小檗碱通过诱导糖酵解改善葡萄糖代谢
https://www.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajpendo.00211.2007
小檗碱, 一种用于控制血糖的植物生物碱 2 中国糖尿病, 最近有报道称可以激活 AMPK. 然而, 目前尚不清楚小檗碱如何激活 AMPK. 在这项研究中, 体内外研究小檗碱的活性和作用机制. 在饮食肥胖大鼠中, 服用 5 周后小檗碱增加胰岛素敏感性. 空腹胰岛素和 HOMA-IR 降低 46 和 48%, 分别, 在老鼠身上. 在包括 3T3-L1 脂肪细胞在内的细胞系中, L6肌管, C2C12肌管, 和H4IIE肝细胞, 小檗碱被发现会增加葡萄糖消耗, 2-脱氧葡萄糖摄取, 以及较小程度的 3-O-甲基葡萄糖 (3-我的天啊) 独立于胰岛素的摄取. 在 IRS-1 没有变化的情况下，小檗碱增强了胰岛素诱导的葡萄糖摄取 (Ser307/312), 阿克特, p70 S6, 和 ERK 磷酸化. 小檗碱增加 AMPK 磷酸化 0.5 小时, 且增加持续≥16 h. 测定有氧和无氧呼吸以了解小檗碱的作用机制. AMPK 的持久磷酸化与 AMP/ATP 比率持续升高和耗氧量减少相关. 观察到糖酵解增加，乳酸产量增加. 小檗碱没有表现出细胞毒性, 它可以保护细胞培养物中 L6 肌管的质膜. 这些结果表明小檗碱通过刺激糖酵解来增强葡萄糖代谢, 这与抑制线粒体中葡萄糖氧化有关. 小檗碱诱导的 AMPK 激活可能是线粒体抑制增加 AMP/ATP 比率的结果.
小檗碱是一种植物生物碱，存在于多种植物的根和树皮中, 包括法国黄连, 一种古老的中药，在中国用于治疗糖尿病已有数千年的历史. 小檗碱是该草药的主要活性化合物. 除了其代谢活动外, 小檗碱在控制细菌感染方面具有成熟的抗菌活性, 病毒, 真菌, 原生动物, 和蠕虫 (8, 14). 是中国治疗胃肠道感染的非处方药. 在 1988, 我国用小檗碱治疗糖尿病患者腹泻时发现小檗碱的降血糖作用 (13). 自那以后, 小檗碱已被中国许多医生用作降血糖药. 中文文献中有很多关于小檗碱降血糖作用的临床报道.
关于小檗碱的作用机制, 我们发现小檗碱增加培养细胞中的葡萄糖代谢, 并且这种活性与观察到的二甲双胍的活性相当 2002 (20). 此活动后来在其他研究中得到证实, AMPK被认为介导小檗碱的代谢活动 (2, 3, 9, 22). 在 2006, 据报道，小檗碱能够激活AMPK，抑制人肝细胞的脂质合成 (2). 据报道，小檗碱可减轻代谢综合征动物模型的体重并改善葡萄糖代谢 (9). 小檗碱被发现可诱导 3T3-L1 脂肪细胞和 L6 肌管中 AMPK 的磷酸化, 并提出AMPK来解释小檗碱的胰岛素增敏作用 (9). 其他两组也观察到小檗碱激活 AMPK 通路 (3, 22). 虽然 AMPK 是被小檗碱激活的, 导致这种效应的代谢条件需要进一步研究. 小檗碱被证明可以抑制分离线粒体中的柠檬酸循环 (1, 11, 12). 然而, 目前尚不清楚是否可以在活细胞中观察到这种活性以激活 AMPK.
在这项研究中, 在糖尿病大鼠中检查小檗碱的代谢活性, 并在细胞模型中研究了其作用机制. 结果表明小檗碱通过诱导糖酵解来刺激葡萄糖代谢. 小檗碱激活 AMPK 与 AMP/ATP 比率增加有关. 抑制线粒体中的葡萄糖氧化可能有助于 AMP/ATP 比率增加和 AMPK 激活.
