通过全身输注培养膨胀的自体脂肪组织衍生的间充质干细胞的自身免疫性疾病患者的干细胞治疗

 

长期预期寿命, 生活方式和环境变化导致发达国家的疾病模式变化，促进退化性和自身免疫性疾病的增加. 干细胞已经成为 通过促进组织修复和免受免疫攻击相关损害的保护和保护，是一种有前途的治疗工具. 患者衍生的自体干细胞为这种治疗提供了一种安全的选择, 同性干细胞移植可能引起的. 在这里，我们报告文化疗法的结果扩大了人类脂肪的衍生 间充质干细胞 (hadmscs) 的 10 具有自身免疫性组织损伤和疲惫的治疗选择的患者, 包括自身免疫听力损失, 多发性硬化症, 多重炎, 特应性皮炎和类风湿关节炎. 用于治疗, 我们从最少的脂肪组织开发了针对HADMSC的标准化培养膨胀方案, 为重复注射提供足够数量的单元格. 自身免疫性患者和老年捐助者通常没有可衡量的安全性损失，通常会实现高膨胀效率, 遗传稳定性, 活力和分化效力, 迁移和归巢特征. 尽管可以从富有同情心的使用治疗方面得出的结论仅是初步的, 该数据提供了令人信服的证据，证明了没有其他治疗选择的人类患者的ADMSC的安全性和治疗特性. 作者认为，前体内膨胀的自体ADMSC为治疗自身免疫性疾病提供了有希望的替代方法. 需要进一步的临床研究，以考虑到此处介绍的案例研究获得的结果.

介绍

在21世纪, 现场预期迅速发展，没有治疗的先前不常见疾病的数量. 建议基于干细胞的疗法能够修复与年龄相关的疾病中的组织, 改变了生活方式和环境暴露, 例如自身免疫性疾病和中风. 尤其, 间充质干细胞 (MSC) 已应用于治疗这些疾病 [1–3]. 然而, 缺乏获得足够数量细胞数量的优化培养方案, 有关前膨胀细胞的安全问题, 从老年人和自身免疫性疾病患者中得出的干细胞效力可能会降低这些患者自体干细胞的临床应用.

为了应用人类自体脂肪组织衍生的MSC (HADMSC) 在临床环境中, 我们开发了一种标准化协议，以分离和培养的admsc与最少的体外脂肪隔离, 为多种治疗发明实现足够的单元格数 [4]. 扩大的ADMSC保持了独立于捐助者年龄和疾病状态的有效分化的效力 [5]. 在动物模型和患者中，证实的遗传稳定性和在体内扩张的HADMSC的体内安全性 [4] 表明来自老年人的ADMSC适用于自体疗法，并且与年轻捐助者衍生的ADMSC相当 [5]. 此外, 我们调查了全身输注后HADMSC及其在动物模型中体内归巢的迁移能力.

MSC包括许多具有固有能力的中胚层和其他胚胎谱系潜力的干细胞, 包括脂肪细胞, 骨细胞, 软骨细胞, 肝细胞, 神经元, 肌肉细胞和上皮细胞 [6–8], 取决于周围的微环境. 大量证据表明，MSC通常具有免疫调节和抗炎特性 [9–12]. 虽然MSC的分化特性似乎取决于体内的微环境线索, 免疫调节作用似乎是相当内在的，因此为通过全身性输注而对自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗带来了有吸引力的基础. 而且, MSC的内在特性表明了各种因素的分泌, 调节局部环境和内源祖细胞的激活 [13, 14]. 因此, MSC治疗诱发了治疗疗法的治疗疗法 (GVHD), 全身性红斑狼疮 (sle), 类风湿关节炎 (RA), 多发性硬化症 (多发性硬化症), 糖尿病, 心肌梗塞, 甲状腺炎和不同类型的神经系统疾病, 等等 [15–23].

