人类胚胎干细胞培养方案

人类胚胎干 (胚胎干细胞) 必须监测和照顾细胞以保持健康, 未分化的文化.

至少, 必须每天通过彻底更换培养基来补充培养物，以补充损失的营养并保持培养物不含不需要的分化因子. 尽管在干细胞培养物中少量分化是正常的并且是预期的, 应定期手动清除培养物, 或者 “采摘” 差异化领域. 识别并去除 hES 细胞培养物中的过度分化是维持健康细胞群的基本技术.

协议

1. 维护: 在显微镜下观察文化

从 37°C 培养箱中取出一盘 hES 细胞并带到显微镜下.
低倍观察菌落, 使用 2 倍或 5 倍放大倍率, 评估整体文化素质. 请注意以下事项: 正常中等颜色, 没有任何可见的污染, 总体菌落大小, 质量和密度, 以及任何其他观察结果.
观察中等颜色变化.

由于与 hES 细胞孵育过夜后培养基中 pH 值的变化和营养物质的消耗, 介质将从红色变为 “稻草” 颜色. 如果介质呈紫色, 发生了基本的 pH 变化. 如果介质显得极黄, 介质已酸化. 培养基呈黄色可能是孔中菌落过度拥挤或污染的结果.

介质应始终保持清澈. 虽然培养基中存在一定水平的细胞碎片是正常的, 永远不应该出现多云的情况. 如果观察到高水平的细胞碎片, 培养物不健康并且可能被污染.
如果培养物不需要维持或传代, 可以带到生物安全柜喂食

如果培养物含有超过大约 10% 区分集落, 细胞应该是 “清理干净” 通过手动删除差异区域

如果培养物含有大或密集的菌落, 或MEF饲养层超过 12 几天前, 细胞应该传代

2. 喂养 hES 细胞

在无菌生物安全柜中, 取下培养皿的盖子并吸出用过的培养基. 请勿让移液器尖端接触孔板直接内部以外的任何部分. 如果担心污染, 更改为新的, 无菌移液器.
使用无菌玻璃吸管, 向每个孔中添加适量的温热的 hES 细胞培养基. 用于 6 孔板中的培养, 添加 2.5 每孔毫升培养基.
将板放回培养箱以保持在 37°C， 5% 二氧化碳.

3. 消除 hES 细胞培养物的分化

转换 9 通过将尖端模制在酒精燃烧器的受控火焰上，将英寸玻璃巴斯德移液器移入采摘工具中. 确保移液器尖端密封以防止污染，并呈圆形以避免划伤培养皿的塑料. 使用前使用生物安全柜或采摘外壳中的紫外线光源对采摘工具进行消毒.
删除差异化区域. 分化通常仅发生在 hES 细胞集落的一部分中, 通常沿着边缘或作为中心的孤立点. 如果只有菌落的一部分在分化, 只需要去除差异化区域. 差异化往往可以在一个 “黏” 床单, 首先用拾取工具的末端在集落中画一条线，将分化的细胞与集落的其余部分分开是有帮助的.
一旦菌落碎片被分离, 沿板轻轻滑动拾取工具以分离不需要的细胞. 在此过程中注意不要刮掉菌落之间过多的 MEF 饲养层.
当所有分化细胞从平板中取出时 (并漂浮在介质中), 将培养物放回生物安全柜. 吸出含有分化细胞的培养基并更换为新鲜的 hES 细胞培养基.

4. hES 细胞传代

酶孵育
在无菌生物安全柜中, 取下6孔培养皿的盖子，从待传代的孔中吸出用过的培养基. 请勿让移液器尖端接触孔板直接内部以外的任何部分.
使用无菌玻璃吸管, 添加 1 mL 温热的胶原酶 IV 加入待传代的每个孔中.
将板放回 37°C 培养箱中 5 分钟.
刮取并合并 hES 细胞

将细胞与胶原酶一起孵育后, 显微镜下观察菌落. 酶应该会导致菌落边缘发生微妙但可观察到的变化.
在生物安全柜里, 轻轻地从每个孔中吸出酶并替换为 2.0 mL hES 细胞培养基.
将培养板稍微向您倾斜并拿起 2.0 第一个孔中的 mL 培养基，带有 5 毫升玻璃移液管.

将移液管垂直于板底部, 轻轻地将移液器吸头滑过孔，同时缓慢释放介质.
重复刮擦和移液动作 3-4 次，直到所有菌落都从孔中取出. 轻轻移液以避免将菌落打碎成太小的碎片. 当细胞从第一个孔中取出时, 将内容物留在孔中并开始从下一个孔中刮下细胞.

当所有要通过的孔都已刮完时, 将每个孔中含有菌落碎片的培养基汇集在无菌容器中 15 mL 锥形管.
通过添加冲洗刮擦的孔 1 每孔加入 mL 的 hES 细胞培养基. 收集冲洗液并转移至锥形管中.

将细胞轻轻移入试管中，将集落碎片打碎至所需大小.
离心细胞 5 分钟在 200 克.

电镀 hES 细胞

当 hES 细胞在离心机中时, 准备新的 6 孔 MEF 饲养板. 用适当的 hES 细胞信息标记板: 细胞系, 新通道号, 和通过日期. 从孔中吸出 MEF 介质并添加 1.0 每孔加入 mL PBS. 轻轻旋转孔周围的缓冲液并吸出 PBS 洗液. 添加 1.5 将 mL hES 细胞培养基添加到每个孔中并将板放在一边.

当 hES 细胞完成离心后, 将管子带回生物安全柜. 吸出上清液, 小心不要扰乱松散堆积的细胞沉淀.
用足够的培养基重悬沉淀中的细胞 1 每孔待镀 mL hES 细胞培养基. 当分裂成 6 新井, 将沉淀重新悬浮在 6 毫升介质.

轻轻均匀地添加 1 将细胞悬浮液 mL 加入 MEF 饲养板的每个准备好的孔中.
将板放入 37°C 培养箱中，小心地前后滑动板, 并从一侧到另一侧将细胞均匀分布在整个孔中.
让细胞在 37°C 下贴壁过夜.

5. 代表性结果:

未分化的 hES 细胞很小, 紧密地堆积, 并且通常由较大的, 细胞更加分散.

在低倍显微镜下可以看到不同的形态. 良好的细胞形态包含小, 单层生长的紧密堆积的细胞. 细胞应保持清洁, 定义的边缘, 几乎没有差异.

使用 hES 细胞时必须始终保持无菌. 使用前对生物安全柜及所有设备进行清洁和消毒.

所有试剂必须使用过滤器过滤 0.22 使用前使用微米孔径过滤器. hES 细胞培养中没有必要使用抗生素，应避免使用.

应设立独立环境作为指定拣货站. 工作站的无菌外壳可以是静态外壳 (例如 PCR 工作站) 带紫外光源, 层流罩, 或生物安全柜.

当分化区域被移除时，需要在采摘站内使用解剖显微镜来观察菌落. 必须修改静态外壳或生物安全柜的前玻璃面板，以允许显微镜的目镜延伸穿过面板，而不影响适当的气流和无菌性.

维持健康的 hES 细胞培养, 细胞必须在最佳时间传代, 通常每个 4-7 天. 此时，菌落已达到最大尺寸，可能开始合并. 合并集落可以提高培养物的分化率. 分流比通常介于 1:3 和 1:5, 取决于平板上的菌落数量, 扩张率, 和培养条件.

过度铺板菌落 (分流比太低) 可能会过早合并，需要在达到最大尺寸之前传代.

MEF 饲养层上的培养物超过 2 几周大的必须传代到新的 MEF，以支持无分化的生长和增殖.