La berbérine améliore le métabolisme du glucose grâce à l'induction de la glycolyse
https://www.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajpendo.00211.2007
Berbérine, un alcaloïde botanique utilisé pour contrôler la glycémie de type 2 le diabète en Chine, il a récemment été signalé qu'il activait AMPK. Cependant, on ne sait pas comment l'AMPK est activé par la berbérine. Dans cette étude, l'activité et le mécanisme d'action de la berbérine ont été étudiés in vivo et in vitro. Chez les rats obèses alimentaires, la berbérine a augmenté la sensibilité à l'insuline après une administration de 5 semaines. L'insuline à jeun et HOMA-IR ont été diminuées de 46 et 48%, respectivement, chez les rats. Dans les lignées cellulaires incluant les adipocytes 3T3-L1, Myotubes L6, Myotubes C2C12, et hépatocytes H4IIE, il a été constaté que la berbérine augmente la consommation de glucose, 2-absorption de désoxyglucose, et dans une moindre mesure le 3-O-méthylglucose (3-OH MON DIEU) absorption indépendante de l'insuline. L'absorption du glucose induite par l'insuline a été améliorée par la berbérine en l'absence de modification de l'IRS-1. (Ser307/312), Acte, p70 S6, et phosphorylation ERK. La phosphorylation de l'AMPK a été augmentée par la berbérine à 0.5 h, et l'augmentation est restée pendant ≥16 h. La respiration aérobie et anaérobie a été déterminée pour comprendre le mécanisme d'action de la berbérine. La phosphorylation de longue durée de l'AMPK était associée à une élévation persistante du rapport AMP/ATP et à une réduction de la consommation d'oxygène.. Une augmentation de la glycolyse a été observée avec une augmentation de la production d'acide lactique. La berbérine n'a présenté aucune cytotoxicité, et il a protégé la membrane plasmique des myotubes L6 dans la culture cellulaire. Ces résultats suggèrent que la berbérine améliore le métabolisme du glucose en stimulant la glycolyse., qui est liée à l'inhibition de l'oxydation du glucose dans les mitochondries. L'activation de l'AMPK induite par la berbérine est probablement une conséquence de l'inhibition des mitochondries qui augmente le rapport AMP/ATP.
la berbérine est un alcaloïde botanique présent dans les racines et l'écorce de plusieurs plantes, dont Coptis chinensis français, une ancienne plante chinoise utilisée pour traiter le diabète depuis des milliers d'années en Chine. La berbérine est le principal composé actif de la plante. En plus de ses activités métaboliques, la berbérine a des activités antimicrobiennes bien établies dans le contrôle des infections bactériennes, virus, champignons, protozoaires, et les helminthes (8, 14). C'est un médicament en vente libre pour le traitement des infections gastro-intestinales en Chine.. Dans 1988, l'effet hypoglycémiant de la berbérine a été découvert lorsque la berbérine était utilisée pour traiter la diarrhée chez les patients diabétiques en Chine (13). Depuis lors, la berbérine a été utilisée comme agent antihyperglycémiant par de nombreux médecins en Chine. Il existe de nombreux rapports cliniques sur l'action hypoglycémiante de la berbérine dans la littérature chinoise..
Concernant le mécanisme d’action de la berbérine, nous avons constaté que la berbérine augmentait le métabolisme du glucose dans les cellules en culture, et cette activité était comparable à celle observée pour la metformine dans 2002 (20). Cette activité a été confirmée plus tard dans d'autres études, et l'AMPK a été proposé pour médier les activités métaboliques de la berbérine (2, 3, 9, 22). Dans 2006, il a été rapporté que la berbérine était capable d'activer l'AMPK pour inhiber la synthèse des lipides dans les hépatocytes humains (2). Il a été rapporté que la berbérine réduisait le poids corporel et améliorait le métabolisme du glucose dans des modèles animaux du syndrome métabolique. (9). La berbérine induisait la phosphorylation de l'AMPK dans les adipocytes 3T3-L1 et les myotubes L6, et l'AMPK a été proposé pour expliquer l'effet insulino-sensibilisant de la berbérine (9). L'activation de la voie AMPK par la berbérine a également été observée par deux autres groupes (3, 22). Bien que l'AMPK soit activé par la berbérine, les conditions métaboliques qui conduisent à cet effet nécessitent des recherches plus approfondies. Il a été démontré que la berbérine inhibe le cycle de l'acide citrique dans les mitochondries isolées (1, 11, 12). Cependant, il n'est pas clair si cette activité peut être observée dans les cellules vivantes pour l'activation de l'AMPK.
