恢复相结合 (图4I) 组织培养基中 PGE2 水平增加 (图4J). 使用选择性 SUCNR1 抑制剂 4c 预处理 hiNSC 可以完全抑制这些效应 (图 4H–4J).

因此, 小鼠和人类 NSC 中 SUCNR1 信号通路的激活触发 PGE2 的释放，从而产生抗炎作用 1 国会议员.

然而, 针对 PTGS2 或 SUCNR1 的抑制实验预计，额外的 SUCNR1 依赖性（不依赖于 PGE2）机制可能在 NSC 的抗炎作用中发挥关键作用.

SUCNR1 刺激触发 NSC 对琥珀酸的摄取
琥珀酸刺激的 NSC 的基因表达阵列表明, 除了Ptgs2, NaCT/Slc13a5 是野生型中上调最多的基因之一 (WT) 神经干细胞 (log2 倍数变化 = 0.49), 但不在 Sucnr1−/− NSC 中 (log2 倍数变化 = −0.12). SLC13A5 是一种二羧酸协同转运蛋白，已知参与琥珀酸转运 (斯里萨旺等人。, 2007). 鉴于在体内 iNSC 的 CSF 中发现琥珀酸持续消耗- 或 NSC 移植的 EAE 小鼠以及在体外与 MφLPS 共培养, 我们假设 iNSC/NSC 会激活 SLC13A5 来清除琥珀酸.

我们发现SLC13A5的表达, 以及高亲和力二羧酸协同转运蛋白 SLC13A3, iNSC 和 NSC 显着增加, 但不在 Sucnr1−/− NSC 中, 琥珀酸刺激后 (图5A). 相似地, 体外暴露于琥珀酸的 hiNSC 上调了这两种 SLC13 协同转运蛋白的蛋白表达水平 (图5B).

接下来，我们通过测量 iNSC 和 NSC 中的琥珀酸摄取来研究这些协同转运蛋白的作用. 我们发现 iNSC 和 NSC 均显着积累 [14C]-琥珀酸 (图5C) 同时减少细胞外的量 [14C]-组织培养基中的琥珀酸 (图5D). Sucnr1−/− NSCs 均未积累 [14C]-琥珀酸在细胞内也不在细胞外耗尽 (图5C和5D). 有趣的是, Sucnr1−/− NSC, 我们已经证明它对 MφLPS 中的 Il1b 表达没有影响 (图4F), 未能降低与 MφLPS 共培养中的细胞外琥珀酸水平 (图5E). 进一步证明琥珀酸消耗在调节类型表型中的重要性 1 促炎 MP, 我们证明用活性重组治疗 (r)SDH复合体亚基A能够显着降低MφLPS中Il1b的表达 (图S5).

因此, NSC 中的 SUCNR1 信号传导促进免疫代谢物琥珀酸的摄取, 从而耗尽维持自分泌和旁分泌激活类型的可用细胞外池 1 国会议员.

Sucnr1 功能丧失的 NSC 移植显示改善体内慢性神经炎症的能力受损
确认琥珀酸-SUCNR1 轴在介导 NSC 移植物体内琥珀酸反应中的作用, 我们评估了 Sucnr1−/− NSCs 的 ICV 移植对慢性 EAE 小鼠的影响.

在 30 dpt, Sucnr1−/− NSC 存活下来, 分布式, 并整合到 EAE 大脑和脊髓中，与对照 NSC 相比没有显着差异 (图S6). 然而, 与 PBS 处理的对照 EAE 小鼠相比，Sucnr1−/− NSC 移植仅诱导 EAE 行为缺陷轻微恢复 (EAE 评分—Sucnr1−/− NSC: 2.9 ± 0.2; 公共广播公司: 3.6 ± 0.4), 明显不太明显 (50% 的效果) 高于移植对照 NSC 的 EAE 小鼠中观察到的结果 (EAE 评分—NSC: 2.1 ± 0.3; 图6A).

基于流式细胞仪的离体中枢神经系统炎症浸润成分分析表明，用 Sucnr1−/− NSC 移植 EAE 小鼠未能改变类型比例 1 炎症和抗炎 MP（包括 CX3CR1+ 小胶质细胞和 CCR2+ 单核细胞衍生的浸润巨噬细胞）与对照 NSC 的作用形成对比 (图6B和6C). 死后组织病理学进一步证实 Sucnr1−/− NSC 移植物的组织保护作用降低 (图6D和6E).

