Última actualización: Agosto 17, 2026
El succinato extracelular derivado de macrófagos autoriza las células madre neuronales para suprimir la neuroinflamación crónica
Reflejos
•Las NSC de tejidos somáticos o la reprogramación directa reprimen igualmente la neuroinflamación
•El succinato extracelular activa SUCNR1/GPR91 en las NSC
•Las NSC activadas secretan PGE2 y eliminan el succinato, así reprogramando el tipo 1 parlamentarios
•Las NSC mutantes Sucnr1 tienen una actividad antiinflamatoria reducida después del trasplante
Resumen
Células madre neuronales (NSC) El trasplante puede influir en las respuestas inmunitarias y suprimir la inflamación en el SNC.. metabolitos, como el succinato, Modula el fenotipo y la función de las células inmunes., pero no está claro si estos inmunometabolitos también activan las NSC para controlar la inmunorreactividad y las respuestas inflamatorias y cómo lo hacen.. Aquí, Mostramos que las NSC somáticas trasplantadas y las inducidas directamente mejoran la inflamación crónica del SNC al reducir los niveles de succinato en el líquido cefalorraquídeo., disminuyendo así los fagocitos mononucleares (diputado) Infiltración y daño secundario al SNC.. Los parlamentarios inflamatorios liberan succinato, que activa el receptor succinato 1 (SUCNR1)/GPR91 sobre NSC, lo que los lleva a secretar prostaglandina E2 y eliminar el succinato extracelular con los consiguientes efectos antiinflamatorios.. De este modo, Nuestro trabajo revela un papel inesperado para el eje succinato-SUCNR1 en NSC somáticas y directamente inducidas., que controla la respuesta de las células madre a las señales metabólicas inflamatorias liberadas por tipo 1 MP en el cerebro crónicamente inflamado.
Introducción
Los avances en la biología de las células madre han generado esperanzas de que las enfermedades del SNC puedan mejorarse con medicamentos con células madre no hematopoyéticas. (Martino y Pluchino, 2006). Hemos proporcionado pruebas convincentes de que el trasplante de células madre neurales somáticas (NSC) mejora las características clínico-patológicas de modelos animales de trastornos inflamatorios del SNC. Más allá del reemplazo estructural de las células del SNC lesionadas, Nuestro trabajo ha demostrado que las NSC trasplantadas participan en complejos programas de comunicación entre injerto y huésped de células madre., En general, conduce al apoyo trófico y a la modulación de las respuestas inmunes adaptativas e innatas. (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino y Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009b). Específicamente, Los trasplantes de NSC reducen la carga de inflamación en el lugar de la lesión (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009a), disminuir el número de tipos 1 fagocitos mononucleares inflamatorios (parlamentarios) (Cusimano et al., 2012), y promover la curación del SNC lesionado a través de mecanismos aún poco caracterizados.
Sin embargo, La traducción clínica de las terapias experimentales con NSC todavía está limitada por las fuentes de las que se obtienen las NSC humanas. (hNSC) son derivados (Anderson y cols., 2017), la inmunogenicidad intrínseca de las líneas alogénicas de hNSC (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Arroz y col., 2013), y la estabilidad del llamado “lote de células clínicas previsto” (Anderson y cols., 2017, Wright y cols., 2006). NSC autólogas y establemente expandibles inducidas directamente (iNSC) de fibroblastos dérmicos de los pacientes están surgiendo como una alternativa válida a las terapias NSC (Lu y col., 2013, Meyer y cols., 2015, Thier et al., 2012). La reprogramación directa en iNSC evita la laboriosa progresión a través de un estado pluripotente y la posterior diferenciación en los linajes deseados descritos para las células madre pluripotentes inducidas. (IPSC) tecnología (Meyer y cols., 2015, Thier et al., 2012). Por lo tanto, La fabricación de iNSC estables y expandibles a partir de células somáticas representa la forma más factible de obtener células madre cerebrales autólogas para aplicaciones clínicas posteriores. (Wörsdörfer et al., 2013). Sin embargo, aún no se ha probado la eficacia de las iNSC directamente reprogramadas en el tratamiento de trastornos inflamatorios del SNC.
En formas progresivas de esclerosis múltiple. (EM), La inflamación crónica del SNC se sostiene por la activación generalizada de MP que incluyen tanto la microglía residente en el SNC como macrófagos infiltrantes derivados de monocitos. (Mallucci et al., 2015). Los MP se encuentran en lesiones de materia gris., cerca de neuritas degeneradas y cuerpos celulares neuronales (Peterson y cols., 2001), y en lesiones de sustancia blanca, donde el borde externo de la microglía activada se asocia con daño tisular crónico (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Las áreas de sustancia blanca de apariencia normal también se caracterizan por la acumulación de MP., lo que conduce a la formación de nódulos microgliales que impulsan la patología de la enfermedad independientemente de la activación concomitante de las células T (Muelle et al., 2011). El papel perjudicial de la inflamación crónica impulsada por MP en la EM progresiva también está respaldado por evidencia en modelos de enfermedades animales., donde su carga general se correlaciona con la función neuronal deteriorada (Planche et al., 2017), atrofia cerebral (Árbol y col., 2015), y respuestas regenerativas reducidas (Jiang et al., 2014).
