berberine通过诱导糖酵解来改善葡萄糖代谢

 

https://www.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajpendo.00211.2007

 

 

berberine, 用于控制类型血糖的植物生物碱 2 中国的糖尿病, 最近据报道激活AMPK. 然而, 目前尚不清楚berberine如何激活AMPK. 在这项研究中, activity and action mechanism of berberine were investigated in vivo and in vitro. In dietary obese rats, berberine increased insulin sensitivity after 5-wk administration. Fasting insulin and HOMA-IR were decreased by 46 和 48%, 分别, in the rats. In cell lines including 3T3-L1 adipocytes, L6 myotubes, C2C12 myotubes, and H4IIE hepatocytes, berberine was found to increase glucose consumption, 2-deoxyglucose uptake, and to a less degree 3-O-methylglucose (3-OMG) uptake independently of insulin. 胰岛素诱导的葡萄糖摄取可通过berberine增强，而IRS-1没有变化 (SER307/312), akt, P70 S6, 和ERK磷酸化. Berberine AT增加了AMPK磷酸化 0.5 h, 而且增加≥16小时. 确定有氧和厌氧呼吸以了解berberine作用的机制. AMPK的持久磷酸化与AMP/ATP比的持续升高和氧气消耗降低有关. 观察到糖酵解的增加，乳酸产生增加. 小ber虫没有细胞毒性, 并保护细胞培养中L6肌管中的质膜. 这些结果表明，小ber碱通过刺激糖酵解增强葡萄糖代谢, 这与线粒体中葡萄糖氧化的抑制有关. berberine诱导的AMPK激活可能是线粒体抑制的结果，该抑制增加了AMP/ATP比.

berberine是几种植物的根和树皮的植物生物碱, 包括Coptis Chinensis法语, 一种古老的中国草药，用于治疗糖尿病数千年. berberine是草药的主要活性化合物. 除了代谢活动, berberine在细菌控制感染中具有良好的抗菌活性, 病毒, 真菌, 原生动物, 和Helminthes (8, 14). 这是一种用于治疗中国胃肠道感染的非处方药. 在 1988, 当中国糖尿病患者的腹泻治疗腹泻时，发现小ber碱的降血糖作用 (13). 自那以后, 中国许多医生已将berberine用作抗血糖剂. 有许多关于berberine在中国文学中的降低血糖作用的临床报道.

关于berberine动作的机制, 我们发现，小berine增加了培养细胞中的葡萄糖代谢, 并且该活动与观察到的二甲双胍在 2002 (20). 此活动后来在其他研究中得到了证实, 并提议AMPK调解小ber碱的代谢活动 (2, 3, 9, 22). 在 2006, 据报道，berberine能够激活AMPK以抑制人肝细胞中脂质合成 (2). 据报道，小ber碱可以减轻体重并改善代谢综合征动物模型中的葡萄糖代谢 (9). 发现小ber碱在3T3-L1脂肪细胞和L6肌管中诱导AMPK的磷酸化, 并提出了AMPK来解释berberine的胰岛素敏感性 (9). 其他两组也观察到了berberine的AMPK途径的激活 (3, 22). 虽然AMPK被Berberine激活, 导致这种作用的代谢条件需要进一步研究. berberine被证明可以抑制分离的线粒体中的柠檬酸周期 (1, 11, 12). 然而, 目前尚不清楚是否可以在活细胞中观察到这种活动以进行AMPK激活.

在这项研究中, 在糖尿病大鼠中检查了小ber碱的代谢活性, 并在细胞模型中研究了动作机制. 结果表明，小berine通过诱导糖酵解刺激葡萄糖代谢. Berberine激活AMPK与AMP/ATP比的增加有关. Inhibition of glucose oxidation in mitochondria may contribute to the AMP/ATP ratio increase and AMPK activation.

RESEARCH DESIGN AND METHODS
Reagents.
DMEM, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin solution, 2-deoxy-d-glucose, 3-O-methyl-d-glucopyranose, and cytochalasin B were purchased from Sigma Chemicals (英石. 路易, 莫). 胎牛血清 (FBS) was purchased from Atalanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Glucose color reagent was purchased from Raichem (圣地亚哥, CA). 2-Deoxy-d-[3h]glucose and 3-O-d-[methyl-14C]glucose were purchased from PerkinElmer (波士顿, 马). Antibodies to phospho-Akt (Thr308) and phospho-p70 S6 kinase (Thr389) were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, 马). Anti-goat IgG [horseradish peroxidase (HRP) conjugated], antibodies to Akt1/2, GLUT4, and phospho-IRS-1 (Tyr632) were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antibody to phospho-IRS-1 (Ser307) was purchased from Upstate (Charlottesville, VA). 从ABCAM获得了α-微管蛋白和GLUT1的抗体 (剑桥, 马). 与HRP偶联的抗兔IgG或抗小鼠IgG购自英国GE Healthcare (白金汉郡, 英国). 用于免疫印迹的PVDF膜购自Bio-Rad (大力神, CA). 蛋白质测定套件购自Pierce (罗克福德, il). 动物实验的小ber碱来自梅坦县的Materia Medica工厂, 瓜苏省, 中国. 用于体外实验的小ber碱是来自Sigma化学物质的 (英石. 路易, 莫).

