Le succinate extracellulaire dérivé des macrophages autorise les cellules souches neurales à supprimer la neuroinflammation chronique

 

Points forts
• Les CSN issus des tissus somatiques ou la reprogrammation directe répriment également la neuroinflammation
• Le succinate extracellulaire active SUCNR1/GPR91 sur les NSC
• Les NSC activés sécrètent la PGE2 et récupèrent le succinate., donc type de reprogrammation 1 députés
• Les CSN mutantes Sucnr1 ont une activité anti-inflammatoire réduite après la transplantation
Résumé
Cellule souche neurale (CNS) la transplantation peut influencer les réponses immunitaires et supprimer l’inflammation du SNC. Métabolites, comme le succinate, moduler le phénotype et la fonction des cellules immunitaires, mais on ne sait pas clairement si et comment les NSC sont également activés par ces immunométabolites pour contrôler l'immunoréactivité et les réponses inflammatoires.. Ici, nous montrons que les NSC somatiques transplantés et induits directement améliorent l'inflammation chronique du SNC en réduisant les niveaux de succinate dans le liquide céphalo-rachidien, diminuant ainsi le nombre de phagocytes mononucléés (Député) infiltration et lésions secondaires du SNC. Les députés inflammatoires libèrent du succinate, qui active le récepteur succinate 1 (SUCNR1)/GPR91 sur les NSC, les amenant à sécréter de la prostaglandine E2 et à éliminer le succinate extracellulaire, avec pour conséquence des effets anti-inflammatoires. Ainsi, nos travaux révèlent un rôle inattendu pour l'axe succinate-SUCNR1 dans les NSC somatiques et directement induits, qui contrôle la réponse des cellules souches aux signaux métaboliques inflammatoires libérés par type 1 Les députés dans le cerveau chroniquement enflammé.

Introduction
Les progrès de la biologie des cellules souches ont fait naître l’espoir que les maladies du SNC pourraient être améliorées par des médicaments à base de cellules souches non hématopoïétiques. (Martino et Pluchino, 2006). Nous avons fourni des preuves irréfutables que la transplantation de cellules souches neurales somatiques (NSC) améliore les caractéristiques clinico-pathologiques des modèles animaux de troubles inflammatoires du SNC. Au-delà du remplacement structurel des cellules blessées du SNC, nos travaux ont montré que les NSC transplantés s'engagent dans des programmes complexes de communication entre la greffe de cellules souches et l'hôte, conduisant globalement au soutien trophique et à la modulation des réponses immunitaires adaptatives et innées (Backulapp et coll., 2009, Backulapp et coll., 2016, Pluchino et Cossetti, 2013, Pluchino et coll., 2005, Pluchino et coll., 2009b). Spécifiquement, Les greffes de NSC réduisent le fardeau de l'inflammation au site de la blessure (Pluchino et coll., 2005, Pluchino et coll., 2009un), diminuer le nombre de caractères 1 phagocytes mononucléés inflammatoires (députés) (Cusimano et coll., 2012), et favoriser la guérison du SNC blessé via des mécanismes encore mal caractérisés.

Cependant, la traduction clinique des thérapies expérimentales NSC est encore limitée par les sources à partir desquelles les NSC humaines (hNSC) sont dérivés (Anderson et coll., 2017), l'immunogénicité intrinsèque des lignées hNSC allogéniques (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Rice et coll., 2013), et la stabilité du « lot de cellules cliniques prévu » (Anderson et coll., 2017, Wright et coll., 2006). NSC autologues et extensibles de manière stable, induits directement (iNSC) provenant des fibroblastes dermiques des patients apparaissent comme une alternative valable aux thérapies NSC (Lu et al., 2013, Meyer et coll., 2015, Thier et coll., 2012). La reprogrammation directe dans les iNSC évite la progression laborieuse vers un état pluripotent et la différenciation ultérieure en lignées souhaitées décrites pour les cellules souches pluripotentes induites. (iPSC) technologie (Meyer et coll., 2015, Thier et coll., 2012). Donc, la fabrication d'iNSC extensibles de manière stable à partir de cellules somatiques représente le moyen le plus réalisable d'obtenir des cellules souches cérébrales autologues pour des applications cliniques en aval (Wörsdörfer et coll., 2013). Cependant, l'efficacité des iNSC directement reprogrammées dans le traitement des troubles inflammatoires du SNC n'a pas encore été testée.