La activación de los MP por estímulos proinflamatorios provoca un cambio metabólico hacia la glucólisis y una reducción de la fosforilación oxidativa. (OXFOS) (Kelly y O'Neill, 2015). La evidencia reciente sugiere que, dentro de este recableado metabólico, tipo 1 Los parlamentarios inflamatorios acumulan succinato., con importantes implicaciones fisiopatológicas (Tannahill et al., 2013). El succinato intracelular inhibe la actividad de las enzimas prolil hidroxilasas. (Doctorados), estabilizando así el elemento sensible a la hipoxia (HIF)-1α e inducir la transcripción de interleucina. (Illinois)-1b (Tannahill et al., 2013). Además, oxidación del succinato por la succinato deshidrogenasa (SDH) Reutiliza las mitocondrias de la síntesis de ATP en especies reactivas de oxígeno. (rosa) producción como señal proinflamatoria adicional (Mills et al., 2016). Tipo 1 Los parlamentarios inflamatorios también liberan succinato extracelularmente y regulan positivamente su receptor de succinato afín. 1 (SUCNR1), un receptor acoplado a proteína G (también conocido como GPR91), que funciona como sensor autocrino y paracrino para mejorar la producción de IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).
Tal como, El metabolismo se perfila como una importante diana terapéutica para modular la activación de ambos macrófagos. (Kelly y O'Neill, 2015) y microglía (Orihuela et al., 2016), y las vías relacionadas con el succinato tienen funciones inmunomoduladoras clave para enfermedades inflamatorias agudas y crónicas (Ryu y cols., 2003, Tannahill et al., 2015).
Dadas las propiedades inmunomoduladoras establecidas de las NSC (Pluchino y Cossetti, 2013), Nuestra hipótesis es que las NSC pueden ejercer sus efectos terapéuticos en la neuroinflamación crónica al modular el metabolismo de MP hacia la reducción del daño secundario al SNC..
en este trabajo, Investigamos los mecanismos moleculares que sustentan la capacidad de las NSC somáticas y directamente inducidas para contrarrestar los cambios metabólicos de tipo. 1 MP inflamatorios tanto in vivo como in vitro.. Mostramos que las iNSC y NSC trasplantadas son funcionalmente equivalentes para mejorar la neuroinflamación crónica en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental. (EAE). Las iNSC/NSC trasplantadas cambian el perfil de activación de la microglía residente en el SNC y los macrófagos infiltrantes derivados de monocitos hacia un fenotipo antiinflamatorio, así como reducir los niveles del inmunometabolito succinato en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Las iNSC/NSC también disminuyen el succinato extracelular liberado por tipo 1 MP inflamatorios para reprogramar su metabolismo hacia OXPHOS in vitro. mecanicamente, Mostramos que el succinato se secreta por tipo. 1 Los parlamentarios provocan en los iNSC/NSC una cascada de señalización aguas abajo del SUCNR1, lo que posibilita su actividad antiinflamatoria. Esta función antiinflamatoria autorizada por succinato de las iNSC/NSC está mediada por la secreción de prostaglandinas. (PG) E2, así como por una considerable eliminación de succinato extracelular. La pérdida de la función Sucnr1 en las NSC conduce a una reducción significativa de las actividades antiinflamatorias in vitro e in vivo después del trasplante en EAE.
Nuestro estudio descubre un eje succinato-SUCNR1 que aclara cómo las NSC responden a señales metabólicas inflamatorias para inhibir la activación del tipo 1 MP en neuroinflamación crónica.
Resultados
El trasplante de NSC mejora la neuroinflamación crónica y se combina con la reducción del succinato de inmunometabolito en el líquido cefalorraquídeo
Primero evaluamos los efectos de la estimulación intracerebroventricular. (icv) trasplante en el pico de la enfermedad (PD) de iNSC o NSC en ratones con EAE crónica inducida por MOG35-55 y lo compararon con ratones de EAE de control tratados con PBS. Antes del trasplante, Se ampliaron los iNSC y NSC, caracterizado (Figura S1), y etiquetado con farnesilado (F)GFP in vitro. En 30 días postrasplante (departamento), Los trasplantes de iNSC y NSC sobrevivieron, repartido, e integrado dentro del cerebro y la médula espinal de la EAE (Figura S2). Sólo una minoría de células fGFP+ recuperadas (iNSC: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) estaban proliferando (Figura 1A) o expresando neuronas (Figura 1B), astroglial (Figura 1C), u oligodendroglial (Figura 1D) marcadores de linaje (Figura S2). la mayoría (∼75%) En cambio, se descubrió que de las iNSC que sobrevivieron al trasplante no expresaban ninguno de los marcadores de linaje neuronal probados y se localizaban alrededor de áreas similares a nichos perivasculares meníngeos cerca de los MP endógenos F4/80+. (Figura 1E), como se observa en injertos somáticos de NSC (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). El trasplante de iNSC indujo un cambio significativo y duradero (arriba a 90 departamento) mejora de las puntuaciones de EAE, que comenzó desde 15 a 20 dpt en adelante (Figuras 1F y S2). La recuperación funcional también se confirmó mediante un análisis de la marcha automatizado asistido por computadora. (Figura S2). En general, Las iNSC trasplantadas con icv fueron seguras y condujeron a una recuperación conductual y patológica.