Dans cette étude, l'activité métabolique de la berbérine a été examinée chez des rats diabétiques, et le mécanisme d'action a été étudié dans des modèles cellulaires. Le résultat suggère que la berbérine stimule le métabolisme du glucose par induction de la glycolyse.. L'activation de l'AMPK par la berbérine est liée à une augmentation du rapport AMP/ATP. L'inhibition de l'oxydation du glucose dans les mitochondries peut contribuer à l'augmentation du rapport AMP/ATP et à l'activation de l'AMPK.
CONCEPTION ET MÉTHODES DE RECHERCHE
Réactifs.
DMEM, 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), dexaméthasone, solution d'insuline, 2-désoxy-d-glucose, 3-O-méthyl-d-glucopyranose, et la cytochalasine B ont été achetées auprès de Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Sérum fœtal bovin (FBS) a été acheté chez Atalanta Biologicals (Lawrenceville, Géorgie). Le réactif colorant au glucose a été acheté chez Raichem (San Diego, Californie). 2-Désoxy-d-[3H]glucose et 3-O-d-[méthyle-14C]le glucose a été acheté chez PerkinElmer (Boston, MA). Anticorps contre le phospho-Akt (Thr308) et la phospho-p70 S6 kinase (Thr389) ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). IgG anti-chèvre [peroxydase de raifort (PRH) conjugué], anticorps contre Akt1/2, GLUT4, et phospho-IRS-1 (Tyr632) ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology (Sainte Croix, Californie). Anticorps contre le phospho-IRS-1 (Ser307) a été acheté dans le nord de l'État (Charlotteville, Virginie). Les anticorps contre l'α-tubuline et GLUT1 ont été obtenus auprès d'Abcam (Cambridge, MA). Des IgG anti-lapin ou anti-souris conjuguées à la HRP ont été achetées auprès de GE Healthcare UK (Buckinghamshire, ROYAUME-UNI). La membrane PVDF pour immunoblot a été achetée auprès de Bio-Rad (Hercule, Californie). Le kit de dosage des protéines a été acheté chez Pierce (Rockford, IL). La berbérine destinée aux expériences sur les animaux provenait de l'usine Materia Medica du comté de Meitan., Province du Guizhou, Chine. La berbérine pour les expériences in vitro provenait de Sigma Chemicals (St. Louis, MO).
Expériences sur les animaux.
Rats Wistar mâles (Centre des animaux expérimentaux de l'université chinoise, Shanghai, Chine), 2∼3 mois et ∼240 g de poids corporel, ont été hébergés individuellement dans des cages grillagées dans une pièce à température contrôlée (22 ± 1 °C) sur un 12:12-h cycle lumière-obscurité. Les animaux ont été nourris avec un régime riche en graisses (HFD; saindoux, 59% de calories) avec accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Le protocole animal a été approuvé par le comité d'examen institutionnel. Après 6 mois sur HFD, les animaux ont été divisés en témoins (n = 6) et traité à la berbérine (n = 6) groupes. La berbérine a été administrée à 125 mg/kg deux fois par jour à 1000 et 2200 par gavage gastrique pour 5 semaine. Les rats témoins ont été gavés avec un volume égal de véhicule (eau distillée). Après 5 semaines de traitement, un test de tolérance au glucose intrapéritonéal (IPGTT) a été menée entre 0900 et 1100 sur des animaux à jeun pendant 10 heures. Le sang à jeun a d'abord été collecté en lacérant la veine de la queue avant d'administrer du glucose à 2 g/kg de poids corporel (40% solution de glucose). Des échantillons de sang ont ensuite été prélevés à 2 h. L'insuline à jeun a été détectée à l'aide d'un kit LINCO Rat Insulin RIA (St. Charles, MO). L’évaluation du modèle d’homéostasie (HOMA) la méthode a été utilisée pour déterminer la résistance à l’insuline (HOMA-IR) (10): HOMA-IR = insuline à jeun (µU/ml) × glycémie à jeun (mmol/l)/22.5.
Cellules.