Dans les formes progressives de sclérose en plaques (MS), L'inflammation chronique du SNC est soutenue par l'activation généralisée de MP qui comprennent à la fois les microglies résidentes du SNC et les macrophages infiltrants dérivés des monocytes. (Mallucci et coll., 2015). Les députés sont retrouvés dans les lésions de la substance grise, proche des neurites dégénérés et des corps cellulaires neuronaux (Peterson et coll., 2001), et dans les lésions de la substance blanche, où le bord externe de la microglie activée est associé à des lésions tissulaires chroniques (Bramow et coll., 2010, Prineas et al., 2001). Les zones de substance blanche d'apparence normale sont également caractérisées par une accumulation de MP, ce qui conduit à la formation de nodules microgliaux qui sont à l'origine de la pathologie de la maladie, quelle que soit l'activation concomitante des lymphocytes T (Moll et coll., 2011). Le rôle néfaste de l’inflammation chronique provoquée par les MP dans la SEP progressive est également étayé par des preuves issues de modèles de maladies animales., où sa charge globale est en corrélation avec une fonction neuronale altérée (Planche et al., 2017), atrophie cérébrale (Une veuve est al., 2015), et des réponses régénératives réduites (Jiang et coll., 2014).

L'activation des MP par des stimuli pro-inflammatoires provoque un changement métabolique vers la glycolyse et une réduction de la phosphorylation oxydative (Oxphos) (Kelly et O'Neill, 2015). Des preuves récentes suggèrent que, au sein de ce recâblage métabolique, taper 1 les députés inflammatoires accumulent du succinate, avec des implications physiopathologiques importantes (Tannahill et coll., 2013). Le succinate intracellulaire inhibe l'activité des enzymes prolyl hydroxylases (doctorats), stabilisant ainsi l'élément sensible à l'hypoxie (HIF)-1α et induisant la transcription de l'interleukine (IL)-1b (Tannahill et coll., 2013). En outre, oxydation du succinate par la succinate déshydrogénase (SDH) réutilise les mitochondries de la synthèse d'ATP en espèces réactives de l'oxygène (ROS) production comme signal pro-inflammatoire supplémentaire (Mills et coll., 2016). Taper 1 les MP inflammatoires libèrent également du succinate de manière extracellulaire et régulent positivement son récepteur apparenté au succinate 1 (SUCNR1), un récepteur couplé à la protéine G (également connu sous le nom de GPR91), qui fonctionne comme capteur autocrine et paracrine pour améliorer la production d'IL-1β (Littlewood-Evans et coll., 2016).

En tant que tel, le métabolisme apparaît comme une cible thérapeutique importante pour moduler l’activation des deux macrophages (Kelly et O'Neill, 2015) et microglie (Orihuela et coll., 2016), et les voies liées au succinate ont des fonctions immunomodulatrices clés pour les maladies inflammatoires aiguës et chroniques (Ryu et al., 2003, Tannahill et coll., 2015).

Compte tenu des propriétés immunomodulatrices établies des NSC (Pluchino et Cossetti, 2013), nous avons émis l'hypothèse que les NSC pourraient exercer leurs effets thérapeutiques sur la neuroinflammation chronique en modulant le métabolisme des MP en vue de réduire les dommages secondaires au SNC..

Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la capacité des NSC somatiques et directement induits à contrecarrer les changements métaboliques de type 1 MP inflammatoires in vivo et in vitro. Nous montrons que les iNSC et les NSC transplantés sont fonctionnellement équivalents pour améliorer la neuroinflammation chronique chez les souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Les iNSC/NSC transplantés changent le profil d'activation des microglies résidant dans le SNC et des macrophages infiltrants dérivés de monocytes vers un phénotype anti-inflammatoire, ainsi que réduire les niveaux de succinate immunométabolite dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Les iNSC/NSC diminuent également le succinate extracellulaire libéré par type 1 MPs inflammatoires pour reprogrammer leur métabolisme vers OXPHOS in vitro. Mécaniquement, nous montrons que le succinate sécrété par type 1 Les MP suscitent dans les iNSC/NSC une cascade de signalisation en aval de SUCNR1, ce qui permet leur activité anti-inflammatoire. Cette fonction anti-inflammatoire autorisée par le succinate des iNSC/NSC est médiée par la sécrétion de prostaglandine. (PG) E2, ainsi que par une élimination considérable du succinate extracellulaire. La perte de la fonction Sucnr1 dans les NSC entraîne une réduction significative des activités anti-inflammatoires in vitro et in vivo après une transplantation dans l'EAE.

Notre étude révèle un axe succinate-SUCNR1 qui clarifie la façon dont les NSC répondent aux signaux métaboliques inflammatoires pour inhiber l'activation du type 1 MP dans la neuroinflammation chronique.

Résultats
La transplantation de NSC améliore la neuroinflammation chronique et est associée à une réduction du succinate d'immunométabolite dans le liquide céphalo-rachidien
Nous avons d'abord évalué les effets de la voie intracérébroventriculaire (icv) transplantation au pic de la maladie (PD) d'iNSC ou de NSC chez des souris atteintes d'EAE chronique induite par MOG35-55 et comparé à des souris EAE témoins traitées au PBS. Avant la transplantation, Les iNSC et les NSC ont été élargis, caractérisé (Figure S1), et étiqueté avec du farnésylé (f)GFP in vitro. À 30 jours après la transplantation (département), Les greffes iNSC et NSC ont survécu, distribué, et intégré dans le cerveau et la moelle épinière de l'EAE (Figure S2). Seule une minorité de cellules fGFP+ récupérées (iNSC: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) proliféraient (Figure 1A) ou exprimant neuronal (Figure 1B), astrogliale (Figure 1C), ou oligodendrogliale (Figure 1D) marqueurs de lignée (Figure S2). La majorité (∼75%) Il a été constaté que les iNSC survivant à la transplantation n'exprimaient aucun des marqueurs de la lignée neuronale testés et se localisaient autour de zones de type niche périvasculaire méningée proches des MP endogènes F4/80+. (Figure 1E), comme observé dans les greffes somatiques de NSC (Cusimano et coll., 2012, Pluchino et coll., 2003). La transplantation d’iNSC a induit un effet significatif et durable (jusqu'à 90 département) amélioration des scores EAE, qui a commencé à partir de 15 à 20 départ en avant (Figures 1F et S2). La récupération fonctionnelle a également été confirmée par une analyse automatisée de la marche assistée par ordinateur (Figure S2). Dans l'ensemble, Les iNSC transplantés par icv étaient sûrs et ont conduit à une récupération comportementale et pathologique.