Luego analizamos la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC mediante citometría de flujo ex vivo en iNSC.- y ratones EAE de control trasplantados con NSC versus ratones de control tratados con PBS. El trasplante de iNSC o NSC no tuvo efectos sobre la fracción de células T que se infiltran en el SNC, células B, y diputados totales, así como en el de los subconjuntos de células T CD3+/CD4+ (incluyendo Th1, Lunes, Treg, ThGM-CSF, y subconjuntos Th17) en 30 departamento (Figura S3). En cambio, iNSC- o ratones EAE trasplantados con NSC mostraron un cambio significativo en el perfil de activación de las células CX3CR1+ con una disminución de aproximadamente 1,5 veces del tipo CD80+ 1 microglía inflamatoria y aumento paralelo de la microglía antiinflamatoria MRC1+ (Figura 1G). Asimismo, infiltrante del SNC (derivado de monocitos) Macrófagos CCR2+ de iNSC- o ratones EAE trasplantados con NSC experimentaron un cambio fenotípico significativo con una disminución de aproximadamente 1,3 veces del tipo CD80+ 1 macrófagos inflamatorios y aumento paralelo de aproximadamente 1,8 veces de los macrófagos antiinflamatorios MRC1+ (Figura 1H). Este efecto fue acompañado por una reducción significativa de la expresión del tipo 1 marcador MP inflamatorio óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) por F4/80+ MP en vivo (Figuras 1I y S3).
Luego analizamos los niveles de expresión de los principales profesionales.- y genes antiinflamatorios en todo el SNC.. iNSC- y los ratones EAE trasplantados con NSC mostraron niveles significativamente reducidos de interleucina-1 beta (II1b) en el cerebro y la médula espinal y niveles elevados de receptor de manosa tipo C 1 (mrc1) en la médula espinal, ambos en 10 departamento (Figura 1J).
No encontramos diferencias significativas en la barrera hematoencefálica. (BBB) permeabilidad en 30 dpt al comparar ratones EAE trasplantados con iNSC/NSC con ratones EAE de control tratados con PBS (Figura S3).
Finalmente, iNSC- y los ratones EAE trasplantados con NSC acumularon una pérdida axonal significativamente reducida (Figura 1K) y desmielinización (Figura 1L) en la médula espinal.
Dada la importancia establecida del metabolismo en la regulación del fenotipo y la función de las MP, Investigamos si los trasplantes de NSC afectaron el microambiente metabólico neuroinflamatorio.. Para tal fin, Realizamos un perfil metabólico no dirigido de metabolitos polares mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. (LC-MS) de muestras compatibles de LCR y plasma (Tabla S1). Los ratones EAE de control tratados con PBS mostraron un aumento significativo de varios LCR (pero no plasma) metabolitos, entre los cuales el succinato sólo alcanzó su punto máximo en 45 días post-vacunación (ppp) (correspondiente a 30 departamento; Figura 1M). Los ratones EAE no sometidos a cirugía también mostraron un aumento significativo de succinato sólo en el LCR en 45 ppp (versus ratones de control sanos), que no fue diferente de los niveles de succinato en los ratones EAE de control tratados con LCR con PBS (Figura S3).
Mientras que no detectamos ningún cambio significativo en los niveles de metabolitos plasmáticos entre ratones EAE de control trasplantados con iNSC/NSC y tratados con PBS (Tabla S1), Descubrimos que el trasplante de iNSC o NSC condujo a una caída significativa en el succinato del LCR en 30 departamento (Figura 1M; Tabla S1).
Más, No encontramos diferencias significativas en el succinato de LCR al comparar ratones EAE tratados con PBS versus ratones EAE inyectados icv con fibroblastos de ratón. (MF) como células de control (Figura S3).
De este modo, Las iNSC y NSC inyectadas directamente en el SNC de EAE inducen un cambio de fenotipo específico de MP, que se asocia con la reducción del succinato de inmunometabolito en el LCR únicamente y la mejora de la neuroinflamación crónica.