然后，我们研究了来自 NSC 移植和 PBS 处理的对照 EAE 小鼠的匹配脑脊液和血浆样本中 PGE2 和琥珀酸的水平. 我们发现 Sucnr1−/− NSC 和对照 NSC 均未能诱导 CSF 中 PGE2 水平的显着变化. 仅 EAE 小鼠血浆 PGE2 显着增加 (与健康对照), 没有观察到治疗效果 (图6F). 重要的是, 而对照 NSC 的移植减少了 CSF 琥珀酸盐 (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; 公共广播公司: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; 神经干细胞: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1−/− NSC 移植物未显示任何影响 (Sucnr1−/− NSC: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; 图6G).

这些数据证实了功能性 SUCNR1 信号通路在调节 NSC 移植体内抗炎和神经保护作用中的需要，并强调了琥珀酸清除作为 NSC 的主要抗炎作用机制的重要性.

讨论
临床需求尚未得到满足，需要开发细胞和分子方法来靶向慢性神经炎症性疾病（包括进行性多发性硬化症）病理生理学的核心驱动因素 (沃尔普等人。, 2016). 原则, 干细胞具有不同于小分子和生物制剂的治疗潜力，远远超出了经典的再生医学领域. 部分药物、部分器械, 干细胞可以作为生物疾病缓解剂 (DMA) 感知不同的信号, 迁移到体内的特定部位, 整合输入以做出决策, 并在特定的组织微环境中执行复杂的反应行为 (菲施巴赫等人。, 2013). 所有这些属性都可以用来治疗多种疾病过程, 包括进行性多发性硬化症中发生的持续性 MP 驱动的炎症和组织变性.

这里, 我们使用了可访问的, 自体的, 和稳定可扩展的 iNSC (蒂尔等人。, 2012), 以及体细胞 NSC, 研究脑干细胞移植对慢性神经炎症小鼠模型的影响, 模拟进行性多发性硬化症中观察到的炎症级联反应.

我们发现，将 iNSC 移植到 EAE 小鼠的 CSF 循环中，所产生的结果与之前在移植体细胞 NSC 的小鼠中观察到的结果相同 (普卢奇诺等人。, 2003). 移植的 iNSC 或 NSC 引起显着的临床改善, 以及减少轴突和髓磷脂损伤, BBB 渗透性没有显着降低 30 dpt. 进一步的研究将有助于阐明 iNSCs/NSCs 移植后是否立即发生 BBB 通透性的变化或炎症单核细胞向 CNS 的募集. 这种效应是否可能改变炎症细胞浸润中枢神经系统高发疾病的主要临床结果, 例如 EAE/MS, 很难预料.

反而, 我们发现，我们的移植范例与 CX3CR1+ 小胶质细胞和 CCR2+ 单核细胞衍生的浸润巨噬细胞的激活谱的特定转变相关，并且 CD80+ 类型的减少 1 炎症 MP 和 MRC1+ 抗炎 MP 平行增加. 移植的 iNSCs/NSCs 在 EAE 小鼠的 CNS 中分布并存活, 同时优先积聚在与内源性 MP 并置的脑膜血管周围区域水平. 共, 这些发现意味着移植干细胞和炎症 MP 之间存在一些尚不清楚的细胞间耦合机制. 这种 iNSC/NSC-MP 体内通讯是否仅发生在血管周围的微环境中，还是也发生在包括脉络丛在内的其他新兴的大脑免疫传感器样结构的水平上，仍有待解决 (葛等人。, 2017).

然后，我们研究了慢性神经炎症期间 NSC 对 MP 产生有益作用的潜在免疫机制. 对匹配的脑脊液和血浆样本进行非靶向小分子分析揭示了 EAE 小鼠脑脊液中深刻的代谢变化, 疾病早期和延迟阶段之间存在差异.

肉碱, 亮氨酸 + 异亮氨酸, 瓜氨酸, 尿囊素, 鸟氨酸, 在疾病高峰期，PBS 处理的对照 EAE 小鼠的尿酸和尿酸均显着升高. 我们的研究结果与已发表的证据一致，表明亮氨酸, 以及尿酸及其副产物尿囊素, 患有多发性硬化症的受试者的脑脊液中均增加 (阿莫里尼等人。, 2009, 胡珀等人。, 1998, 摩纳哥等人。, 1979). 然而尚未有 MS 患者脑脊液肉毒碱增加的报道, 中枢神经系统非 MS 炎症状况的显着增加, 比如脑炎 (维科夫等人。, 2008) 和脑膜炎 (西纳维等人。, 1998).