Nous avons ensuite analysé la composition des infiltrats inflammatoires du SNC via cytométrie en flux ex vivo dans iNSC- et souris EAE témoins transplantées par NSC versus souris EAE traitées au PBS. La transplantation d'iNSC ou de NSC n'a eu aucun effet sur la fraction de cellules T infiltrant le SNC, Cellules B, et nombre total de députés, ainsi que dans celui des sous-ensembles de lymphocytes T CD3+/CD4+ (dont Th1, Lundi, Treg, ThGM-CSF, et sous-ensembles Th17) à 30 département (Figure S3). Plutôt, iNSC- ou des souris EAE transplantées par NSC ont montré un changement significatif dans le profil d'activation des cellules CX3CR1+ avec une diminution d'environ 1,5 fois du type CD80+ 1 microglie inflammatoire et augmentation parallèle de la microglie anti-inflammatoire MRC1+ (Figure 1G). De même, Infiltrant le SNC (dérivé des monocytes) Macrophages CCR2+ d'iNSC- ou des souris EAE transplantées par NSC ont subi un changement de phénotype significatif avec une diminution d'environ 1,3 fois du type CD80+ 1 macrophages inflammatoires et augmentation parallèle d'environ 1,8 fois des macrophages anti-inflammatoires MRC1+ (Figure 1H). Cet effet s'est accompagné d'une réduction significative de l'expression du type 1 monoxyde d'azote synthase inductible par marqueur MP inflammatoire (iNOS) par F4/80+ MP in vivo (Figures 1I et S3).

Nous avons ensuite analysé les niveaux d'expression des principaux pro- et des gènes anti-inflammatoires dans l'ensemble du SNC. iNSC- et les souris EAE transplantées par NSC présentaient toutes deux des niveaux significativement réduits d'interleukine-1 bêta (II1b) dans le cerveau et la moelle épinière et augmentation des taux de récepteurs du mannose de type C 1 (Mrc1) dans la moelle épinière, tous deux à 10 département (Figure 1J).

Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans la barrière hémato-encéphalique (BBB) perméabilité à 30 dpt lors de la comparaison d'iNSC-/NSC transplantées avec des souris EAE témoins traitées au PBS (Figure S3).

Enfin, iNSC- et les souris EAE transplantées par NSC ont accumulé une perte axonale considérablement réduite (Figure 1K) et démyélinisation (Figure 1L) dans la moelle épinière.

Compte tenu de l’importance établie du métabolisme dans la régulation du phénotype et de la fonction des MP, nous avons étudié si les greffes de NSC affectaient le microenvironnement métabolique neuroinflammatoire. À cette fin, nous avons réalisé un profilage métabolique non ciblé des métabolites polaires par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) d'échantillons de LCR et de plasma appariés (Tableau S1). Les souris EAE témoins traitées au PBS ont montré une augmentation significative de plusieurs LCR (mais pas le plasma) métabolites, parmi lesquels le succinate n'a culminé qu'à 45 jours après la vaccination (ppp) (correspondant à 30 département; Figure 1M). Les souris EAE non soumises à une intervention chirurgicale ont également montré une augmentation significative du succinate uniquement dans le LCR à 45 ppp (versus des souris témoins saines), ce qui n'était pas différent des niveaux de succinate chez les souris EAE témoins traitées au CSF PBS (Figure S3).

Alors que nous n'avons détecté aucun changement significatif dans les taux plasmatiques de métabolites entre les souris EAE témoins transplantées par iNSC/NSC et traitées au PBS. (Tableau S1), nous avons constaté que la transplantation d'iNSC ou de NSC entraînait une baisse significative du succinate de LCR à 30 département (Figure 1M; Tableau S1).

Plus loin, nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le succinate de LCR en comparant les souris EAE traitées au PBS et les souris EAE ayant reçu une injection icv avec des fibroblastes de souris (MF) comme cellules de contrôle (Figure S3).

Ainsi, Les iNSC et les NSC directement injectés dans le SNC de l'EAE induisent un changement de phénotype spécifique des MP, qui est associé à une réduction du succinate immunométabolite dans le LCR uniquement et à une amélioration de la neuroinflammation chronique.