Las NSC reducen los niveles de succinato y reprograman el metabolismo del tipo 1 Mφ inflamatoria in vitro
Luego investigamos los mecanismos moleculares a través de los cuales las iNSC/NSC muestran actividades antiinflamatorias en el tipo 1 parlamentarios, utilizando un sistema in vitro que recapitula las interacciones entre MP e iNSC/NSC. Macrófagos ingenuos derivados de la médula ósea (mφ) fueron polarizados en un tipo 1 fenotipo inflamatorio con LPS (MφLPS), como se describe (Tannahill et al., 2013). Luego se cocultivaron MφLPS con iNSC (MφLPS-iNSC) o NSC (MφLPS-NSC) en un sistema transpozo que evita el contacto entre células (Figura 2A). Se utilizaron Mφ no polarizados como controles..
El perfil de expresión génica de microarrays mostró cambios transcripcionales significativos en MφLPS con 7,401 genes afectados (frente a Mφ; valor p ajustado < 0.1; Figura 2B; Tabla S2) y 51 genes expresados diferencialmente en MφLPS-iNSC o MφLPS-NSC (versus MφLPS; valor p ajustado < 0.1; Figuras 2B y 2C; Tabla S2). Este último conjunto de genes se enriqueció en procesos biológicos relacionados con la regulación positiva de la activación de los leucocitos. (IR: 0002696), diferenciación de leucocitos mieloides (IR: 0002761), y procesos del sistema inmunológico (IR: 0002376). La validación independiente de qRT-PCR de genes proinflamatorios Mφ seleccionados confirmó una regulación negativa significativa de los niveles de expresión de Il12b, Il15, Il15ra, y Cd69, así como los genes inflamatorios clásicos Nos2, factor de necrosis tumoral (tnf), e Il1b en MφLPS-iNSC y MφLPS-NSC (versus MφLPS; Figura 2D). Este efecto se combinó con la regulación positiva concomitante de los niveles de expresión de genes asociados con un fenotipo antiinflamatorio Mφ., como la uronil-2-sulfotransferasa (nosotros) y antígeno de células estromales de médula ósea 1 (bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), así como arginasa 1 (Arg1) y mrc1 (versus MφLPS; Figura 2E). Cuando las iNSC/NSC se cultivaron conjuntamente con lipopolisacárido (lps)-células microgliales BV2 de ratón activadas como antes, También se observó una reducción significativa de los niveles de expresión de los genes proinflamatorios Nos2 e Il1b. (Figura 2F).
Vincular perfiles de expresión génica con estados metabólicos funcionales., Evaluamos la tasa de consumo basal de oxígeno. (LOC) y tasa de acidificación extracelular (ECAR) de MφLPS como lecturas de su ácido tricarboxílico (TCA) Ciclo y actividades glicolíticas., respectivamente. Encontramos una reducción significativa de OCR y un aumento significativo de ECAR en MφLPS (versus Mφs). En cambio, MφLPS-iNSC y MφLPS-NSC experimentaron una restauración significativa de los valores OCR y ECAR (versus MφLPS; Figuras 2G y 2H), como se observa en el cambio de Mφ a un fenotipo antiinflamatorio (O'Neill y Pearce, 2016).
En un esfuerzo por aclarar los determinantes metabólicos de estos efectos antiinflamatorios., Realizamos un análisis LC-MS no dirigido del contenido de metabolitos de molécula pequeña extracelular e intracelular de MφLPS.. Como se esperaba, La estimulación con LPS cambió profundamente el medio metabólico extracelular e intracelular de Mφ (MφLPS) (frente a Mφ; Tabla S3). En coculturas, MφLPS-iNSC y MφLPS-NSC mostraron una reducción significativa del glutamato extracelular, GABA, y succinar (versus MφLPS; Figura 2I; Tabla S3). Además, MφLPS-iNSC y MφLPS-NSC también mostraron una reducción significativa de succinato e itaconato intracelular (versus MφLPS; Figura 2J; Tabla S3).
Consistente con la reducción de los niveles de succinato., Encontramos que MφLPS-iNSC y MφLPS-NSC exhibieron niveles significativamente reducidos de HIF-1α, de la isozima M2 de la proteína piruvato quinasa aguas arriba (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figura 2K), así como de IL-1β (versus MφLPS; Figura 2L).
En total, Estos datos in vitro proporcionan evidencia de que las iNSC/NSC reducen la acumulación de succinato intracelular y extracelular en cocultivos con tipo 1 parlamentarios inflamatorios, reprogramarlos hacia un fenotipo antiinflamatorio OXPHOS.
Señales de succinato a través de SUCNR1/GPR91 en NSC de ratón y humanos
Dada la importancia del succinato como señal inmunometabólica, investigamos si el succinato se libera por tipo 1 Los parlamentarios proinflamatorios podrían regular la actividad de las células circundantes in situ, incluido el de iNSC/NSC trasplantadas.
Encontramos que las iNSC/NSC trasplantadas se detectaron cerca de las áreas perivasculares meníngeas (Figuras 3A y 3B ) y F4/80+ MP (Figura 3C) expresó SUCNR1 in vivo en el SNC. SUCNR1 también se expresó a nivel de proteína tanto en iNSC como en NSC in vitro, pero no en MF (Figura 3D).