MSC的各种管理途径, 包括静脉注射 (I.V.) [24], 内部 [25] 或脑内 [26] 据报道用于干细胞应用. 这些路线, I.V. 是将细胞和治疗作用传递到伤害部位的方便策略. 静脉注射的MSC可能会瞬时被困在肺中, 在脾脏中隔离, 并且主要被肾脏消除 [27]. MSC在肺中的初始积累可能引起继发性抗炎效应子的分泌 [28].骨髓衍生的MSC和ADMSC的体内归巢特性的最新证明进一步刺激了I.V. MSC的应用用于治疗 [29]. 在这篇评论中, 我们描述了在自动免疫条件下申请自体ADMSC的几个案例, 包括自身免疫听力损失, 多发性硬化症, 多重炎 (下午), 特应性皮炎 (广告) 和RA. 我们建议多次输注ADMSC可以在长时间内建立免疫稳态.

MSC的表型和分化潜力

已经提出了最小的标准来定义国际细胞治疗学会的间充质和组织干细胞委员会定义MSC. 这些都是: 1) 塑料粘附能力; 2) 缺乏造血标记, 例如CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, 光盘 19, 或HLA-DR; 3) 三态中胚层分化效力成骨细胞, 软骨细胞, 和脂肪细胞; 和 4) 免疫调节能力 [30]. 除了中胚层分化能力, MSC还显示出在体外区分出外胚层谱系，例如神经元, 但也进入内胚层谱系，例如肌细胞和肝细胞 [7, 31]. 分化体内植入MSC的条件可能更复杂，并由局部组织的微环境条件调节. 例如, 植入心脏的MSC可以分化为心肌细胞, 平滑肌细胞, 和血管内皮细胞 [32–34]. 此外, 通过来自当地组织的一系列信号, 植入的MSC可以诱导分泌多种细胞因子，具有营养和免疫调节功能，随后有助于组织修复和再生 [11].

MSC的来源
首先将MSC作为成纤维细胞菌落形成单元隔离 (CFU-FS) 或骨髓的骨髓基质细胞 (BMMSC) 弗里登斯坦及其同事 [35]. 它们最常见的名称基于它们的特性分化为各种中胚层组织，包括骨骼, 软骨和脂肪. MSC在各种器官和组织中发现, 包括脂肪, 骨膜, 滑膜, 滑液, 肌肉, 真皮, 落叶牙, 周细胞, 小梁骨, Infreeperlar脂肪, 关节软骨, 脐带和脐带血 [36, 37], 和胎盘 [38].

BMMSC首先被应用于治疗 [39, 40]. 然而, 从患者吸入的BM是一种侵入性手术，仅产生较少数量的细胞 (关于 1-10 每 1 × 105 或者 0.0001-0.01% 所有BM成核细胞的), 需要高扩展率 [41]. 此外, 随着供体年龄的增加，BMMSC的治疗潜力可能会降低，并且与分化能力下降和体外活力降低有关 [42]. 无论如何, 用于自体移植, 扩大的BMMSC和ADMSC已安全地用于许多人类研究中 [4, 39, 40].

脂肪间充质干细胞
脂肪组织是自体的有吸引力的MSC来源 干细胞疗法, 因为使用微创手术很容易获得足够数量的脂肪组织 [23, 43]. 此外, 脂肪组织含有比BM更多的MSC (关于 100, 000 每克脂肪的MSC) [44]. 而且, ADMSC的分化和免疫调节效力相当于BMMSC的效力 [23].

ADMSC在治疗各种疾病中的功效已在体内报告 [45]. 据报道，ADMSC的局部或系统给药具有心肌梗塞的维修能力 [19] 肝损伤 [24], 缺氧 - 异常引起的脑损伤 [46], 过敏性鼻炎 [47] 和肌肉营养不良 [48]. 此外, ADMSC是免疫调节性的，可能适合治疗包括GVHD在内的免疫相关疾病 [15], 多发性硬化症 [16], 风湿病 [17, 18] 和甲状腺炎 [20].

建立用于临床应用的HADMSC的标准培养扩张程序
由于组织中的MSC数量少, 需要实体扩展来生成通过全身传递获得MSC治疗结果所需的细胞量. 如果BMMSCS, 然而, 长期文化改变了MSC的质量, 包括形态学变化, 特定表面标记的表达减弱, 降低了增殖能力, 分化潜力 [49–52], 和营养活性 [53].