Les NSC réduisent les niveaux de succinate et reprogramment le métabolisme du type 1 Mφ inflammatoire in vitro
Nous avons ensuite étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les iNSC/NSC affichent des activités anti-inflammatoires de type 1 députés, en utilisant un système in vitro qui récapitule les interactions entre MP et iNSC/NSC. Macrophages naïfs dérivés de la moelle osseuse (Mφ) ont été polarisés en un type 1 phénotype inflammatoire avec LPS (MφLPS), comme décrit (Tannahill et coll., 2013). Les MφLPS ont ensuite été co-cultivées avec des iNSC (MφLPS-iNSC) ou NSC (MφLPS-NSC) dans un système trans-well qui évite les contacts de cellule à cellule (Figure 2A). Des Mφ non polarisés ont été utilisés comme contrôles.

Le profilage de l'expression génique des puces à ADN a montré des changements transcriptionnels significatifs dans MφLPS avec 7,401 gènes affectés (par rapport à Mφ; valeur p ajustée < 0.1; Figure 2B; Tableau S2) et 51 gènes différentiellement exprimés dans les MφLPS-iNSC ou les MφLPS-NSC (versus MφLPS; valeur p ajustée < 0.1; Figures 2B et 2C; Tableau S2). Ce dernier ensemble de gènes a été enrichi dans des processus biologiques liés à la régulation positive de l'activation des leucocytes. (ALLER: 0002696), différenciation des leucocytes myéloïdes (ALLER: 0002761), et les processus du système immunitaire (ALLER: 0002376). La validation indépendante par qRT-PCR de gènes pro-inflammatoires Mφ sélectionnés a confirmé une régulation négative significative des niveaux d'expression d'Il12b, Il15, Il15ra, et Cd69, ainsi que les gènes inflammatoires classiques Nos2, facteur de nécrose tumorale (TNF), et Il1b dans les MφLPS-iNSC et les MφLPS-NSC (versus MφLPS; Figure 2D). Cet effet a été associé à une régulation positive concomitante des niveaux d'expression de gènes associés à un phénotype anti-inflammatoire Mφ., comme l'uronyl-2-sulfotransférase (Oust) et antigène des cellules stromales de la moelle osseuse 1 (Bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et coll., 2015), ainsi que l'arginase 1 (Arg1) et Mrc1 (versus MφLPS; Figure 2E). Lorsque les iNSC/NSC ont été co-cultivées avec un lipopolysaccharide (LPS)-cellules microgliales BV2 de souris activées comme avant, une réduction significative des niveaux d'expression des gènes pro-inflammatoires Nos2 et Il1b a également été observée (Figure 2F).

Relier les profils d’expression génique aux états métaboliques fonctionnels, nous avons évalué le taux de consommation basale d'oxygène (ROC) et taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de MφLPS comme lectures de leur acide tricarboxylique (TCA) activités cycliques et glycolytiques, respectivement. Nous avons constaté une réduction significative de l'OCR et une augmentation significative de l'ECAR dans MφLPS (par rapport à Mφs). Plutôt, Les MφLPS-iNSC et les MφLPS-NSC ont subi une restauration significative des valeurs OCR et ECAR (versus MφLPS; Chiffres 2G et 2H), comme observé dans le passage de Mφ à un phénotype anti-inflammatoire (O'Neill et Pearce, 2016).

Dans le but de clarifier les déterminants métaboliques de ces effets anti-inflammatoires, nous avons effectué une analyse LC-MS non ciblée de la teneur en métabolites à petites molécules extracellulaires et intracellulaires de MφLPS. Comme prévu, La stimulation du LPS a profondément modifié le milieu métabolique extracellulaire et intracellulaire de Mφ (MφLPS) (par rapport à Mφ; Tableau S3). Dans les co-cultures, Les MφLPS-iNSC et les MφLPS-NSC ont tous deux montré une réduction significative du glutamate extracellulaire, GABA, et succinate (versus MφLPS; Figure 2I; Tableau S3). En outre, Les MφLPS-iNSC et les MφLPS-NSC ont également présenté une réduction significative du succinate et de l'itaconate intracellulaires (versus MφLPS; Figure 2J; Tableau S3).