Evaluar más a fondo si SUCNR1 en iNSC/NSC fue activado funcionalmente por succinato, Investigamos su cascada de señalización aguas abajo in vitro.. Cuando se expone al succinato (Figura 3E; Rubic et al., 2008), 34.2% (±7,4%) de iNSC y 31.7% (±6,5%) de NSC mostró una liberación de reservas de calcio intracelular (Figuras S4 y 3F). Esta respuesta fue seguida por una regulación positiva significativa de la proteína quinasa activada por mitógeno fosfo-p38. (Figura 3G), indicativo de su activación. Confirmamos la expresión de SUCNR1 y SUCNR1 también en NSC fetales humanos. (hNSC) y iNSC humanos (hiNSC) (Figuras 3H y 3I). Como en los iNSC de ratón, La señalización de p38 dependiente de succinato se evocó en hiNSC, pero no en hiNSC pretratadas con el inhibidor selectivo de SUCNR1 4c (Figura 3J).
De este modo, Las iNSC y NSC de ratón y humanos expresan SUCNR1 funcional, que induce una vía de señalización aguas abajo de su estimulación con el succinato de inmunometabolito.
La estimulación SUCNR1 inicia la secreción de prostaglandina E2 por las NSC
Aclarar las consecuencias funcionales de la señalización SUCNR1 en NSC, generamos NSC a partir de ratones que carecen de Sucnr1 (Sucnr1-/- NSC) (Rubic et al., 2008; Figura S4). En comparación con los NSC de control, Las NSC Sucnr1-/- mostraron curvas de crecimiento y diferenciación similares in vitro (Figura S4). Sin embargo, cuando se expone al succinato en diferentes momentos y concentraciones, Las NSC Sucnr1-/- no mostraron una regulación positiva de fosfo-p38 (Figura S4). Estimulación con glutamato o ATP + tapsigargina indujo en las NSC Sucnr1-/- una respuesta de calcio similar a la de las NSC de control (Figura S4). De lo contrario, El tratamiento con succinato no provocó la liberación de calcio de las reservas intracelulares. (Figura S4), lo que indicó una señalización SUCNR1 defectuosa en los NSC Sucnr1-/-.
Luego realizamos un microarray de perfiles de expresión génica después del tratamiento con succinato en NSC de control y NSC Sucnr1-/-. (Tabla S4). Encontramos que la prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (ptgs2), la enzima clave en la biosíntesis de PG que codifica el PTGS2 inducible, fue el gen más regulado positivamente en las NSC de control estimuladas por succinato (cambio de pliegue log2 1.05), pero no en Sucnr1-/- NSC estimuladas con succinato (cambio de veces log2 −0,43; Figura 4A). Validamos estos resultados en Ptgs2 mediante qRT-PCR, confirmando que sus niveles de expresión estaban significativamente regulados al alza (2.1- a un cambio de 2,7 veces) en iNSC y NSC estimuladas por succinato, mientras que no estaban en las NSC Sucnr1-/- tratadas con succinato (Figura 4B).
Dado el papel de la PGE2 como regulador de los efectos inmunosupresores de las células madre mesenquimales (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), Probamos su acumulación en medios de cultivo de tejidos de iNSC., NSC, y Sucnr1-/- NSC después de la estimulación con succinato. iNSC y NSC, pero no Sucnr1-/- NSC, mostró significativo (>2.5-doblar) aumento de su liberación basal de PGE2 tan pronto como 30 min después de succinar. Este efecto inducido por el succinato fue abolido mediante el tratamiento previo con el bloqueador irreversible de PTGS2 SC-58125. (Figura 4C). Como en los iNSC de ratón, la exposición de hiNSC al succinato provocó un aumento significativo de las concentraciones de PGE2 en medios de cultivo de tejidos, mientras que nuevamente el tratamiento previo con SC-58125 o 4c impidió su liberación (Figura 4D).
Ampliar aún más la relevancia de estos hallazgos a las coculturas entre NSC y MφLPS, Analizamos los niveles de PGE2 en medios de cultivo de tejidos.. Encontramos que las MφLPS-NSC acumularon niveles más altos de PGE2 en comparación con las MφLPS, mientras que el tratamiento previo de NSC cocultivadas con SC-58125 redujo significativamente los niveles de PGE2 (Figura 4E). El tratamiento previo con SC-58125 de NSC también se combinó con un aumento significativo de la expresión de Il1b en MφLPS (Figura 4F) y con una reducción de los valores de OCR indicativos de un fenotipo proinflamatorio (Figura 4G). Sin embargo, Notamos que las NSC pretratadas con SC-58125 conservaban algunos efectos antiinflamatorios residuales en MφLPS en comparación con las NSC Sucnr1-/-. (Figura 4F). De lo contrario, La pérdida de función de Sucnr1 en las NSC eliminó por completo sus efectos antiinflamatorios en MφLPS (Figuras 4F y 4G). También mostramos que la capacidad antiinflamatoria dependiente de PGE2 observada de las NSC está conservada y es relevante para las NSC humanas..