动物实验.
雄性Wistar老鼠 (实验动物中国学术中心, 上海, 中国), 2约3个月大，〜240 g身体wt, 分别安装在温度控制的房间中的电线笼中 (22 ±1°C) 在 12:12-H浅黑色周期. 这些动物被喂食高脂饮食 (HFD; 猪油, 59% 卡路里) 免费获得食物和水. 动物协议已获得机构审查委员会的批准. 后 6 Mo在HFD上, 将动物分为控制 (n = 6) 和berberine治疗 (n = 6) 组. Berberine在 125 每天两次mg/kg 1000 和 2200 通过胃烤 5 WK. 用相等的车辆大鼠大鼠进行控制大鼠 (蒸馏水). 5周处理后, 腹膜内葡萄糖耐量测试 (ipgtt) 是在之间进行的 0900 和 1100 在10-H禁食的动物上. 首先通过将尾静脉拉开，然后在葡萄糖下于 2 g/kg身体wt (40% 葡萄糖溶液). 然后在 2 h. 使用林肯大鼠胰岛素RIA套件检测到禁食胰岛素 (英石. 查尔斯, 莫). 体内平衡模型评估 (霍马) 方法用于确定胰岛素抵抗 (Homa-ir) (10): homa-ir =禁食胰岛素 (μU/ml) ×禁食葡萄糖 (mmol / l)/22.5.

细胞.
小鼠成纤维细胞3T3-L1前脂肪细胞, L6大鼠骨骼肌细胞, C2C12鼠标成肌细胞, 大鼠肝癌细胞系H4IIE购自美国类型文化收藏 (马纳萨斯, VA) 并保存在补充的DMEM培养基中 10% FBS, 4 Mmol/L谷氨酰胺, 和 50 Mg/L庆大霉素在一种气氛中 5% 二氧化碳在37°C下. 用于掺杂, 3将T3-L1前脂肪细胞生长至100毫米板中的汇合，然后用脂肪鸡尾酒处理 (5 μg/ml胰岛素, 0.5 MMOL/L IBMX, 和 10 μmol/L地塞米松) 为了 4 天. 接下来是在胰岛素支持的培养基中孵育 3 天. 白天使用正常培养基 7 维持脂肪细胞 (6). 差异化肌管, 在DMEM中培养L6细胞 10% FBS 24 h. 然后将细胞保持在 2% FBS培养基 (α-manem) 为了 6 诱导分化的天数. 媒介每次更改 48 h (15). 用于C2C12细胞, DMEM补充 2% horse serum was used to induce differentiation. The inducing process was similar to that of L6 cells (16).

Glucose consumption.
The cells were cultured in 96-well tissue culture plates. When experiments were conducted, the normal culture medium was replaced by DMEM supplemented with 0.25% bovine serum albumin (BSA). 然后, the cells were treated with berberine and/or insulin (final concentration 100 nmol/l) 为了 24 h. The glucose concentration in medium was determined by the glucose oxidase method. The glucose of the wells with cells was subtracted from the glucose of the blank wells to obtain the amount of glucose consumption (20).

Glucose uptake.
3T3-L1 preadipocytes, L6, or C2C12 myoblasts were differentiated into mature adipocytes or myotubes in a 12-well plate. For 2-deoxyglucose (or 3-OMG) uptake, after berberine treatment in serum-free DMEM with 0.25% BSA for 16 h, 用胰岛素处理细胞 (200 nmol/l) 为了 20 在PBS中的37°C下的最小值 (1 ML/好). 在PBS洗涤后, 细胞在 1 ML包含PBS的ML 0.1 Mmol/L 2-脱氧-D-葡萄糖 (或3-O-甲基-D-葡萄糖) 和 1 μCI/ml 2-脱氧-D-[3h]葡萄糖 (或3-O-D-[methyl-14C]葡萄糖) 为了 5 最小. 然后, 将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，然后裂解 0.4 ml 1% 十二烷基硫酸钠. [3h]葡萄糖 (或者 [14c]葡萄糖) 确定内容在 4 使用Beckman LS6500闪烁计数器的闪烁剂毫升. 在存在的情况下测量非特异性葡萄糖摄取 20 μmol/l细胞切拉斯蛋白B并从总摄取中减去以获得特定的葡萄糖摄取 (6, 18).