为了产生足够数量的HADMSC 干细胞疗法, 开发了优化的培养条件 [4], 这允许从最少脂肪中扩散HADMSC，因为很少有无法治愈的疾病的患者获得大量脂肪. 使用特殊的大包裹可最大化脂肪组织中干细胞的存活率和A 3 与其他设备相比，随后的早期干细胞附着率更高. 发达的细胞收集, 种植和扩展协议需要的少于 5 G脂肪以获得超过 109 细胞 (后 3 段落). 改善ADMSC的增殖和分化, 我们测试的比 15 市售的培养基，并最终开发了HADMSC培养媒体, 命名为RCME (MSC附件媒体) 和RKCM (MSC增殖媒体) [4]. 这些媒体提供了高的生存能力, 缩短了两倍的时间并保持形态并提高了效力.

特征, 稳定, 毒性, 在动物和人类研究中确定了培养膨胀的HADMSC的肿瘤性。 [4]. 关于体外培养膨胀干细胞的安全性, 形态学上的遗传稳定性和一致性, 免疫表型, 和分化特征, 以及需要验证毒性和肿瘤性. 我们证明了培养的HADMSC显示了MSC的典型免疫表型和分化能力 [4]; 细胞表达MSC标记CD90, CD105, CD44和CD29, 但没有表达造血或内皮标记 (CD31, CD34和CD45) 并与成脂蛋白区分开, 成骨, 神经源, 体外的肌系和软骨谱系. 至少在遗传上，培养膨胀的HADMSC在遗传上稳定 12 通过核型和单核苷酸多态性确定的通道 (SNP) 测定.

悬浮在生理盐水中的细胞保持其MSC特性, 在冷藏条件下的生存能力和效力 (2 到8°C) 至少 72 h, 将干细胞运送到诊所的关键时间段. 然而, 我们注意到，发货期间的身体振动可能会对细胞生存能力产生负面影响. 没有细菌的证据, 真菌, 或在运输和通过锥虫蓝色排除评估之前测试的细胞中观察到分枝质污染是 > 95% 细胞移植之前.

扩展HADMSC的体内安全性
测试HADMSC的毒性, 将不同的细胞剂量静脉注射到免疫缺陷的严重合并免疫缺陷中 (scid) 老鼠, 观察到小鼠 13 几周. 即使在最高的细胞剂量下 (2.5 × 108 细胞/千克体重), 小鼠没有不适的迹象. 虽然i.v的安全. 注入培养物扩展的自体和同种异体MSC已得到证实 [54] 在众多人类临床研究中，包括成骨的不完善 [55], 过时的白细胞 [56], 急性心肌梗塞 [57] 和GVHD [58], 有一些报道说MSC可以诱发肉瘤 [59] 或促进肿瘤的生长 [60]. 为了测试HADMSC的肿瘤性, 我们在BALB/C-NUDE小鼠中进行了肿瘤性测试 26 几周. 即使在最高的细胞剂量下 (2 × 108 MSC/kg, 皮下注射), 找不到肿瘤发育的证据. 在I期人类临床试验中进一步研究了HADMSC的安全性, 静脉内没有严重的不良事件. 管理 4 × 108 在观察期内 12 几周 [4]. 发现的轻微不良事件是脊髓损伤患者常见的，并且自发消失或用药物缓解. 在随访期间，不需要医疗的一种无症状甲状腺功能亢进症的特发性病例. 基于这些研究, 我们得出的结论是，HADMSC的系统给药是安全的，不会诱导肿瘤的发展. 与这些数据一致, Vilalta等. [61] 报道植入在小鼠中的HADMSC倾向于保持稳态, 并且在该期间没有可检测的染色体异常或肿瘤 8 宿主组织的居住月份. 尤其, 肉瘤在Tolar等人的研究中的发展是由于细胞遗传学异常扩张的MSC引起的 [59]. 此外, Izadpanah等. [62] 证明了MSC超越通道的长期培养 20 可能导致它们转化为恶性细胞. 这些结果表明，控制培养膨胀细胞的遗传稳定性至关重要.