Tal como, Las hiNSC indujeron una reducción significativa de la expresión de Il1b en MφLPS en cocultivos (Figura 4H), que se combinó con una restauración de los valores de OCR (Figura 4I) y aumento de los niveles de PGE2 en medios de cultivo de tejidos (Figura 4J). Estos efectos se suprimieron por completo mediante el tratamiento previo de las hiNSC con el inhibidor selectivo de SUCNR1 4c. (Figuras 4H–4J).
De este modo, la activación de la vía de señalización SUCNR1 en NSC de ratón y humanos desencadena la liberación de PGE2, lo que produce efectos antiinflamatorios en el tipo 1 parlamentarios.
Sin embargo, Los experimentos de inhibición dirigidos a PTGS2 o SUCNR1 anticipan que es probable que mecanismos adicionales dependientes de SUCNR1 (independientes de PGE2) desempeñen un papel clave en los efectos antiinflamatorios de las NSC..
La estimulación de SUCNR1 desencadena la absorción de succinato por parte de las NSC
Las matrices de expresión genética de NSC estimuladas por succinato revelaron que, además de ptgs2, NaCT/Slc13a5 estaba entre los genes más regulados en el tipo salvaje (peso) NSC (cambio de pliegue log2 = 0.49), pero no en Sucnr1-/- NSC (cambio de veces log2 = −0,12). SLC13A5 es un cotransportador de dicarboxilato que se sabe que participa en el transporte de succinato (Srisawang et al., 2007). Dado el agotamiento constante de succinato encontrado tanto in vivo en el LCR de iNSC- o ratones EAE trasplantados con NSC e in vitro en cocultivos con MφLPS, Nuestra hipótesis fue que las iNSC/NSC activarían SLC13A5 para eliminar el succinato..
Encontramos que la expresión de SLC13A5, así como del cotransportador de dicarboxilato de alta afinidad SLC13A3, aumentaron significativamente en iNSC y NSC, pero no en Sucnr1-/- NSC, tras la estimulación con succinato (Figura 5A). Similarmente, Las hiNSC expuestas al succinato aumentaron los niveles de expresión de proteínas de ambos cotransportadores SLC13 in vitro (Figura 5B).
A continuación, investigamos el papel de estos cotransportadores midiendo la absorción de succinato en iNSC y NSC.. Encontramos que tanto los iNSC como los NSC acumularon significativamente [14do]-succinar (Figura 5C) mientras reduce la cantidad de extracelular [14do]-succinato en medios de cultivo de tejidos (Figura 5D). Sucnr1-/- NSC no acumulados [14do]-succinar intracelularmente ni lo agotaron extracelularmente (Figuras 5C y 5D). Curiosamente, Sucnr1-/- NSC, que hemos demostrado que no tiene efectos sobre la expresión de Il1b en MφLPS (Figura 4F), no logró reducir los niveles de succinato extracelular en cocultivos con MφLPS (Figura 5E). Como prueba más de la importancia del agotamiento del succinato en la modulación del fenotipo del tipo 1 parlamentarios proinflamatorios, demostramos que el tratamiento con recombinante activo (r)La subunidad A del complejo SDH es capaz de reducir significativamente la expresión de Il1b en MφLPS (Figura S5).
De este modo, La señalización de SUCNR1 en las NSC provoca la absorción del succinato de inmunometabolito, agotando así la reserva extracelular disponible que sustenta la activación autocrina y paracrina del tipo 1 parlamentarios.
El trasplante de NSC con pérdida de función de Sucnr1 muestra una capacidad disminuida para mejorar la neuroinflamación crónica in vivo
Confirmar el papel del eje succinato-SUCNR1 en la mediación de la respuesta de los injertos de NSC al succinato in vivo, Evaluamos los efectos del trasplante icv de Sucnr1-/- NSC en ratones con EAE crónica.
En 30 departamento, Los NSC Sucnr1-/- sobrevivieron, repartido, e integrado dentro del cerebro y la médula espinal de EAE sin diferencias significativas en comparación con los NSC de control (Figura S6). Sin embargo, el trasplante de NSC Sucnr1-/- indujo solo una ligera recuperación de los déficits de comportamiento de EAE en comparación con ratones EAE de control tratados con PBS (Puntuación EAE: Sucnr1-/- NSC: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), que fue significativamente menos pronunciado (50% del efecto) que el observado en ratones EAE trasplantados con NSC de control (Puntuación EAE: NSC: 2.1 ± 0.3; Figura 6A).
El análisis ex vivo basado en citometría de flujo de la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC mostró que el trasplante de ratones EAE con NSC Sucnr1-/- no logró cambiar las proporciones de tipo 1 MP inflamatorias y antiinflamatorias, incluidas la microglía CX3CR1+ y los macrófagos infiltrantes derivados de monocitos CCR2+, en contraste con los efectos de las NSC de control (Figuras 6B y 6C). La patología tisular post mortem confirmó aún más los efectos protectores de tejido reducidos de los injertos de NSC Sucnr1-/- (Figuras 6D y 6E).
