精准医学时代的诱导多能干细胞研究

滨崎隆 Nihal El Rouby Natalie C. 弗雷戴特·凯瑟琳·E. 圣斯特法诺·寺田直宏
首次发表: 18 一月 2017 https://doi.org/10.1002/stem.2570

DNA 测序技术的最新进展揭示了人类遗传变异如何与不同的健康风险相关, 疾病易感性, 和药物反应. 现在预计此类信息将有助于评估个人健康风险, 设计个性化健康计划，精准治疗患者. 仍然具有挑战性, 然而, 了解此类遗传变异如何导致病理生物学和治疗反应的表型改变. 人诱导多能干细胞 (诱导多能干细胞) 技术正在成为填补遗传关联研究和潜在分子机制之间知识空白的有前景的策略. 尤其是基因组编辑技术的突破和iPSC分化技术的不断完善，使得这一研究方向更加现实和实用。. 开创性研究表明，源自多种单基因疾病的 iPSC 在分化为疾病相关细胞类型时可以在体外忠实地再现疾病表型. 已证明可以部分重现疾病表型, 即使是晚发型多基因疾病. 最近, iPSC 已被证明可以验证通过全基因组关联分析确定的疾病和治疗相关单核苷酸多态性的影响. 在这篇评论中, 我们将讨论iPSC研究如何在即将到来的精准医疗时代进一步为人类健康做出贡献. 干细胞 2017;35:545–550

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意义声明
每个人都有一组独特的基因变异，这些变异会影响对常见和罕见疾病的易感性和保护作用. 尽管原则上需要验证人类健康与个体差异之间的关联, 验证对实际生物过程的影响仍然具有挑战性. 人类诱导多能干细胞为剖析遗传变异在发病机制中的作用提供了独特的机会. 这篇综述概述了诱导多能干细胞研究如何在即将到来的精准医疗时代进一步为人类健康做出贡献的最新进展.

人类基因组研究的最新进展引领精准医学时代
第一个人类参考基因组起草于 2001 经过学术机构之间的国际合作努力, 目标是表征整个人类基因组的遗传变异 1, 2. 人类基因组计划完成后, 已经做出了更多努力来对这些遗传变异进行分类, 第一个是国际 HapMap 项目, 旨在构建最常见遗传变异的单倍型块, 即, 单核苷酸多态性 (单核苷酸多态性) 跨人群 3, 4. 这 1000 基因组计划 (http://www.1000genomes.org/) 表征了常见和罕见的遗传变异 2,504 个人来自 26 使用基于下一代测序的方法和密集基因分型阵列对不同人群进行分析 5. 随着信息的涌入和基因分型平台的可用性, 通过全基因组关联分析，可以同时询问数百至数千个个体的数百万个 SNP (全基因组关联分析). 这种方法彻底改变了遗传学领域, 允许通过不可知论来建立许多遗传关联, 非假设驱动方法. 自第一波 GWAS 出版物发布以来 2005, 23,058 SNP 性状关联已在国家人类基因组研究所 - 欧洲发表 (国家人类健康研究所-EBI) 目录总计 2,502 GWAS研究 6

药物基因组学是一个致力于识别药物反应或不良反应的遗传决定因素的领域，是精准医学概念的关键, 这需要利用基因型来指导药物的选择. 尽管药物基因组学的 GWAS 研究结果取得了丰硕的成果, 其中许多变体尚未进入临床应用. 药物基因组学实施的一个主要障碍是未知的潜在机制联系(s) 药物反应表型和基因型之间. 虽然一些 SNP 位于与所研究的表型生物学相关的基因中, 大多数变异位于基因组的非编码区域, 与表型的直接联系未知，但推测在基因调控中发挥作用. 破译相关遗传信号的作用以揭示这些变异如何在分子和细胞水平上发挥作用对于清楚地了解疾病过程和实施个性化医疗至关重要.