来自年轻和老捐助者的HADMSC的神经细胞分化的比较
因为许多是干细胞治疗的候选疾病都是与年龄相关的退行性疾病, 从老年人获得自体使用的干细胞应具有效力以具有治疗作用. 在BMMSCS方面, 关于衰老的影响有争议的结果. 使用来自少年和成年人的人类BMMSC，播种到三维脚手架上, Mendes等. [63] 已经证明，随着患者年龄的增加，实际的骨形成显着下降. Huibregtse等. [64] 证明在源自老年动物的兔BMMSC中观察到菌落形成效率的总体降低. Bergman等. [65] 证明从小鼠分离的年轻人和老年BMMSC之间观察到基础增殖率的差异, 而体外成骨细胞分化的早期标记物的产生相当于. Stenderup等. [42] 已经表明，从老年捐助者中孤立的人BMMSC的寿命降低，人口率增加了一倍, 而两个BMMSC在体外和体内均形成相似量的骨头 [51].

脂肪衍生的MSC似乎没有与BMMSC相同的衰老模式 [66, 67]. 当HADMSC衍生自老年人 (意思是 71.4 年) 和年轻的捐助者 (意思是 36.4 年), 来自两个年龄段的细胞均显示出相似的增殖, 成骨分化和衰老标记模式, 虽然来自同一队列的BMMSC显示出降低, 减少分化并增加衰老 [66]. 与这些发现一致的是来自鼠ADMSC的数据，这些数据来自老年骨质疏松型SAMP6小鼠, 显示端粒长度的维护, 端粒酶活性和成骨分化 [67]. 为了确定从三十岁的捐赠者中隔离的HADMSC的效力, 四十和五十, 研究了它们对神经细胞的增殖和分化潜力 [5]. 证明了单元格, 生存能力, 不同年龄和通过的HADMSC之间的形态和神经分化潜力没有差异. 结果表明，可以将自体脂肪从老年人中衍生出的干细胞 干细胞疗法 年龄依赖性神经疾病具有与来自年轻患者的干细胞相同的干细胞质量和能力.

分配, 静脉注射后移植MSC的迁移和归巢潜力
I.V后MSC的分布. 注射
I.V之后. 送货, 在大多数目标器官中，通常在低频率或极低的频率下发现MSC, 如组织学所示, 聚合酶链反应或通过免疫组织化学 [68–70]. Deak等. [71] 使用增强的绿色荧光蛋白转染的鼠MSC进行了非伤害模型中的系统动力学评估. 他们证明了这一点 24 MSC申请后的人力资源, 最常见的阳性器官是肺, 肝, 肾, 皮肤, 和研究组织中的肠道. 在狒狒, Devine等. [69] 证明在胃肠道组织中观察到高浓度的移植特异性DNA. 他们还表明肾脏, 肺, 肝, 胸腺, 皮肤具有相对较高的DNA当量. 根据他们的研究, 估计这些组织中的植入水平, 不等 0.1 到 2.7%, 与自体和同种异体细胞的结果相似 [69]. 全身管理后, Lee等. [28] 成立 80% 小鼠肺中注入的MSC 15 输注后的最小值, 而之后 4 天，人类MSC的存在的具体信号降低到 0.01%. 重要性, 具有全身传递的人类MSC的临床研究并未引起肺或循环系统的明显不宽容症状, 而鼠类MSC的行为有些不同. Deak等. [72] 在C57BL/6合成鼠MSC输血模型中已证明, 与人类MSC相反, 鼠类MSC的肺部，可能会在肺部堵塞.