Luego investigamos los niveles de PGE2 y succinato en muestras de plasma y LCR emparejadas de ratones EAE de control trasplantados con NSC y tratados con PBS.. Descubrimos que tanto las NSC Sucnr1-/- como las NSC de control no lograron inducir cambios significativos en los niveles de PGE2 en el LCR.. La PGE2 plasmática aumentó significativamente solo en ratones EAE (versus controles sanos), sin efecto del tratamiento observado (Figura 6F). En tono rimbombante, mientras que el trasplante de NSC de control redujo el succinato del LCR (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Los injertos Sucnr1-/- NSC no mostraron efectos (Sucnr1-/- NSC: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Figura 6G).
Estos datos confirman el requisito de una vía de señalización funcional de SUCNR1 en la regulación de los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores de los trasplantes de NSC in vivo y subrayan la importancia de la eliminación de succinato como mecanismo de acción antiinflamatorio predominante de las NSC..
Discusión
Existe una necesidad clínica insatisfecha de desarrollar enfoques celulares y moleculares para abordar los impulsores centrales de la fisiopatología de las afecciones neuroinflamatorias crónicas que incluyen formas progresivas de EM. (Volpe et al., 2016). En principio, Las células madre poseen un potencial terapéutico distinto del de las moléculas pequeñas y los productos biológicos y se extienden mucho más allá del ámbito de la medicina regenerativa clásica.. En parte fármaco y en parte dispositivo, Las células madre podrían funcionar como agentes biológicos modificadores de enfermedades. (DMA) que detectan diversas señales, migrar a sitios específicos del cuerpo, integrar insumos para tomar decisiones, y ejecutar comportamientos de respuesta complejos en el contexto de un microambiente de tejido específico (Fischbach et al., 2013). Todos estos atributos podrían aprovecharse para tratar varios procesos patológicos., incluida la inflamación persistente impulsada por MP y la degeneración tisular que ocurren en la EM progresiva.
Aquí, usamos accesible, autólogo, y iNSC establemente expandibles (Thier et al., 2012), así como NSC somáticos, investigar los efectos del trasplante de células madre cerebrales en un modelo de ratón con neuroinflamación crónica, que imita la cascada inflamatoria observada en la EM progresiva.
Descubrimos que el trasplante de iNSC en la circulación del LCR de ratones EAE promueve resultados equivalentes a los observados previamente en ratones trasplantados con NSC somáticas. (Pluchino et al., 2003). Las iNSC o NSC trasplantadas indujeron una mejora clínica significativa, así como reducción del daño axonal y de mielina, sin una reducción significativa de la permeabilidad BBB en 30 departamento. Estudios adicionales ayudarán a aclarar si se producen cambios en la permeabilidad de la BHE o el reclutamiento de monocitos inflamatorios en el SNC inmediatamente después del trasplante de iNSC/NSC.. Si es probable que tal efecto cambie los principales resultados clínicos de enfermedades con alta prevalencia de infiltración del SNC por células inflamatorias., como EAE/MS, es difícil de anticipar.
En cambio, Descubrimos que nuestro paradigma de trasplante se asoció con un cambio específico en el perfil de activación tanto de las células microgliales CX3CR1+ como de los macrófagos infiltrantes derivados de monocitos CCR2+ con una disminución del tipo CD80+. 1 MPs inflamatorios y aumento paralelo de los MPs antiinflamatorios MRC1+. Las iNSC/NSC trasplantadas se distribuyeron y sobrevivieron en el SNC de ratones EAE, mientras que se acumula preferentemente a nivel de las áreas meníngeas perivasculares en yuxtaposición a los MP endógenos. En total, Estos hallazgos implicarían la presencia de algunos mecanismos aún desconocidos de acoplamiento intercelular entre células madre injertadas y MP inflamatorias.. Queda por abordar si esta comunicación iNSC/NSC-MP in vivo tiene lugar solo en nichos perivasculares o también a nivel de otras estructuras emergentes del cerebro similares a sensores inmunes que incluyen el plexo coroideo. (Ge et al., 2017).
Luego investigamos los mecanismos inmunológicos subyacentes que impulsan los efectos beneficiosos de las NSC en las parlamentarias durante la neuroinflamación crónica.. El análisis de moléculas pequeñas no dirigidas de muestras de plasma y LCR coincidentes reveló cambios metabólicos profundos en el LCR de ratones EAE, con diferencias entre las fases temprana y tardía de la enfermedad.
carnitina, leucina + isoleucina, citrulina, alantoína, ornitina, y el ácido úrico aumentaron significativamente en los ratones EAE de control tratados con PBS en el pico de la enfermedad. Nuestros hallazgos son consistentes con la evidencia publicada que muestra que la leucina, así como ácido úrico y su subproducto alantoína, Todos están aumentados en el LCR de sujetos con EM. (Amorini et al., 2009, Hooper y cols., 1998, Monaco et al., 1979). Mientras que en la EM no se ha informado un aumento de carnitina en el LCR, Se han descrito aumentos importantes en afecciones inflamatorias del SNC no relacionadas con la EM., como la encefalitis (Wikoff y cols., 2008) y meningitis (Shinawi et al., 1998).