在 2015, 奥巴马政府宣布美国国立卫生研究院启动精准医疗计划 7, 8 (https://www.nih.gov/ precision-medicine-initiative-cohort-program) 在这个倡议中, 将进行大规模队列研究以整合个人生活方式, 环境, 和基因组信息, 建立一个全面的知识库，可以预测个体疾病风险和对治疗的反应. 基因组测序和遗传变异性表征是朝着利用个体数据进行诊断的精准医学目标迈出的第一步, 对待, 并预测对药物治疗的反应. 随着高通量下一代测序技术的出现和成本的迅速下降, 进行全基因组分析是可行的, 全外显子组 (蛋白质编码), 和转录组 (RNA转录本) 测序以探讨与表型特征/疾病状况的关联. 此外, 整合多维组学数据 (例如。, 基因组学, 转录组学, 表观基因组学, 蛋白质组学, 和代谢组学) 有望阐明复杂疾病中涉及的生物相互作用，并揭示由于缺乏严格的统计意义而可能被遗传方法遗漏的重要遗传变异.

尽管原则上需要验证人类健康与个体差异之间的关联, 验证对实际生物过程的影响仍然具有挑战性. 诱导多能干细胞的用途 (诱导多能干细胞) 是一个有吸引力的系统，用于模拟遗传变异以研究相关细胞类型的分子后果. iPSC 技术将完全成熟的体细胞重新编程为多能干细胞，保留个体患者的所有遗传特征. 然后这些 iPSC 可以分化为多种不同的组织类型 (越来越多的经过验证的组织分化里程碑, 参见细胞干细胞 18, 行进 2016) 9, 10. CRISPR-CAS9 或 TALEN 等基因编辑系统将扩大研究范围，旨在揭示遗传变异的机制和功能后果 11, 12. 这可以通过编辑单核苷酸来完成, 在 iPSC 中引入或逆转突变并观察终末分化细胞的表型变化.

iPSC 寻找单基因疾病的治疗方法
疾病可能有单基因或多基因病因. 单基因疾病, 由单个缺陷基因遗传引起的疾病被认为是罕见的，因为每种疾病的患病率都很低, 通常小于 1/10,000 出生时. 过去，具有已知致病基因位点的疾病数量增加了一倍 10 在线人类孟德尔遗传中所见的岁月 (我的天啊) 条目统计. 遗传诊断的改进和筛查计划的实施 (例如。, 新生儿筛查和高危筛查) 使识别患有这种罕见疾病的人成为可能. 因此, 罕见遗传病影响 350 全世界有 100 万人，出生时所有单基因疾病的全球患病率约为 1/100. 自从人类 iPSC 建立以来 2007 13, 14, 人们非常期望利用这些细胞来模拟人类“培养皿中的疾病” 15, 16. 开创性研究表明，源自多种单基因疾病的 iPSC 在分化为疾病相关细胞类型时可以在体外忠实地再现疾病表型 17, 18. 从患有这些单基因疾病的患者身上生成 iPSC 系是建立持久的体外人类模型的有用方法，并已在许多已发表的研究中得到证明 19-22. 研究团体之间的合作已经产生了多种疾病特异性 iPSC 系，可通过 iPSC 库轻松获得 23 研究人员或许能够找到感兴趣的干细胞系来进行进一步的机制研究或直接应用这些细胞进行药物筛选.

虽然通过iPSC研究针对单基因疾病取得了许多重要发现, 最令人兴奋的研究之一是 Yamashita 等人最近关于软骨发育不全的报告. 24. 重要的是, 作者精心建立了一种将 iPSC 分化为软骨细胞以形成软骨组织的方法. 对于 Yamashita 等人来说，这是关键的一步。, 因为针对疾病相关细胞类型开发适当的分化方案仍然可能是 iPSC 研究的限制因素. 与来自健康对照的 iPSC 相比，他们能够成功重现软骨发育不全患者的 iPSC 体外分化过程中的异常软骨形成. 此外, 经过化合物筛选, 他们表明他汀类药物, 广泛使用的降脂药物, 出乎意料地纠正了 iPSC 模型中退化的软骨. 这项堪称典范的工作清楚地再现了培养皿中的疾病过程，并展示了 iPSC 模型在发现罕见单基因疾病新疗法方面的实用性和前景.

