萃取和培养间充质干细胞 (MSC) 来自外周血: 全面的概述
间充质干细胞 (MSC) 由于它们能够分化为各种组织类型，因此已成为再生医学和生物技术的关键资源, 调节免疫反应, 并支持组织修复. 而骨髓和脂肪组织是MSC的常见来源, 外周血为提取的最小侵入性替代品提供了. 本文详细探讨了将MSC与外周血及其随后在生物技术实验室中进行的培养的过程.
1. 间充质干细胞简介 (MSC)
MSC是能够自我更新和分化为成骨的多能基质细胞, 软骨发明, 和成生谱系. 这些细胞的特征是它们表达了特定的表面标记，例如CD73, CD90, 和CD105, 除了缺乏CD34和CD45等造血标记. 外围血液衍生的MSC与来自其他来源的MSC具有相似的功能能力, 使其适合治疗应用.
从外周血中提取MSC及其在体外扩张中用于治疗或研究的使用涉及多个关键步骤, 包括收集, 隔离, 表征, 和耕种. 这个过程需要精确, 遵守协议, 和严格的质量控制措施.
2. 外围血作为MSC的来源
与骨髓抽吸或吸脂相比. 虽然MSC以较低的频率存在于外周血中, 隔离技术的进步使他们的提取可行和高效. 外围血液MSC (PB-MSC) 已证明具有与其他组织相比的免疫调节和分化能力.
3. 从外周血提取MSC的过程
提取过程包括以下关键阶段:
3.1 血液收集
通过标准静脉穿刺从患者那里收集外周血. 所需的血量取决于MSC的预期产量和预期的应用. 通常, 50-100 将血液收集到无菌抗凝剂的管中 (例如。, EDTA或肝素管) 防止凝结.
3.2 语态学 (选修的)
对于更高的产量, 可以使用表达. 这种方法涉及抽血, 使用基于离心的设备分开其组件, 并将非目标分数归还给患者. 单核细胞部分, 富含潜在的MSC, 收集用于进一步处理.
3.3 单核细胞 (跨国公司) 隔离
单核细胞 (跨国公司), 其中包括淋巴细胞, 单核细胞, 和MSC前体, 使用密度梯度离心与全血分离. 这通常是通过将血液分层到密度梯度培养基（例如ficoll-paque和of fip ficoll-paque）上来实现的 400-500 G 30-40 分钟.
- 离心后, 跨国公司在等离子体和密度梯度介质之间的界面形成. 该层经过仔细抽吸并用缓冲液（例如磷酸盐缓冲盐水）洗涤 (PBS) 去除残留的血小板和血浆蛋白.
3.4 从MNCS分离的MSC
使用两种主要方法将MSC与MNC分数分开:
- 遵守塑料: MSC表现出粘附在塑料表面的自然能力. 将跨国公司悬浮液接种到组织培养的烧瓶中，并在受控条件下孵育. 在随后的培养基变化期间，非粘附细胞被冲走.
- 基于免疫亲和力的选择: 特定于MSC的表面标记 (例如。, CD105, CD73) 使用磁激活的细胞分选针对 (Mac) 或荧光激活的细胞分选 (FACS) 隔离纯度的MSC.
4. 在生物技术实验室中种植MSC
MSC的种植是扩大细胞群体同时保持其功能特征的关键步骤. 它需要严格的环境控制, 优化的培养基, 和定期监视.
4.1 培养基的准备
培养基的选择显着影响MSC的增长和功能. MSC种植的标准媒体包括:
- 基础媒体: Dulbecco的改良鹰媒介 (DMEM) 或alpha-mem.
- 补品: 胎牛血清 (FBS) 或人血小板裂解物 (HPL) 添加以提供基本的增长因素.
- 其他组件: 抗生素 (例如。, 青霉素/链霉素) 和谷氨酰胺以支持细胞健康.
该培养基通过0.22微米过滤器通过过滤进行灭菌，并在无菌条件下储存直到使用.
4.2 播种和膨胀
隔离后, MSC以适当的密度接种 (通常 5,000-10,000 细胞/cm²) 在组织培养瓶中. 该培养在37°C的加湿孵化器中保持 5% Co₂.
- 中等变化: 介质被更换 2-3 提供新鲜营养并清除代谢废物的天数.
- 传说: 一旦细胞到达 70-80% 合流, 他们使用胰蛋白酶-EDTA脱离, 中和, 并以较低的密度恢复以防止人满为患.
4.3 质量控制
确保MSC的完整性和功能, 质量控制措施在各个阶段实施:
- 形态评估: 在显微镜下观察MSC，以确保纺锤形成纤维细胞样形态.
- 免疫表型: 进行流式细胞仪以确认MSC特异性标记的表达 (例如。, CD73, CD90, CD105) 和缺乏造血标记.
- 分化潜力: 三轮分化测定法 (成骨, 软骨发明, 成脂) 进行以验证多责任.
- 不育测试: 筛选培养物以进行微生物污染.
5. MSC的应用
扩展的MSC可用于不同领域, 包括:
5.1 再生医学
- 软骨修复: MSC促进骨关节炎和骨折的再生.
- 心血管疗法: 增强心肌梗塞和血管损伤的修复.
5.2 免疫疗法
MSC调节免疫反应, 使它们在治疗自身免疫性疾病方面有价值, 移植物与宿主病 (GVHD), 和炎症条件.
5.3 组织工程
生物技术医生在脚手架中使用MSC来创建生物工程组织进行移植.
5.4 药物测试和研究
体外MSC培养物是测试药物和研究细胞行为的模型.
6. 挑战和未来的方向
虽然从外周血提取和培养MSC是良好的, 仍然存在挑战:
- 低收率: 与骨髓或脂肪组织相比，外周血含有更少的MSC.
- 捐助者的变异性: 患者特异性因素可能会影响MSC的产量和质量.
- 可伸缩性: 扩大大型应用的MSC生产需要高级生物反应器和自动化.
细胞隔离技术的未来进步, 生物处理, 基因工程将进一步提高PB-MSC疗法的功效和可及性.
结论
从外周血中提取和培养MSC代表了生物技术的显着成就, 提供干细胞的侵入性较小且多功能的来源. 通过完善隔离和扩展协议, 科学家可以解锁这些细胞的全部治疗潜力. 随着研究和技术的进步, PB-MSC有望在再生医学及以后发挥越来越重要的作用.