Compatible avec la réduction des niveaux de succinate, nous avons constaté que les MφLPS-iNSC et les MφLPS-NSC présentaient des niveaux significativement réduits de HIF-1α, de l'isozyme M2 de la protéine pyruvate kinase en amont (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figure 2K), ainsi que de l'IL-1β (versus MφLPS; Figure 2L).

Tout à fait, ces données in vitro fournissent la preuve que les iNSC/NSC réduisent l'accumulation de succinate intracellulaire et extracellulaire dans les co-cultures de type 1 des députés incendiaires, les reprogrammer vers un phénotype anti-inflammatoire OXPHOS.

Signaux de succinate via SUCNR1/GPR91 dans les NSC de souris et humaines
Compte tenu de l’importance du succinate comme signal immunométabolique, nous avons étudié si le succinate libéré par type 1 les MP pro-inflammatoires pourraient réguler in situ l’activité des cellules environnantes, y compris celui des iNSC/NSC transplantés.

Nous avons constaté que les iNSC/NSC transplantés étaient détectés à proximité des zones périvasculaires méningées. (Figures 3A et 3B ) et F4/80+ MP (Figure 3C) exprimé SUCNR1 in vivo dans le SNC. SUCNR1 a également été exprimé au niveau protéique sur les iNSC et les NSC in vitro, mais pas dans les MF (Figure 3D).

Pour évaluer plus en détail si SUCNR1 dans les iNSC/NSC était fonctionnellement activé par le succinate, nous avons étudié sa cascade de signalisation en aval in vitro. Lorsqu'il est exposé au succinate (Figure 3E; Rubik et coll., 2008), 34.2% (±7,4%) des iNSC et 31.7% (±6,5%) des NSC ont montré une libération de réserves de calcium intracellulaires (Figures S4 et 3F). Cette réponse a été suivie d'une régulation positive significative de la protéine kinase activée par le mitogène phospho-p38. (Figure 3G), révélateur de son activation. Nous avons confirmé l'expression de SUCNR1 et SUCNR1 également dans les NSC fœtaux humains (hNSC) et les iNSC humaines (hiNSC) (Figures 3H et 3I). Comme dans les iNSC de souris, La signalisation p38 dépendante du succinate a été évoquée dans les hiNSC, mais pas dans les hiNSC prétraitées avec l'inhibiteur sélectif de SUCNR1 4c (Figure 3J).

Ainsi, Les iNSC et NSC de souris et humaines expriment SUCNR1 fonctionnel, qui induit une voie de signalisation en aval de sa stimulation avec le succinate immunométabolite.

La stimulation SUCNR1 initie la sécrétion de prostaglandine E2 par les NSC
Clarifier les conséquences fonctionnelles de la signalisation SUCNR1 dans les NSC, nous avons généré des NSC à partir de souris dépourvues de Sucnr1 (Sucnr1−/− NSC) (Rubik et coll., 2008; Figure S4). Par rapport aux NSC témoins, Les NSC Sucnr1 −/− ont présenté des courbes de croissance et une différenciation similaires in vitro (Figure S4). Cependant, lorsqu'il est exposé au succinate à différents moments et concentrations, Les NSC Sucnr1−/− n'ont montré aucune régulation positive du phospho-p38 (Figure S4). Stimulation avec du glutamate ou de l'ATP + la thapsigargine a induit dans les NSC Sucnr1−/− une réponse calcique similaire à celle des NSC témoins (Figure S4). Au contraire, le traitement au succinate n'a pas provoqué la libération de calcium des réserves intracellulaires (Figure S4), qui indiquait une signalisation SUCNR1 défectueuse dans les NSC Sucnr1−/−.