除了二维单层分化或基本三维 (3D) 总体差异化, 多个小组已开发出复杂的 3D 分化协议, 通常被称为“类器官培养物”，因为它们能够形成让人想起发育中器官的有组织结构. 尤其, 用于中枢神经系统类器官培养, 兰开斯特等人. 证明来自小头症患者的 iPSC 确实形成了比来自健康对照的 iPSC 更小的大脑类器官 25. 相似地, 几种用于 iPSC 的类器官培养技术已经发展到可以产生其他组织类型和器官 (视杯, 垂体) 26, 27. 无疑, 这些突破性的发现将为更准确地模拟疾病提供必要的复杂性，并为体外人类细胞治疗方案的临床前测试提供更多机会.

iPSC 定义单基因疾病的进一步表型变异
在人类单基因疾病中, 单一基因突变是导致该疾病表型的主要原因. 在很多情况下, 我们可以预测单个基因中的特定突变如何影响蛋白质功能 (例如。, 残留酶活性), 与疾病的严重程度和表现相关. 这是, 然而, 准确预测临床症状仍具有挑战性, 根据突变类型判断疾病的严重程度和发病情况. 这一挑战的一个例子是戈谢病 (GD), 一种常染色体隐性遗传病，由编码葡萄糖脑苷脂酶的 GBA 基因突变引起 (GC酶) 28. GCase 是一种溶酶体酶，可催化糖脂葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺和葡萄糖. GD 患者表现出广泛的临床症状，包括肝脾肿大, 骨骼畸形, 血液学异常, 和神经系统症状. GBA 中的 N370S 突变常见于类型 1 GD, 表现出非神经元症状. 另一方面, L444P突变常见于类型 2 或者 3 GD, 确实出现神经系统症状. GBA 基因座与邻近假基因的重组事件也与一些不寻常的临床表现有关 29. 表型变异, 然而, 在具有相同 GBA 突变的患者中观察到, 例如受影响的兄弟姐妹之间, 甚至在同卵双胞胎之间. 在同卵双胞胎的情况下, 一个受 GD 影响，但另一个即使 GCase 活性较低也没有临床症状 30. 在广东省, GCase 缺乏会导致中间代谢物葡萄糖鞘脂葡萄糖神经酰胺的积累, 通过额外的溶酶体 GCase 进一步代谢为鞘氨醇, 国标2. 有趣的是, GD小鼠模型中GBA2的缺失挽救了内脏和骨骼症状, 表明 GBA2 可能有望改善 GD 的某些衰弱症状 31.

在另一项研究中, 阿瓦德等人. 通过使用 GD 型患者 iPSC 衍生的神经元细胞，发现了 GD 神经退行性过程中溶酶体功能障碍和自噬阻滞的参与 2 GD (神经病性形式). 雷帕霉素治疗后, 神经元死亡优先在以下类型的神经元中诱导 2 GD-iPSCs, 但不输入 1 GD-iPSCs. 尽管转录因子 EB 的表达 (铁氟龙), 溶酶体基因的主调节因子下调, TFEB 的过度表达仅部分恢复了 3 型神经元的神经退行性过程 2 GD-iPSCs 32. 这些发现为识别遗传和非遗传提供了一条有前途的途径 (表观遗传和/或环境) 影响致病突变的调节剂. 由于 iPSC 可以从具有不同遗传背景的个体中产生, 和基因组位点可以在 iPSC 中作为目标, 从此类 iPSC 获得的疾病相关细胞类型将成为验证新提出的疾病机制和筛选环境因素/小化合物以调节疾病表型不可或缺的工具.

iPSC 剖析 SNP 在多基因疾病和差异药物反应中的作用
许多常见的人类疾病和性状受到多种遗传和环境因素的影响. 多基因疾病是由多种细微多态性的加性遗传引起的, 最终导致受影响的表型. 在 2016, 几乎 5,000 疾病表型已被编录并与 OMIM 中的因果遗传位点联系起来 (http://omim.org/statistics/entry). GWAS 已成功识别出数百种与各种病症相关的遗传变异，并为诊断提供了宝贵的见解, 预后, 以及复杂人类疾病的治疗优化 33. 一个常见的例子, 复杂的多因素疾病是高血压 (HTN). 高血压是美国的主要健康负担. 这大约影响 80 百万人 34 直接患者治疗总计近 40 每年十亿美元 35. 此外, 高血压会增加罹患中风和心力衰竭等晚期心血管疾病的风险 34, 36 许多抗高血压药，例如利尿剂, ACE抑制剂, 血管紧张素受体阻滞剂, 目前有β受体阻滞剂和钙通道抑制剂可用, 但它们对血压的效果因人而异. GWAS 和候选基因的案例研究已经确定了几种可能调节血压或有助于药物药理途径的遗传变异 37. 动物模型已被广泛用于研究高血压等系统性疾病, 然而，它们可能并不总是适合理解人类遗传变异的生物学影响. 获得大量与感兴趣的表型相关的适当组织也很困难 (例如。, 血管平滑肌或内皮) 来自具有特定基因型的人，以测试这些遗传变异的生物学或功能后果. 为了应对此类挑战, 比尔等人。. 构建了一个 iPSC 存储库 17 高血压患者, 其全基因组 SNP 变异以及抗高血压药物的临床反应是可用的 38. iPSC 是从抗高血压反应药物基因组学评估参与者的外周血单核细胞中抽取的血液中产生的 (梨) 学习 39 (https://临床试验.gov/NCT00246519). 比尔等人。. 然后将这些 iPSC 分化为血管平滑肌细胞，并量化它们响应各种生理刺激的收缩 38. 此外, 该研究还证明了 iPSC 能够重现 PRKCA 表达的 SNP 相关修饰. SNP rs16960228 已在多个 GWAS 队列中得到充分记录，与高血压药物反应以及 PRKCA 的差异表达水平相关. 这些数据支持 iPSC 在 GWAS 结果建模中的适用性和转化价值.