蛋白质印迹.
细胞在无血清培养基中用berberine处理 0.25% BSA. 在某些实验中, 胰岛素 (200 nmol/l) 添加了 20 细胞收集前的最低. 整个细胞裂解物是通过裂解缓冲液中的超声处理制成的 (1% Triton X-100, 50 MMOL/L KCL, 25 MMOL/L HEPES, ph 7.8, 10 μg/ml亮肽素, 20 μg/ml折蛋白, 125 μmol/l二硫代醇, 1 Mmol/L苯基磺酰基氟化物, 1 MMOL/L钠刚烷酸钠). 蛋白质 (100 μg) 被煮沸了 5 最小, 解决 7% 迷你-sds页面 90 我的 100 v, 并在聚偏二氟乙烯膜上印迹 (生物拉德). 在将牛奶缓冲区预先列出之后 30 最小, 用第一种抗体将膜印迹2-12小时，辅助抗体的 30 最小. 将HRP偶联的二抗与化学发光试剂一起使用 (Perkinelmer Life Sciences) 用于生成光信号. 从一个膜检测多个信号, 膜用剥离缓冲液处理 (0.5 mol/l naOH) 为了 20 每次印迹循环以去除结合抗体后的最小值. 所有实验均进行了三次 (5). ImageJ 1.37V用于量化西部信号.

LDH细胞毒性测定法.
3在24孔板中培养T3-L1脂肪细胞和L6肌管. 小ber碱治疗 24 h在补充的无血清DMEM中 0.25% BSA, 乳酸脱水酶 (LDH) 用LDH-胞毒性测定试剂盒II检测到培养基中的浓度 (Biovision, 山景, CA).

消耗氧.
在BD氧生物传感器系统中消耗氧 (BD生物科学, 贝德福德, 马). 分化后, 将3T3-L1脂肪细胞或L6肌管胰蛋白酶胰蛋白酶化，并将其镀至嵌入了氧气敏感染料的DMEM培养基中的板上 10% FBS. 后 6 h, berberine和/或胰岛素 (final concentration 100 nmol/l) 被添加到媒介中. 在不同的时间进行荧光读数. 氧气消耗的单位是归一化的相对荧光单元 (漂移), 通过将细胞的荧光值除以空白井的值而获得.

腺嘌呤核苷酸含量分析.
3T3-L1脂肪细胞和L6肌管在六孔板中培养. 他们接受了治疗 5 μmol/l berberine 0.5 或者 16 h在无血清培养基中 0.25% BSA. 然后使用高性能液相色谱测量细胞的ATP和AMP含量 (HPLC) 如Wynants等人所述. (17). 简而言之, 细胞裂解 0.6 N HClo4，并用 1 N KHCO3. HPLC分析是在HPLC系统上开发的 (沃特斯三角洲 600, 水, 米尔福德, 马) 由溶剂输送泵单元组成 (水 600), 一个自动采样器 (水 717 加), 和UV-VIS二极管阵列检测器 (水 2996 光电二极管阵列检测器, 190–800 nm). 该系统由计算机控制和使用Empower软件系统进行分析 (沃特斯三角洲 600). 使用Atlantis T3柱进行分离 (5.0 μm, 4.6 × 150 MM ID; 水) 带有后卫专栏 (4.6 × 20 MM ID; 水). 移动阶段由一个含有水缓冲液组成 0.15 M磷酸 (10 ml 85% H3PO4/升) 调整为pH 6.00 与氢氧化铵 (约8毫升; 一个) 以及乙腈和甲醇的混合物 (50:50, 卷/卷; b). 最佳流动阶段的设置如下: 0–5分钟, 100% 一个; 5–25分钟, 梯度到a/b = 90:10; 流量设置为 0.7 ml/min, 波长设置在 259 NM. ATP和AMP出现在 9.6 和 18.1 最小, 分别.

乳酸分析.
将细胞培养在24孔板中，并在补充的无血清DMEM中用berberine和/或胰岛素处理 0.25% BSA. 用生物医学研究中心的乳酸测定试剂盒检测到培养基中的乳酸浓度, 布法罗大学 (水牛, 这).

统计分析.
数据以均值±SE表示. 细胞中的所有实验至少一式三份进行. 进行一次比较时, 学生的t检验分析了均值之间差异的重要性. 进行多次比较时, 通过单向方差分析分析了显着性 (SPSS 12.0). 当发现显着效果时, 均值之间的差异是通过Fisher事后测试后的最小显着差异确定的. P级设置为 0.05.

结果
小ber碱改善了饮食肥胖大鼠的胰岛素敏感性.
在这项研究中, 饮食肥胖大鼠被用作胰岛素抵抗的动物模型. 在 6 MO在HFD上, 在禁食和喂养条件下，Wistar大鼠的血糖显着升高. 用小ber碱治疗5周, 两者都禁食血糖 (FBG) 和餐后血糖 (PBG) 饮食肥胖大鼠大大减少了 (如图. 1一个). FBG从 5.74 到 5.39 mmol / l (p = 0.035). PBG从 10.4 到 7.6 mmol / l (p = 0.039), which is close to the normal glucose level. Fasting insulin level was decreased by 46% (p = 0.045; 如图. 1b). The insulin sensitivity was increased significantly by berberine, as indicated by a 48% 减少 (p = 0.036; 如图. 1c) in HOMA-IR….