太空飞行激活蛋白激酶 C Alpha 信号传导并改变人类新生儿心血管祖细胞的发育阶段

太空飞行影响宇航员的心血管功能; 然而, 它对心脏发育和构成心脏修复基础的干细胞的影响尚不清楚. 因此, 需要进一步研究来揭示此类变化对人类健康的潜在相关性. 使用模拟微重力 (冲锋枪) 由国际空间站上的二维回转和文化产生 (国际空间站), 我们评估了机械卸载对人类新生儿心血管祖细胞的影响 (中国共产党) 发育特性和信号传导. 接受 SMG 6-7 天后 12 国际空间站文化日, 我们分析了基因表达的变化. 这两种环境都会诱导通常与心血管发育早期状态相关的基因表达. 了解发生此类变化的机制, 我们评估了 SMG 培养的 CPC 中机械敏感性小 RhoGTP 酶的表达，并观察到 RHOA 和 CDC42 水平下降. 鉴于这些分子对细胞内钙水平的影响, 我们评估了非典型 Wnt/钙信号传导的变化. 在 SMG 下 6-7 天后, CPC 的 WNT5A 和 PRKCA 水平升高. 相似地, ISS 培养的 CPC 表现出钙处理和信号基因水平升高, 对应于蛋白激酶Cα (蛋白激酶Cα), 钙依赖性蛋白激酶, 激活后 30 天. Akt 已激活, 而磷酸化的细胞外信号调节激酶水平没有变化. 探讨钙诱导对新生儿CPC的影响, 我们在地球上使用 hWnt5a 治疗激活 PKCα. 随后, 早期心血管发育标志物水平升高. SMG 和 hWnt5a 处理诱导的转录本在窦房结内表达, 这可能代表胚胎心肌保持在原始状态. 钙信号对机械卸载敏感并指导 CPC 发育特性. 在太空和地球上的进一步研究可能有助于完善 CPC 在干细胞疗法中的使用，并强调发育的分子事件.

介绍
当人类为扩大太空存在做准备时, 微重力的分子效应 (MG) 越来越成为调查对象. 随着这项研究的发展, MG的应用, 无论是真实的还是模拟的, 已被发现在地球上具有潜在的治疗用途 [1–3]. 因此, 努力描述对重力降低条件的生物反应, 包括分子水平, 将使太空和地球上的社会受益.

我们自己实验室的研究表明，模拟微重力 (冲锋枪) 影响人类心血管祖细胞的发育状况 (每次点击费用) 以与年龄相关的方式 [4]. 有趣的是, 这些实验中的微阵列分析确定了小 RhoGTPases 和 Wnt 信号传导是新生儿 CPC 中受 SMG 环境影响的一些系统.

机械卸载对小鼠胚胎干细胞的影响 (胚胎干细胞) 已被证明会影响分化和干性, Blaber 等人的实验. [5] 证明胚状体保留自我更新的标记，并在太空飞行时表现出减少的最终胚层标记表达. 然而, 在相同的研究中, 当机械卸载的胚体返回地球时, 他们能够更容易地分化成收缩性心肌细胞集落. 相似地, 贾等人. [6] 发现使用三维培养结合瞬时培养，人类诱导多能干细胞更容易分化为心肌细胞, 早期接触 SMG.

这些单独的实验可能代表了类似的现象，其中低重力培养物促进了 SMG 或 MG 下干性状态的增强，从而导致当细胞返回到正常重力条件时分化能力增加. 因此, 通过操纵与心血管祖细胞中机械信号传导相关的机制，可以改善与心脏修复相关的干细胞疗法. 尤其, 诱导增强心血管祖细胞的干性可能有助于相应增强移植后的临床效果.

机械传感分子的变化, 例如小型 RhoGTPases, 据信参与 MG 的分子适应 [7,8]. 重要的是, 这些分子还能够影响细胞内信号传导途径, 例如钙振荡, 随后可以激活 AKT [9] 和细胞外信号调节激酶 (ERK) [10]. 在心脏发生的背景下, 这些过程对于维持诱导和增殖线索之间的平衡至关重要 [11,12]. 所以, 操纵早期 CPC 的正常重力环境可能会突显早期心脏祖细胞发育或扩展的重要机制. 这些见解可用于进一步了解心血管发育并增强基于干细胞的再生疗法的效果.

在心脏修复的背景下, 这些类型疗法的早期临床试验很有希望 [13–15], 但因细胞植入失败和适当细胞类型的争议而受阻 [16]. 所以, 将 MG 实验的结果应用于地球实验可能有助于克服当前涉及使用 CPC 进行心脏修复的临床试验的缺点.

努力描述 MG 对早期 CPC 群体的影响以及这些变化在地球上的潜在用途, 我们使用二维回转器在国际空间站的国家实验室培养了新生儿 CPC (国际空间站). 我们试图确定参与 SMG 和 MG 信号传导的基因转录变化，以及此类信号传导变化对干性的影响. 然后，我们在正常重力条件下使用小分子在体外模拟这些分子变化的特征. 在这样做的过程中, 我们介绍了对 MG 的适应性细胞反应的组成部分及其对增强新生儿 CPC 再生潜力的影响.

材料和方法
早期CPC的分离和培养
洛马琳达大学机构审查委员会批准了使用心血管手术期间丢弃的组织的方案, 没有可识别的私人信息, 对于本研究，放弃知情同意. 从新生儿心脏组织中分离出 CPC (1 天–1个月), 如前所述 [17]. 简要地, 心房组织被切成小块 (～1.0 mm3) 然后使用胶原酶进行酶消化 (罗氏公司, 印第安纳波利斯, 在) 工作浓度为 1.0 mg/mL. 然后将所得溶液通过 40 μm 细胞过滤器. 通过有限稀释至最终浓度将细胞克隆到 96 孔板中 0.8 每孔细胞以创建用于扩展的群体.

然后, 筛选 Isl1 和 c-Kit 共表达的克隆，并补充含有以下成分的生长培养基： 10% 胎牛血清 (赛默科技, 沃尔瑟姆, 硕士), 100 μg/mL 青霉素-链霉素 (生命科技, 卡尔斯巴德, CA), 1.0% 最低必需培养基非必需氨基酸溶液 (生命科技), 和 22% 内皮细胞生长培养基 (龙沙, 巴塞尔, 瑞士) 在中等 199 (生命科技). MycoAlert PLUS 支原体检测试剂盒 (龙沙, 巴塞尔, 瑞士) 用于检测支原体污染

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