研究设计和方法
试剂.
DMEM, 3-1-甲基异丁基黄嘌呤 (IBMX), 地塞米松, 胰岛素溶液, 2-脱氧-D-葡萄糖, 3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖, 和细胞松弛素 B 购自 Sigma Chemicals (英石. 路易斯, 莫). 胎牛血清 (胎牛血清) 购自亚特兰大生物制品公司 (劳伦斯维尔, 遗传算法). 葡萄糖显色试剂购自Raichem (圣地亚哥, CA). 2-脱氧-d-[3H]葡萄糖和3-O-d-[甲基14C]葡萄糖购自PerkinElmer (波士顿, 硕士). 磷酸 Akt 抗体 (苏氨酸308) 和磷酸-p70 S6 激酶 (苏氨酸389) 购自 Cell Signaling Technology (丹弗斯, 硕士). 抗山羊 IgG [辣根过氧化物酶 (辣根过氧化物酶) 共轭的], Akt1/2 抗体, 过剩4, 和磷酸-IRS-1 (酪氨酸632) 获自圣克鲁斯生物技术公司 (圣十字, CA). 磷酸-IRS-1 抗体 (Ser307) 是从北部购买的 (夏洛茨维尔, VA). α-微管蛋白和 GLUT1 抗体获自 Abcam (剑桥, 硕士). HRP 缀合的抗兔 IgG 或抗小鼠 IgG 购自 GE Healthcare UK (白金汉郡, 英国). 用于免疫印迹的 PVDF 膜购自 Bio-Rad (赫拉克勒斯, CA). 蛋白测定试剂盒购自Pierce (罗克福德, 伊尔). 动物实验用小檗碱产自湄潭县药材厂, 贵州省, 中国. 用于体外实验的小檗碱来自 Sigma Chemicals (英石. 路易斯, 莫).
动物实验.
雄性Wistar大鼠 (中国学术实验动物中心, 上海, 中国), 2∼3 个月大，体重 ∼240 g, 被单独安置在温控房间的铁丝笼中 (22 ±1℃) 在一个 12:12-h 光暗循环. 这些动物被喂食高脂肪饮食 (高频FD; 猪油, 59% 卡路里) 免费获得食物和水. 动物方案得到机构审查委员会的批准. 后 6 月 HFD, 将动物分为对照组 (n = 6) 和小檗碱处理 (n = 6) 团体. 小檗碱的施用时间为 125 mg/kg 每天两次 1000 和 2200 通过胃管饲法 5 周. 对照大鼠用等体积的载体灌胃 (蒸馏水). 治疗5周后, 腹腔内葡萄糖耐量试验 (前列腺素基因测试) 之间进行 0900 和 1100 禁食 10 小时的动物. 在给予葡萄糖之前，首先通过撕裂尾静脉收集空腹血。 2 克/公斤体重 (40% 葡萄糖溶液). 然后采集血样 2 小时. 使用 LINCO 大鼠胰岛素 RIA 试剂盒检测空腹胰岛素 (英石. 查尔斯, 莫). 稳态模型评估 (霍玛) 方法用于测定胰岛素抵抗 (红外光谱) (10): HOMA-IR = 空腹胰岛素 (微单位/毫升) × 空腹血糖 (毫摩尔/升)/22.5.
细胞.
小鼠成纤维细胞3T3-L1前脂肪细胞, L6大鼠骨骼肌成肌细胞, C2C12小鼠成肌细胞, 大鼠肝癌细胞系H4IIE购自美国典型培养物保藏中心 (马纳萨斯, VA) 并维持在补充有 10% 胎牛血清, 4 mmol/l 谷氨酰胺, 和 50 mg/l 庆大霉素在大气中 5% 37°C 时的二氧化碳. 对于脂肪生成, 3T3-L1 前脂肪细胞在 100 毫米平板中生长至汇合，然后用脂肪形成混合物处理 (5 微克/毫升胰岛素, 0.5 mmol/l IBMX, 和 10 μmol/l 地塞米松) 为了 4 天. 随后在补充胰岛素的培养基中进行额外的培养 3 天. 白天使用普通培养基 7 以维持脂肪细胞 (6). 用于肌管的分化, L6细胞在DMEM中培养 10% 胎牛血清 24 小时. 然后将细胞维持在 2% 胎牛血清培养基 (α-MEM) 为了 6 诱导分化天数. 介质每更换一次 48 小时 (15). 对于C2C12细胞, DMEM 补充 2% 马血清用于诱导分化. 诱导过程与L6细胞相似 (16).