Ebert 等人提出了使用 iPSC 进行心血管疾病建模的另一个例子. 40. 艾伯特等人。. 研究了醛酮酶编码基因中的 S​​NP 2 酶, 这会导致心脏保护作用丧失并增加冠状动脉和缺血性心脏病的风险. 心肌细胞 (厘米) 与源自东亚人群的 iPSC 不同，该人群针对常见 ALDH2* SNP 进行了基因分型 (MAF = 0.08), 证明携带 ALDH2* 基因型的 CM 氧化应激和醛副产物 4HNE 积聚水平增加. 这两种副产物的积累导致细胞周期和细胞凋亡信号失调, 这加剧了 ALDH2* 携带者 CM 的损伤并降低了细胞对缺血性挑战的恢复, 从而建立单一 SNP 增加疾病易感性的细胞机制.

最后, 众所周知，不同种族群体对高血压和多种多基因疾病的易感性和药物反应存在差异 (IE。, 非裔美国人 vs. 西欧 美国), 了解此类基于种族背景的 iPSC 库的效用非常重要. 使用 iPSC 应对疾病遗传学多样性的挑战, 张等人. 报告了由不同种族人群构建的 iPSC 银行 41. 合在一起, 这些研究表明，具有定义的 SNP 和表型数据的 iPSC 文库将成为验证 GWAS 识别的 SNP 效果并促进对人类生理和病理条件的机制理解的有用资源.

了解特定风险变异如何在功能上促进潜在的发病机制变得越来越重要. 与单基因疾病中发现的单基因突变相比, SNP 变异的影响通常是轻微或微妙的. 利用同基因细胞来解码此类基因变异的意义非常重要. 基因组编辑技术的最新进展 (例如。, CRISPR/Cas9系统) 简化了功能研究中针对特定基因位点的能力. iPSC 中的基因编辑方法已在其他地方进行了详细回顾 42, 43. 索尔德纳等人. 证明了 GWAS 识别的帕金森病风险变异在源自人类 iPSC 的神经元中的功能联系 44. 他们专注于帕金森病相关风险 SNP, 它们位于α-突触核蛋白中 (SNCA) 基于全基因组表观遗传信息的调控区域. 通过建立用于定量逆转录聚合酶链反应的 TaqMan SNP 基因分型测定, 他们能够监测位于 SCNA 增强子区域的两个 SNP 之间 SNCA 等位基因特异性转录的细微变化. 作为后续方法, 他们使用 CRISPR/Cas9 系统敲除 SNP 的单个等位基因，以观察 SNP 如何影响 SNCA 表达. 他们发现等位基因特异性表达大致转化为总 SNCA 表达的增加 1.06 神经元的时间和 1.18 神经前体的时间. 此外, 揭示了大脑特异性转录因子 EMX2 和 NKX6-1 在该位点上的序列依赖性结合.

作为下一代遗传关联研究的一部分 (下一代) 程序, 各领域研究人员现正在沉淀iPSC资源, 由代表各种条件以及健康对照的个体生成, 目的是通过机制研究来跟踪功能基因组学的发现. 该计划旨在从超过 1,500 个人，其中一些可通过公共 iPSC 银行获得 (http://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/collections/collections.cmsx). 每个 iPSC 系都与临床数据相关联 (例如。, 血脂状况, QT 间期和心电图心脏特征, 肺高血压) 还有年龄, 性别和种族背景. SNP 基因分型, 基因表达, ‐未来将提供这些产品线的组学分析数据.