Préadipocytes 3T3-L1 de fibroblastes de souris, Myoblastes squelettiques de rat L6, Myoblastes de souris C2C12, et la lignée cellulaire d'hépatome de rat H4IIE ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection. (Manassas, Virginie) et maintenu dans un milieu de culture DMEM additionné de 10% FBS, 4 mmol/l de glutamine, et 50 mg/l de gentamicine dans une atmosphère de 5% CO2 à 37°C. Pour l'adipogenèse, 3Les préadipocytes T3-L1 ont été cultivés jusqu'à confluence dans une plaque de 100 mm puis traités avec un cocktail adipogène (5 µg/ml d'insuline, 0.5 mmol/l IBMX, et 10 μmol/l dexaméthasone) pour 4 jours. Ceci a été suivi d'une incubation dans un milieu supplémenté en insuline pendant une période supplémentaire. 3 jours. Le milieu normal a été utilisé le jour 7 pour entretenir les adipocytes (6). Pour la différenciation des myotubes, Les cellules L6 ont été cultivées dans du DMEM avec 10% FBS pour 24 h. Les cellules ont ensuite été maintenues dans 2% Support FBS (α-MEM) pour 6 jours pour induire la différenciation. Le support était changé tous les 48 h (15). Pour les cellules C2C12, DMEM complété par 2% du sérum de cheval a été utilisé pour induire la différenciation. Le processus inducteur était similaire à celui des cellules L6 (16).
Consommation de glucose.
Les cellules ont été cultivées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits.. Quand les expériences ont été menées, le milieu de culture normal a été remplacé par du DMEM additionné de 0.25% albumine sérique bovine (BSA). Alors, les cellules ont été traitées avec de la berbérine et/ou de l'insuline (concentration finale 100 nmol/l) pour 24 h. La concentration en glucose dans le milieu a été déterminée par la méthode de la glucose oxydase. Le glucose des puits contenant des cellules a été soustrait du glucose des puits à blanc pour obtenir la quantité de glucose consommée. (20).
Absorption du glucose.
3Préadipocytes T3-L1, L6, ou les myoblastes C2C12 ont été différenciés en adipocytes ou myotubes matures dans une plaque à 12 puits. Pour le 2-désoxyglucose (ou 3-OMG) adoption, après traitement à la berbérine dans du DMEM sans sérum avec 0.25% BSA pour 16 h, les cellules ont été traitées à l'insuline (200 nmol/l) pour 20 min à 37°C dans du PBS (1 ml/puits). Après un lavage en PBS, les cellules ont été incubées dans 1 ml de PBS contenant 0.1 mmol/l 2-désoxy-d-glucose (ou 3-O-méthyl-d-glucose) et 1 μCi/ml 2-désoxy-d-[3H]glucose (ou 3-O-d-[méthyle-14C]glucose) pour 5 min. Alors, les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS glacé et lysées dans 0.4 ml de 1% dodécylsulfate de sodium. [3H]glucose (ou [14C]glucose) le contenu a été déterminé dans 4 ml de scintillant à l'aide d'un compteur à scintillation Beckman LS6500. L'absorption non spécifique du glucose est mesurée en présence de 20 μmol/l de cytochalasine B et soustrait de l'absorption totale pour obtenir une absorption spécifique du glucose (6, 18).
Western blot.
Les cellules ont été traitées à la berbérine dans un milieu sans sérum avec 0.25% BSA. Dans certaines expériences, insuline (200 nmol/l) a été ajouté 20 min avant la collecte de cellules. Le lysat cellulaire entier a été réalisé par sonication dans un tampon de lyse (1% Triton X-100, 50 mmol/lKCl, 25 mmol/l HEPES, pH 7.8, 10 µg/ml de leupeptine, 20 μg/ml d'aprotinine, 125 µmol/l de dithiothréitol, 1 mmol/l fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1 mmol/l orthovanadate de sodium). La protéine (100 µg) a été bouilli pendant 5 min, résolu dans 7% mini-FDS-PAGE pour 90 mon ça 100 V, et déposé sur la membrane de difluorure de polyvinylidène (Bio-Rad). Après avoir été pré-bloqué dans un tampon de lait pendant 30 min, la membrane a été transférée avec le premier anticorps pendant 2 à 12 h et l'anticorps secondaire pendant 30 min. Les anticorps secondaires conjugués à la HRP ont été utilisés avec un réactif de chimiluminescence (PerkinElmer Sciences de la vie) pour la génération du signal lumineux. Pour détecter plusieurs signaux provenant d’une membrane, la membrane a été traitée avec un tampon de décapage (0.5 mol/lNaOH) pour 20 min après chaque cycle de transfert pour éliminer l'anticorps lié. Toutes les expériences ont été réalisées trois fois (5). ImageJ 1,37V a été utilisé pour quantifier les signaux occidentaux.
Test de cytotoxicité LDH.
3Les adipocytes T3-L1 et les myotubes L6 ont été cultivés dans des plaques à 24 puits. Après un traitement à la berbérine pour 24 h dans du DMEM sans sérum complété par 0.25% BSA, lactate déshydragénase (LDH) la concentration dans le milieu a été détectée avec le LDH-Cytotoxicity Assay Kit II (BioVision, Vue sur la montagne, Californie).
