Human Embryonic Stem Cells Cultivation Protocol

 

Tige embryonnaire humaine (IL) les cellules doivent être surveillées et soignées afin de maintenir une bonne santé, cultures indifférenciées.

At minimum, the cultures must be fed every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, ou “picking” differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Protocole

1. Entretien: Observing Cultures Under the Microscope

Remove one plate of hES cells from the 37°C incubator and bring to the microscope.
Observe the colonies at low power, using 2X or 5X magnification, to assess the overall culture quality. Note the following: couleur moyenne normale, absence de toute contamination visible, taille globale de la colonie, qualité et densité, et toute autre observation.
Observer les changements de couleur moyens.

En raison du changement de pH et de l'épuisement des nutriments dans le milieu après une nuit d'incubation avec les cellules hES, le médium passera d'une teinte rouge à un “paille” couleur. Si le support apparaît violet, un changement basique de pH s'est produit. Si le support apparaît extrêmement jaune, le milieu s'est acidifié. Un milieu très jaune peut être le résultat de colonies extrêmement surpeuplées dans le puits ou d'une contamination..

Le support doit toujours paraître clair. Bien qu'un certain niveau de débris cellulaires dans le milieu soit normal, il ne devrait jamais paraître nuageux. Si un niveau élevé de débris cellulaires est observé, la culture n'est pas saine et peut être contaminée.
Si les cultures ne nécessitent ni entretien ni passage, ils peuvent être emmenés à l'enceinte de sécurité biologique pour être nourris

Si les cultures contiennent plus qu'environ 10% différenciation des colonies, les cellules devraient être “nettoyé” en supprimant manuellement les zones différenciées

Si les cultures contiennent des colonies grandes ou denses, ou la couche d'alimentation MEF est supérieure à 12 jours, les cellules doivent être passées

2. Nourrir les cellules hES

Dans une enceinte stérile de sécurité biologique, retirer le couvercle de la boîte de culture et aspirer le milieu usé. Ne laissez pas la pointe de la pipette toucher une partie de la plaque autre que directement à l'intérieur des puits.. En cas de risque de contamination, changer pour un nouveau, pipette stérile.
Utiliser une pipette en verre stérile, ajouter la quantité appropriée de milieu de culture de cellules hES réchauffé dans chaque puits. Pour les cultures en plaque 6 puits, ajouter 2.5 mL de milieu par puits.
Remettre la plaque dans l'incubateur pour qu'elle reste à 37°C et 5% CO2.

3. Suppression de la différenciation des cultures de cellules hES

Transformer 9 pipettes Pasteur en verre de 1 pouce dans des outils de prélèvement en moulant les pointes sur la flamme contrôlée d'un brûleur à alcool. Assurez-vous que la pointe de la pipette est scellée pour éviter toute contamination et arrondie pour éviter de rayer le plastique de la boîte de culture.. Stériliser les outils de cueillette avant utilisation en utilisant la source de lumière UV dans l'enceinte de sécurité biologique ou l'enceinte de cueillette.
Supprimer les zones différenciées. La différenciation se produit souvent dans une partie seulement d’une colonie de cellules hES, généralement le long des bords ou sous forme de points isolés au centre. Si seulement une section d’une colonie se différencie, seule la zone différenciée doit être supprimée. La différenciation peut souvent décoller de la plaque “collant” feuille, et il est utile de séparer d'abord les cellules différenciées du reste de la colonie en traçant une ligne à travers la colonie avec l'extrémité de l'outil de prélèvement..
Une fois les morceaux de la colonie séparés, faites glisser doucement l'outil de prélèvement le long de la plaque pour détacher les cellules indésirables. Veillez à ne pas trop gratter la couche nourricière MEF entre les colonies au cours de ce processus..
Lorsque toutes les cellules différenciées sont retirées de la plaque (et flottant dans le milieu), remettre la culture dans l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le milieu contenant les cellules différenciées et le remplacer par du milieu de culture de cellules hES fraîches.

4. Passage des cellules hES

Incubation enzymatique
Dans une enceinte stérile de sécurité biologique, retirer le couvercle de la boîte de culture 6 puits et aspirer le milieu usé des puits à passer. Ne laissez pas la pointe de la pipette toucher une partie de la plaque autre que directement à l'intérieur des puits..
Utiliser une pipette en verre stérile, ajouter 1 mL de collagénase IV réchauffée dans chaque puits à faire passer.
Remettre la plaque dans l'incubateur à 37°C pour 5 minutes.
Grattage et regroupement des cellules hES

Après avoir incubé les cellules avec de la collagénase, observer les colonies au microscope. L'enzyme devrait provoquer un changement subtil mais observable dans les limites de la colonie.
Dans l'enceinte de sécurité biologique, aspirez doucement l'enzyme de chaque puits et remplacez-la par 2.0 mL de milieu de culture cellulaire hES.
Inclinez légèrement la plaque de culture vers vous et saisissez le 2.0 mL de milieu dans le premier puits avec un 5 Pipette en verre ml.

Tenir la pipette perpendiculairement au bas de la plaque, faites glisser doucement la pointe de la pipette sur le puits tout en libérant lentement le milieu.
Répétez le mouvement de grattage et de pipetage 3-4 fois jusqu'à ce que toutes les colonies aient été retirées du puits. Pipeter doucement pour éviter de briser les colonies en morceaux trop petits. Lorsque les cellules ont été retirées du premier puits, laissez le contenu dans le puits et commencez à gratter les cellules du puits suivant.