反过来, 只有琥珀酸表现出延迟 (IE。, 45 分辨率) PBS 处理的对照 EAE 小鼠的 CSF 增加. 琥珀酸正在成为代谢窘迫和炎症活动的有价值的体内生物标志物 (利特尔伍德-埃文斯等人。, 2016, 米尔斯和奥尼尔, 2014). 重要的是, 我们发现 iNSC-/NSC 移植小鼠脑脊液中的琥珀酸显着减少. iNSC 或 NSC 移植后脑脊液琥珀酸的减少令人感兴趣，并且可能在干扰慢性神经炎症中发挥重要作用.

琥珀酸脱型 1 炎症 MP 是一种关键的炎症信号，与其特定的 G 蛋白偶联受体 SUCNR1 相互作用. SUCNR1 作为多种生理和病理条件下代谢应激的早期检测器, 包括肾素诱发的高血压, 缺血/再灌注损伤, 炎, 血小板聚集, 和视网膜血管生成 (卡斯特罗·丰内斯卡等人。, 2016, 吉利森等人。, 2016). 尤其, 我们发现SUCNR1的表达是移植NSCs体内治疗效果所必需的.

琥珀酸介导的啮齿动物和人类 iNSC 和 NSC 上 SUCNR1 的激活可激活钙信号传导和丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 体外磷酸化, 从而引发 NSC 获得一致的抗炎表型. 一方面, SUCNR1激活PGE2的分泌, 一种成熟的多效性免疫调节剂, 其功能针对炎症微环境中的多种细胞类型, 包括国会议员 (科塔等人。, 2017, 瓦桑丹等人。, 2016). 另一方面, iNSC 和 NSC 中的琥珀酸-SUCNR1 信号传导导致 SLC13 协同转运蛋白家族的两个成员上调 (IE。, SLC13A3 和 SLC13A5) 和细胞外琥珀酸的摄取.

体内, 我们证明通过脑脊液循环注射到 EAE 小鼠中的 NSC 可以有效清除细胞外局部琥珀酸, 哪个占主导地位, 与 PGE2 的分泌相比. 移植的 NSC 中 SUCNR1 依赖性信号传导的丧失导致其抗炎和神经保护作用显着降低, 而 Sucnr1−/− NSC 移植物的存活率没有差异, 分配, 以及与对照 NSC 的分化.

然后我们假设细胞外的琥珀酸通过类型分泌 1 炎性 MP 启动清除行为，移植的 NSC 会根据增加的底物可用性进行调整 (斯里萨旺等人。, 2007). 这种新颖的细胞间代谢耦合与现有文献非常吻合，表明, 在特定的微环境中, 细胞竞争可用的营养物质, 影响彼此的功能和命运 (皮尔斯和皮尔斯, 2013).

我们预计，表达 SUCNR1 的 iNSC 和 NSC 的琥珀酸消耗可能在减少炎症环境中关键代谢信号的可用性方面发挥关键作用，在炎症环境中，移植干细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用变得互补 (普卢基诺和科塞蒂, 2013). 更一般地说, 我们的发现与挑衅性的结果一致, 但仍在不断涌现, NSCs 作为大脑祖先守护者的概念，能够发挥多种互补的免疫调节和组织营养作用 (马蒂诺和普卢基诺, 2007).

需要更多的研究来进一步表征琥珀酸-SUCNR1 轴在神经免疫相互作用中的功能, 提供关于细胞代谢对神经干/祖细胞的关键作用的更多见解 (诺布洛赫和杰斯伯格, 2017), 并开发针对慢性炎症大脑中这一途径的补充药理学干预措施.

综上所述, 我们在此表明​​，NSC 能够感知慢性炎症中枢神经系统中积累的细胞外琥珀酸，从而通过琥珀酸-SUCNR1 依赖性机制改善神经炎症. 我们的工作确定了一种新的抗炎机制，该机制支持体细胞和直接诱导的 NSC 的再生潜力, 从而为治疗慢性炎症和退行性神经疾病的个性化干细胞药物的新时代铺平了道路.