Consommation d'oxygène.
La consommation d'oxygène a été effectuée dans les systèmes de biocapteurs d'oxygène BD (BD Biosciences, Bedford, MA). Après différenciation, les adipocytes 3T3-L1 ou les myotubes L6 ont été trypsinisés et étalés sur une plaque incrustée d'un colorant sensible à l'oxygène dans un milieu de culture DMEM additionné de 10% FBS. Après 6 h, berbérine et/ou insuline (concentration finale 100 nmol/l) a été ajouté au support. La lecture de fluorescence a été prise à différents moments. Les unités de consommation d'oxygène étaient des unités de fluorescence relative normalisées (Dérive), qui ont été obtenus en divisant les valeurs de fluorescence des cellules par la valeur des puits à blanc.
Dosage du contenu en nucléotides adénine.
3Les adipocytes T3-L1 et les myotubes L6 ont été cultivés dans des plaques à six puits. Ils ont été traités avec 5 μmol/l de berbérine pour 0.5 ou 16 h en milieu sans sérum avec 0.25% BSA. Ensuite, les teneurs en ATP et AMP des cellules ont été mesurées par chromatographie liquide haute performance. (HPLC) comme décrit par Wynants et al. (17). Bref, les cellules ont été lysées dans 0.6 N HClO4 et neutralisé avec 1 NKHCO3. L'analyse HPLC a été développée sur un système HPLC (Delta des Eaux 600, Eaux, Milford, MA) constitué d'une unité de pompe de distribution de solvant (Eaux 600), un échantillonneur automatique (Eaux 717 Plus), et un détecteur à barrette de diodes UV-Vis (Eaux 2996 Détecteur à réseau de photodiodes, 190–800 nm). Le système a été contrôlé par ordinateur et analysé avec le logiciel Empower. (Delta des Eaux 600). La séparation a été réalisée à l'aide d'une colonne Atlantis T3. (5.0 µm, 4.6 × 150 mm ID; Eaux) avec colonne de garde (4.6 × 20 mm ID; Eaux). La phase mobile était constituée d'un tampon aqueux contenant 0.15 Acide phosphorique M (10 ml de 85% H3PO4/litre) ajusté au pH 6.00 avec de l'hydroxyde d'ammonium (∼8 ml; UN) et un mélange d'acétonitrile et de méthanol (50:50, vol/vol; B). La phase mobile optimale a été définie comme ci-dessous: 0–5 minutes, 100% UN; 5–25 minutes, dégradé vers A/B = 90:10; le débit a été réglé comme 0.7 ml/min, et la longueur d'onde a été fixée à 259 nm. L'ATP et l'AMP sont apparus à 9.6 et 18.1 min, respectivement.
Dosage du lactate.
Les cellules ont été cultivées dans une plaque à 24 puits et traitées avec de la berbérine et/ou de l'insuline dans du DMEM sans sérum additionné de 0.25% BSA. La concentration de lactate dans le milieu a été détectée avec un kit de dosage du lactate du Biomedical Research Service Center., Université de Buffle (Buffle, Le).
Analyse statistique.
Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SE. Toutes les expériences sur les cellules ont été réalisées au moins en triple. Lorsqu'une seule comparaison a été effectuée, la signification des différences entre les moyennes a été analysée par Student’s t-test. Lorsque plusieurs comparaisons ont été effectuées, la signification a été analysée par ANOVA unidirectionnelle (SPSS 12.0). Lorsqu'un effet significatif a été constaté, les différences entre les moyennes ont été déterminées par Fisher’test post hoc de la différence la moins significative. Le niveau P a été fixé à 0.05.
RÉSULTATS
La berbérine a amélioré la sensibilité à l'insuline chez les rats obèses alimentaires.
Dans cette étude, des rats obèses alimentaires ont été utilisés comme modèle animal de résistance à l'insuline. À 6 mois sur le HFD, la glycémie était significativement élevée chez les rats Wistar à jeun et nourris. Avec traitement de 5 semaines par la berbérine, les deux glycémie à jeun (FBG) et glycémie postprandiale (PBG) ont été significativement réduits chez les rats obèses alimentaires (figue. 1UN). FBG a été réduit de 5.74 à 5.39 mmol/l (P = 0.035). Le PBG a été réduit de 10.4 à 7.6 mmol/l (P = 0.039), qui est proche du niveau de glucose normal. Le taux d’insuline à jeun a diminué de 46% (P = 0.045; figue. 1B). La sensibilité à l'insuline a été significativement augmentée par la berbérine, comme l'indique un 48% réduction (P = 0.036; figue. 1C) dans HOMA-IR….