I.V后MSC的迁移和归巢潜力. 注射
许多体内研究表明，全身注入的MSC可以迁移到受伤, 发炎的组织并发挥治疗作用 [73, 74]. 在心肌梗塞定位在梗塞区域并改善心室功能之后，静脉内静脉内静脉内交付了BMMSCS, 而MSC递送到非尖锐的大鼠本地化到BM [75]. 局部腹部辐照显着增强了专门针对小鼠辐射组织的MSC归位 [76]. 最近的一项研究证明了i.v的归巢特性. 在过敏性鼻炎模型中管理为细胞受损区域的HADMSC [47]. 我们在大脑中评估了荧光标记的HADMSC的相对器官分布, 脊髓, 脾, 胸腺, 肾, 肝, 肺, 和i.v之后的心. 通过荧光显微镜和人特异性Alu PCR注射脊髓损伤大鼠. 在受伤的脊髓区域, ADMSC的比例相对较高 (13%) 被发现, 而大多数细胞仍留在脾脏中 (40%) 和胸腺 (21%) [数据未显示].

大量研究表明，趋化因子或生长因子在MSC贩运到伤害区域的参与. 基质细胞衍生因子1α的相互作用 (SDF-1α)- 和C-X-C趋化因子受体类型 4 (CXCR4) 介导了左下角神经损伤大鼠模型中移植的BMMSC的运输. 此外, BMMSC被趋化因子吸引，这些因子在人类胰岛培养的原代培养物的上清液中，体外和体内培养[77]. 当我们通过体外迁移测定法比较可溶性因子时, 血小板衍生的生长因子 (PDGF)-AB和转化生长因子-β1 (TGF-β1) 对于HADMSC的迁移活动最有效 [78]. 用肿瘤坏死因子预刺激的HADMSC (TNF-α) 显示出最高的迁移活动. 当通过流式细胞仪和逆转录酶 - 聚合酶链反应分析时, HADMSC表达C-C趋化因子受体类型 1 (CCR1), CCR7, C-X-C趋化因子受体类型 4 (CXCR4), CXCR5, CXCR6, egfr (EGF受体), FGFR1 (FGF受体 1), TGFBR2 (TGF受体 2), tnfrsf1a (TNF受体 1), PDGFRA (PDGF受体a) 和PDGFRB (PDGF受体b) 在蛋白质和mRNA水平. 这项研究表明，HADMSC的迁移受各种生长因子或趋化因子的控制. 因此, 调节体内HADMSC的归巢能力可以刺激其在I.V之后迁移到受伤部位. 行政, 从而提高他们的治疗潜力.

MSC的免疫调节和抗炎作用
几种特征可能对MSC的免疫调节能力和抗炎作用起作用: 1) MSC由于主要组织相容性复合物的表达水平低而具有低免疫原性-I (MHC-I) 并且不表达MHC-II分子和包括B7-1的共刺激分子 (CD80), B7-2 (CD86), 或CD40 [79], (2) MSC分泌可溶性因素，例如白介素 (il)-6 和巨噬细胞刺激因子 [80] 并抑制T和B淋巴细胞的激活和增殖, 并干扰差异化, maturation and function of dendritic cells, (3) MSC释放抗炎和抗凋亡分子，因此可能保护受损的组织 [79, 81].

由于这些特性, MSC移植已用于治疗GVHD, 和几种自身免疫性疾病, 包括自身免疫性甲状腺炎 [20], RA [17, 18] 和MS [16] 并与同种异体干细胞移植有关. 当MSC在移植后早期注射MSC时，全身注入ADMSC的ADMSC控制的致命GVHD用单倍型造血干细胞移植物移植了致命的GVHD。 [15] 尽管正在进行的同种异体BMMSC的临床研究未成功. 在MS的动物模型中报道了BMMSC的治疗功效 [16]. 在这个实验性自身免疫性脑脊髓炎中 (伊) 模型, I.V. 当疾病发作之前或处注射MSC时，输注MSC会降低临床症状. 在实验性胶原蛋白引起的关节炎中 (中央情报局) 学习, 单次腹膜内注射BMMSCS阻止了严重关节炎的发生, 并且与促炎细胞因子的血清水平降低有关 [18]. 通过下调Th1细胞因子，已证明人ADMSC可以改善实验性自身免疫性甲状腺炎 [20]. 全身输注HADMSC可预防淋巴细胞浸润到甲状腺, 减少促炎性细胞因子的产生并改善TH1/TH2平衡 [20]. MSC抑制T细胞增殖和细胞因子的产生，以响应同种抗原和非特异性抗原, 并延长体内的皮肤移植生存 [82]. 此外, MSC抑制B细胞的功能 [83], 天然杀手细胞 [84] 和树突状细胞 [85]. MSC的免疫调节功能是由可溶性因子介导的 [86], 并通过直接细胞与细胞相互作用 [87].