葡萄糖消耗.
将细胞培养在96孔组织培养板中. 进行实验时, 将正常培养基更换为DMEM，并添加 0.25% 牛血清白蛋白 (牛血清白蛋白). 然后, 用小檗碱和/或胰岛素处理细胞 (最终浓度 100 纳摩尔/升) 为了 24 小时. 葡萄糖氧化酶法测定培养基中的葡萄糖浓度. 空白孔的葡萄糖减去有细胞的孔的葡萄糖，即为葡萄糖消耗量 (20).
葡萄糖摄取.
3T3-L1前脂肪细胞, L6, 或C2C12成肌细胞在12孔板中分化为成熟脂肪细胞或肌管. 对于2-脱氧葡萄糖 (或 3-OMG) 摄取, 小檗碱在无血清 DMEM 中处理后 0.25% 牛血清白蛋白 16 小时, 用胰岛素处理细胞 (200 纳摩尔/升) 为了 20 分钟，37°C，PBS 中 (1 毫升/孔). PBS 洗涤后, 将细胞培养在 1 含 PBS 毫升 0.1 mmol/l 2-脱氧-D-葡萄糖 (或 3-O-甲基-D-葡萄糖) 和 1 μCi/ml 2-脱氧-d-[3H]葡萄糖 (或 3-O-d-[甲基14C]葡萄糖) 为了 5 分钟. 然后, 细胞在冰冷的 PBS 中洗涤两次并在 0.4 毫升 1% 十二烷基硫酸钠. [3H]葡萄糖 (或者 [14C]葡萄糖) 含量测定于 4 使用 Beckman LS6500 闪烁计数器的 ml 闪烁剂. 非特异性葡萄糖摄取是在存在以下物质的情况下测量的 20 μmol/l 细胞松弛素 B 并从总摄取量中减去，以获得具体的葡萄糖摄取量 (6, 18).
蛋白质印迹法.
在无血清培养基中用小檗碱处理细胞 0.25% 牛血清白蛋白. 在一些实验中, 胰岛素 (200 纳摩尔/升) 已添加 20 细胞收集前分钟. 通过在裂解缓冲液中超声处理来制备全细胞裂解物 (1% 海卫一 X-100, 50 毫摩尔/升氯化钾, 25 毫摩尔/升 HEPES, 酸碱度 7.8, 10 μg/ml 亮肽素, 20 μg/ml 抑肽酶, 125 μmol/l 二硫苏糖醇, 1 mmol/l 苯甲基磺酰氟, 1 mmol/l 原钒酸钠). 蛋白质 (100 微克) 被煮沸了 5 分钟, 解决于 7% 小型 SDS-PAGE 用于 90 我的那个 100 V, 并印迹于聚偏二氟乙烯膜上 (伯乐公司). 在牛奶缓冲液中预印迹后 30 分钟, 将膜用一抗印迹 2-12 小时，用二抗印迹 2-12 小时。 30 分钟. HRP 标记的二抗与化学发光试剂一起使用 (珀金埃尔默生命科学) 用于产生光信号. 检测来自一张膜的多个信号, 膜用剥离缓冲液处理 (0.5 摩尔/升氢氧化钠) 为了 20 每个印迹循环后分钟以去除结合的抗体. 所有实验均进行了 3 次 (5). ImageJ 1.37V 用于量化 Western 信号.
LDH细胞毒性测定.
3T3-L1脂肪细胞和L6肌管在24孔板中培养. 小檗碱治疗后 24 h 在无血清 DMEM 中补充 0.25% 牛血清白蛋白, 乳酸脱氢酶 (乳酸脱氢酶) 使用 LDH-细胞毒性测定试剂盒 II 检测培养基中的浓度 (生物视野, 山景城, CA).