高质量的 iPSC 系还必须与高质量的遗传和临床数据相结合，这一点至关重要. 这可以通过大型合作来促进，通过既定的诊断标准和准确的表型定义产生协调的表型, 最终目标是减少表型变异. 表型定义得越准确, 识别罪魁祸首基因和遗传变异的可能性越高 45. 有了这样标准化的表型, 可以取得基因发现及其复制的进步, 可以使用相关组织进行 iPSC 研究. Akawi 等人的一项研究. 表明如果不与患者的高质量表型数据相结合，深度测序信息的价值就会降低 46. 可以在这里进行类比，因为我们认为如果我们没有准确定义的临床表型（最终将转化为培养皿中的细胞表型），iPSC 的价值就会降低. 所以, 对于合作遗传联盟来说，建立表型确定程序以获取 iPSC 建模的最大效益变得越来越重要.

iPSC 可以理解 GWAS 之外的遗传和表型变异
最近的研究表明，特别罕见的基因变异, 例如导致罕见病理的纯合变异缺陷, 也可以与更常见疾病的风险增加联系起来. 例如, 具有导致戈谢病的致病性 GBA 突变 (GD) 28 (例如。, N370S, L444P) 在一个等位基因中 (载体) 通常不会表现出 GD 的全部症状, 但确实会增加患帕金森病的风险 47, 48. PD 中 GBA 突变的优势比大于 5, 与 GWAS 发现的风险位点相比异常高 49. 另一方面, 有一个例子，罕见的遗传变异对复杂疾病具有保护作用. SLC30A8 编码胰岛锌转运蛋白 (锌T8) ZnT8 被认为是胰腺 β 细胞胰岛素分泌的关键调节因子. 50. 此外, 大规模 GWAS 发现了一个常见变异 (p.Trp325Arg) 在 SLC30A8 上会导致类型风险增加 2 糖尿病 (T2D) 51-53. 使用该变体进行的动物研究, 然而, 对 T2D 发病机制显示出相互矛盾的结果. 国际合作研究取得突破, 旨在寻找针对 T2D 的功能丧失变异. 对以上数据进行排序 150,000 人们鉴定出杂合个体的无意义变异 (p. 精氨酸 138*) 在芬兰的一个队列中展示了 60% 降低类型风险 2 糖尿病 54. 最近, 陈等人. 提出了相反的方法来寻找能够抵抗高度渗透性遗传性儿童疾病的健康个体. 他们测序了 874 基因在 589,306 基因组并发现 13 成年人携带突变 8 严重孟德尔病症，未报告指定疾病的临床表现 55. 这可能是发现保护性遗传变异的第一步, 预计将进行进一步的机制研究. 如上所述, iPSC 将作为一个强大的工具来剖析遗传关联的分子机制, 希望带来新的治疗发现.

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结论
收集人类疾病遗传学知识, 我们开始意识到，每个人都有一组独特的变异，这些变异有助于对多种疾病的易感性和保护作用. 即使在罕见的单基因疾病中，表型也因其突变类型而异, 遗传背景和环境因素. 进一步推进精准医疗, 剖析这些基因型-表型关联背后的分子机制将变得越来越重要. 人类 iPSC 提供了填补这些知识空白的独特机会, 研究人员通过细胞存储库预计会增加它们的利用率，这使得它们成为下一代疾病基因组学研究的关键试剂 (如图. 1).

数字 1
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干细胞策略推进精准医学. 每个人都有一组独特的基因变异，这些变异会影响对常见疾病的易感性和保护作用。 & 罕见疾病. 人类 iPSC 提供了一个独特的机会来剖析遗传变异在发病机制中的作用. 缩写: 诱导多能干细胞, 诱导多能干细胞.

致谢
这项工作得到了日本医学研究开发机构的部分支持, 亚美德, 罕见病/疑难病实用研究项目, 美国国立卫生研究院 (GM119977 和 DK104194), 美国心脏协会 (16GRNT30980002), 和佛罗里达大学临床与转化科学研究所 (UL1TR001427). NCF 是博士后奖学金 T32 DK074367 的获得者.