自体疾病患者在临床情况下自体移植后是否具有治疗功能的MSC是否具有治疗功能是有争议的，并且尚未在临床上解决 [88]. Papadaki等. [89] 表明，尽管发现从RA患者中分离出的BMMSC在支持造血的能力方面受到了损害, 从MS患者中分离出的BMMSC表现出正常的能力 [89, 90]. 其他数据表明，BMMSC衍生自RA患者, 多发性硬化症, 自身免疫性SLE, 全身性硬化 (SSC) Sjogren综合征在体外保留了免疫调节能力 [91, 92].

MSC在自身免疫性疾病中的临床应用
鉴于他们确认的体内安全性以及MSC具有免疫调节和抗炎特性的理由, 在其他治疗方案耗尽后，在患者中开始对自身免疫性疾病的富有同情用途治疗. 所有患者均提供了治疗的知情同意. 这里, 我们描述了自身免疫听力损失中ADMSC的处理 (艾德), 多发性硬化症, 下午, 广告和RA. 有关患者疾病和治疗史的详细信息, 疾病状况和治疗列表 1 和其他文件 1; 案例报告, 表S1和图S1. 在表中显示了治疗前后AD的额外临床分数 2. 患者分析主要基于临床参数. 在某些情况下, 还测量了免疫学和血液状态参数 (案例 3, 4, 5, 8, 9, 10); 所有病例均显示炎症反应和嗜酸性粒细胞计数的降低.

桌子 1 HADMSC治疗的摘要 10 患有不同自身免疫相关疾病的患者.

桌子 2 广告患者的评分结果.

对于所有治疗, 5 通过抽脂收集脂肪组织的G, 立即转移到RNL生物的GMP设施和干细胞研究中心 3 使用标准协议获得ADMSC的段落 [4]. 患者接受了 1 和 6 I.V. 输注 200 暂停生理盐水的百万ADMSC (每个 100 百万细胞/100毫升) 在不同的时间间隔 (请参阅表 1 和其他文件 1; 案例报告). 两名患者接受了额外的鞘内 (MS患者) 和内部 (RA患者) 细胞注射 (桌子 1 和其他文件 1; 案例报告和表S1).

结论
可以从少量的脂肪组织中隔离人类ADMSC, 有效扩展以取得超越 109 之后的细胞 3 到 4 独立于捐助者年龄和疾病状况的段落. 细胞的持续效力和遗传稳定性使脂肪组织成为多元细胞的非常有吸引力的来源. 它们的免疫调节功能, 归巢和迁徙模式以及以前的临床试验表明，这些细胞有效地治疗多种自身免疫性疾病，其应用是安全的. 这里, 我们在各种自身免疫性疾病中在道德上有理由富有合理的富有同情心的治疗患者中，在各种自身免疫性疾病中表现出了很大的治疗作用。. 细胞的多次静脉输注在随访期内所有治疗患者的临床益处. 未观察到不良事件. 数据为自身免疫性疾病的临床益处提供了第一个证据, 在对照临床试验中进行进一步审查，需要足够数量的患者来就治疗功效和长期效益得出明确的结论。. 重要的是, 数据表明，多次ADMSC输注 1 × 109 小于一个月的细胞是安全的, 使用BMMSC和ADMSC从临床前和临床试验中证实数据. 此外, 在这个小样本中, 没有供体年龄依赖性功效的证据, 或发现年龄依赖于体外细胞的扩张率. 此处描述的自体干细胞应用是基于当前的最新状态，并为患有各种无法治愈的自身免疫性相关疾病的患者提供了对治疗的看法.

虽然这里表明使用自动免疫的技术已经到位，并且可以证实临床前研究的期望, 对行动方式仍然有限. 综上所述, 此处描述的自体干细胞的系统性输注为更好地治疗多种自身免疫性疾病提供了希望, 独立于患者的年龄.