耗氧量.
耗氧量在 BD 氧气生物传感器系统中进行 (BD生物科学公司, 贝德福德, 硕士). 分化后, 将 3T3-L1 脂肪细胞或 L6 肌管进行胰蛋白酶处理，并铺板至嵌入氧敏感染料的 DMEM 培养基中，并补充 10% 胎牛血清. 后 6 小时, 小檗碱和/或胰岛素 (最终浓度 100 纳摩尔/升) 添加到介质中. 在不同时间读取荧光读数. 耗氧量单位为标准化相对荧光单位 (漂移), 将细胞的荧光值除以空白孔的值得到.
腺嘌呤核苷酸含量测定.
3T3-L1脂肪细胞和L6肌管在六孔板中培养. 他们接受了治疗 5 µmol/l 小檗碱 0.5 或者 16 h 在无血清培养基中 0.25% 牛血清白蛋白. 然后使用高效液相色谱法测定细胞的ATP和AMP含量 (高效液相色谱法) 正如 Wynants 等人所描述的. (17). 简而言之, 细胞被溶解在 0.6 N HClO4 并用中和 1 碳酸氢钾. HPLC 分析是在 HPLC 系统上开发的 (沃特斯三角洲 600, 沃特斯, 米尔福德, 硕士) 由溶剂输送泵单元组成 (沃特斯 600), 自动进样器 (沃特斯 717 加), 和紫外-可见二极管阵列检测器 (沃特斯 2996 光电二极管阵列探测器, 190–800纳米). 该系统由计算机控制并使用 Empower 软件系统进行分析 (沃特斯三角洲 600). 使用 Atlantis T3 柱进行分离 (5.0 微米, 4.6 × 150 内径毫米; 沃特斯) 带保护柱 (4.6 × 20 内径毫米; 沃特斯). 流动相由水性缓冲液组成，其中含有 0.15 中号磷酸 (10 毫升 85% H3PO4/升) 调节pH值 6.00 与氢氧化铵 (～8毫升; 一个) 以及乙腈和甲醇的混合物 (50:50, 体积/体积; 乙). 最佳流动相设置如下: 0–5 分钟, 100% 一个; 5–25 分钟, 梯度 A/B = 90:10; 流量设置为 0.7 毫升/分钟, 波长设置为 259 纳米. ATP 和 AMP 出现在 9.6 和 18.1 分钟, 分别.
乳酸测定.
将细胞培养在 24 孔板中，并用小檗碱和/或胰岛素在无血清 DMEM 中处理，并补充 0.25% 牛血清白蛋白. 采用生物医学研究服务中心的乳酸测定试剂盒检测培养基中的乳酸浓度, 布法罗大学 (水牛, 这).
统计分析.
数据表示为平均值±SE. 所有细胞实验至少进行三次. 当进行单次比较时, 通过学生 t 检验分析平均值之间差异的显着性. 当进行多重比较时, 通过单向方差分析分析显着性 (统计软件 12.0). 当发现显着效果时, 平均值之间的差异由费舍尔最小显着差异事后检验确定. P水平设定为 0.05.
结果
小檗碱改善饮食肥胖大鼠的胰岛素敏感性.
在这项研究中, 使用饮食肥胖大鼠作为胰岛素抵抗的动物模型. 在 6 莫在 HFD 上, Wistar 大鼠在禁食和进食条件下血糖显着升高. 小檗碱治疗 5 周, 两者均是空腹血糖 (光纤光栅) 和餐后血糖 (PBG) 在饮食肥胖大鼠中显着减少 (如图. 1一个). FBG 减少为 5.74 到 5.39 毫摩尔/升 (P= 0.035). PBG 减少为 10.4 到 7.6 毫摩尔/升 (P= 0.039), 接近正常的血糖水平. 空腹胰岛素水平降低 46% (P= 0.045; 如图. 1乙). 小檗碱显着提高胰岛素敏感性, 如a所示 48% 减少 (P= 0.036; 如图. 1C) 在 HOMA-IR 中….