Lorsque tous les puits à traverser ont été grattés, regrouper le milieu contenant les morceaux de colonies de chaque puits dans un récipient stérile 15 Tube conique ml.
Rincer les puits grattés en ajoutant 1 mL de milieu de culture cellulaire hES dans chaque puits. Récupérez ce rinçage et transférez-le dans le tube conique.

Pipeter doucement les cellules dans le tube pour briser les morceaux de colonie jusqu'à la taille souhaitée.
Centrifuger les cellules pour 5 minutes à 200 x g.

Placage des cellules cellulaires hES

Pendant que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparer une nouvelle plaque nourricière MEF à 6 puits. Étiquetez la plaque avec les informations appropriées sur les cellules hES: lignée cellulaire, nouveau numéro de passage, et date de passage. Aspirer le milieu MEF des puits et ajouter 1.0 mL de PBS dans chaque puits. Faites tourner doucement le tampon autour des puits et aspirez le lavage PBS. Ajouter 1.5 mL de milieu de culture cellulaire hES dans chaque puits et mettre la plaque de côté.

Lorsque les cellules hES ont fini de centrifuger, ramener le tube à l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire mal emballé.
Remettre en suspension les cellules dans le culot avec suffisamment de milieu pour 1 mL de milieu de culture cellulaire hES par puits à étaler. Lors de la division en 6 nouveaux puits, remettre le pellet dans 6 mL de milieu.

Ajouter doucement et uniformément 1 mL de suspension cellulaire dans chaque puits préparé de la plaque nourricière MEF.
Placez la plaque dans l'incubateur à 37°C et faites glisser délicatement la plaque d'avant en arrière., et d'un côté à l'autre pour répartir uniformément les cellules dans tout le puits.
Laisser les cellules se fixer à 37°C pendant la nuit.

5. Résultats représentatifs:

Les cellules hES indifférenciées sont petites, bien emballé, et se composent généralement de plus grands, cellules plus étalées.

Différentes morphologies peuvent être observées à faible grossissement au microscope. Une bonne morphologie cellulaire contient de petits, cellules étroitement emballées qui se développent en monocouche. Les cellules doivent être propres, bords définis, avec peu ou pas de différenciation.

La stérilité doit être maintenue à tout moment lors du travail avec des cellules hES. Nettoyer et stériliser l'enceinte de sécurité biologique et tout l'équipement avant utilisation.

Tous les réactifs doivent être filtrés à l'aide d'un 0.22 Filtrer la taille des pores en µm avant utilisation. L'utilisation d'antibiotiques dans la culture de cellules hES n'est pas nécessaire et doit être évitée..

 

Un environnement séparé doit être mis en place comme poste de prélèvement désigné. L'enceinte stérile de la station peut être une enceinte statique (comme un poste de travail PCR) avec une source de lumière UV, une hotte à flux laminaire, ou une enceinte de sécurité biologique.

Un microscope à dissection à l'intérieur de la station de prélèvement est nécessaire pour observer les colonies au fur et à mesure que les zones différenciées sont éliminées.. Le panneau de verre avant d'une enceinte statique ou d'une enceinte de sécurité biologique doit être modifié pour permettre aux oculaires du microscope de s'étendre à travers le panneau sans compromettre la bonne circulation de l'air et la stérilité..

Pour maintenir des cultures de cellules HES saines, les cellules doivent être passées au moment optimal, généralement tous les 4-7 jours. A cette époque, les colonies ont atteint leur taille maximale et pourraient commencer à fusionner.. Les colonies fusionnées peuvent augmenter le taux de différenciation de la culture. Les ratios de répartition se situent généralement entre 1:3 et 1:5, en fonction du nombre de colonies étalées, taux d'expansion, et conditions de culture.

Colonies surplaquées (rapport de répartition trop faible) fusionneront probablement prématurément et devront être adoptés avant qu'ils n'atteignent leur taille maximale.

Cultures sur une couche nourricière MEF qui est supérieure à 2 les semaines doivent être transférées à de nouveaux MEF qui soutiendront une croissance et une prolifération indifférenciées.

Puisque la différenciation se produit naturellement dans les cultures de cellules hES, une petite quantité est attendue. Une différenciation fréquente ou excessive peut se produire si les cultures ne reçoivent pas les soins appropriés. Les cellules doivent être nourries quotidiennement, la prolifération entre les passages doit être évitée. Utilisez toujours des réactifs frais.

Tous les médias, Les MEF et les réactifs doivent être utilisés dans 14 jours pour éviter la croissance indifférenciée des cellules hES. Nouveaux lots de réactifs, comme le remplacement du sérum Knockout, FBS et MEF, doit être examiné avant utilisation. N'oubliez pas que toutes les cellules différenciées non retirées avant le passage seront transférées vers les nouvelles cultures..

Aussi, essayez de garder les cellules à 37°C autant que possible. Minimiser le temps que les cellules passent en dehors de l'incubateur (par exemple. sur la platine du microscope ou dans l'enceinte de sécurité biologique.) Une platine de microscope chauffée peut être très bénéfique si les cellules restent dans l'incubateur pendant de longues périodes..

Lors de l'observation des cultures de cellules hES au microscope, évaluez d’abord la qualité globale et la taille de la vue des colonies en utilisant une faible puissance (2x ou 5x) objectif. Si des cellules potentiellement différenciées sont observées à faible puissance, confirmer la morphologie différenciée à l'aide d'un objectif à plus fort grossissement (10X).