En cambio, sólo el succinato mostró un retraso (es decir., 45 ppp) aumento en el LCR de ratones EAE de control tratados con PBS. El succinato se está convirtiendo en un valioso biomarcador in vivo de malestar metabólico y actividad inflamatoria. (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills y O'Neill, 2014). En tono rimbombante, encontramos que el succinato disminuyó significativamente en el LCR de ratones trasplantados con iNSC/NSC. La reducción del succinato del LCR después del trasplante de iNSC o NSC fue de interés y podría tener un papel destacado en la interferencia con la neuroinflamación crónica..
Succinato liberado del tipo 1 Los parlamentarios inflamatorios son una señal inflamatoria clave que interactúa con su receptor específico acoplado a proteína G SUCNR1. SUCNR1 actúa como un detector temprano de estrés metabólico en varias condiciones fisiológicas y patológicas., incluida la hipertensión inducida por renina, lesión por isquemia/reperfusión, inflamación, agregación plaquetaria, y angiogénesis retiniana (de Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Notablemente, Descubrimos que la expresión de SUCNR1 es necesaria para los efectos terapéuticos de las NSC trasplantadas in vivo.
La activación mediada por succinato de SUCNR1 en iNSC y NSC de roedores y humanos activa la señalización de calcio y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) fosforilación in vitro, provocando así la adquisición de un fenotipo antiinflamatorio concertado en las NSC. Por un lado, SUCNR1 activó la secreción de PGE2, un modulador inmunológico pleiotrópico bien establecido, cuya función se dirige a múltiples tipos de células dentro del microambiente inflamado, incluidos los parlamentarios (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). Por otro lado, La señalización de succinato-SUCNR1 en iNSC y NSC condujo a la regulación positiva de dos miembros de la familia de cotransportadores SLC13. (es decir., SLC13A3 y SLC13A5) y absorción de succinato extracelular.
en vivo, demostramos una eliminación eficaz del succinato local extracelular mediante NSC inyectadas en ratones EAE a través de la circulación del LCR, cual es predominante, en comparación con la secreción de PGE2. La pérdida de la señalización dependiente de SUCNR1 en las NSC trasplantadas condujo a una reducción significativa de sus efectos antiinflamatorios y neuroprotectores., mientras que los injertos de NSC Sucnr1-/- no mostraron diferencias en la supervivencia, distribución, y diferenciación versus control NSC.
Luego planteamos la hipótesis de que el succinato extracelular secretado por tipo 1 Los MP inflamatorios inician un comportamiento de recolección que las NSC trasplantadas ajustan en respuesta a una mayor disponibilidad de sustrato. (Srisawang et al., 2007). Este nuevo acoplamiento metabólico intercelular encaja bien con la literatura disponible que muestra que, dentro de microambientes específicos, Las células compiten por los nutrientes disponibles., afectando la función y el destino de cada uno (Pearce y Pearce, 2013).
Anticipamos que el agotamiento del succinato por las iNSC y NSC que expresan SUCNR1 podría desempeñar un papel crucial en la reducción de la disponibilidad de una señal metabólica clave en contextos inflamatorios donde las interacciones entre las células madre trasplantadas y las células inmunes del huésped se vuelven complementarias. (Pluchino y Cossetti, 2013). Más generalmente, Nuestros hallazgos están en línea con la provocativa, aún sigue emergiendo, concepto de NSC como guardianes ancestrales del cerebro capaces de ejercer varios efectos inmunomoduladores y tróficos tisulares complementarios (Martino y Pluchino, 2007).
Se necesitan estudios adicionales para caracterizar mejor la función del eje succinato-SUCNR1 en las interacciones neuroinmunes., Proporcionar información adicional sobre el papel crítico del metabolismo celular para las células madre/progenitoras neurales. (Knobloch y Jessberger, 2017), y desarrollar intervenciones farmacológicas complementarias dirigidas a esta vía en el cerebro crónicamente inflamado.
En conclusión, Aquí mostramos que las NSC detectan el succinato extracelular que se acumula en el SNC crónicamente inflamado para mejorar la neuroinflamación a través de mecanismos dependientes del succinato-SUCNR1.. Nuestro trabajo identifica un nuevo mecanismo antiinflamatorio que sustenta el potencial regenerativo de las NSC somáticas y directamente inducidas., allanando así el camino hacia una nueva era de medicamentos personalizados con células madre para enfermedades neurológicas inflamatorias y degenerativas crónicas..
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