Nous avons ensuite réalisé une puce à ADN de profilage de l'expression génique après un traitement avec du succinate dans les NSC témoins et les NSC Sucnr1−/− (Tableau S4). Nous avons constaté que la prostaglandine-endoperoxyde synthase 2 (Ptgs2), l'enzyme clé dans la biosynthèse du PG codant pour le PTGS2 inductible, était le gène le plus régulé positivement dans les NSC témoins stimulés par le succinate (changement de pli log2 1.05), mais pas dans les NSC Sucnr1−/− stimulées par le succinate (changement de pli log2 −0,43; Figure 4A). Nous avons validé ces résultats sur Ptgs2 par qRT-PCR, confirmant que ses niveaux d'expression étaient considérablement régulés positivement (2.1- à un changement de 2,7 fois) dans les iNSC et les NSC stimulés par le succinate, alors qu'ils n'étaient pas dans les NSC Sucnr1−/− traités au succinate (Figure 4B).

Compte tenu du rôle de la PGE2 comme régulateur des effets immunosuppresseurs des cellules souches mésenchymateuses (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et coll., 2010), nous avons testé son accumulation dans des milieux de culture tissulaire provenant de iNSC, NSC, et Sucnr1−/− NSC après stimulation avec du succinate. iNSC et NSC, mais pas les NSC Sucnr1−/−, a montré des (>2.5-pli) augmentation de leur libération basale de PGE2 dès 30 min après succinate. Cet effet induit par le succinate a été aboli par un prétraitement avec le bloqueur irréversible du PTGS2 SC-58125. (Figure 4C). Comme dans les iNSC de souris, l'exposition des hiNSC au succinate a provoqué une augmentation significative des concentrations de PGE2 dans les milieux de culture tissulaire, alors que là encore, le prétraitement avec SC-58125 ou 4c a empêché sa libération (Figure 4D).

Pour étendre davantage la pertinence de ces résultats aux co-cultures entre les NSC et les MφLPS, nous avons analysé les niveaux de PGE2 dans les milieux de culture tissulaire. Nous avons constaté que les MφLPS-NSC accumulaient des niveaux plus élevés de PGE2 que les MφLPS., alors que le prétraitement des NSC co-cultivés avec SC-58125 a réduit de manière significative les niveaux de PGE2 (Figure 4E). Le prétraitement des NSC par SC-58125 a également été associé à une augmentation significative de l'expression de Il1b dans MφLPS (Figure 4F) et avec une réduction des valeurs OCR indiquant un phénotype pro-inflammatoire (Figure 4G). Cependant, nous avons remarqué que les NSC prétraitées avec SC-58125 conservaient certains effets anti-inflammatoires résiduels sur MφLPS par rapport aux NSC Sucnr1−/− (Figure 4F). Au contraire, La perte de fonction de Sucnr1 dans les NSC a complètement aboli leurs effets anti-inflammatoires sur MφLPS (Figures 4F et 4G). Nous montrons également que la capacité anti-inflammatoire observée des NSC dépendante de la PGE2 est conservée et pertinente pour les NSC humaines..

En tant que tel, Les hiNSC ont induit une réduction significative de l'expression de Il1b dans MφLPS dans les co-cultures (Figure 4H), qui a été couplé à une restauration des valeurs OCR (Figure 4I) et augmentation des niveaux de PGE2 dans les milieux de culture tissulaire (Figure 4J). Ces effets ont été complètement supprimés par le prétraitement des hiNSC avec l'inhibiteur sélectif de SUCNR1 4c. (Chiffres 4H à 4J).

Ainsi, l'activation de la voie de signalisation SUCNR1 dans les NSC de souris et humaines déclenche la libération de PGE2 conduisant à des effets anti-inflammatoires sur le type 1 députés.

Cependant, des expériences d'inhibition ciblant PTGS2 ou SUCNR1 prévoient que des mécanismes supplémentaires dépendants de SUCNR1 et indépendants de la PGE2 sont susceptibles de jouer un rôle clé dans les effets anti-inflammatoires des NSC..

La stimulation SUCNR1 déclenche l'absorption du succinate par les NSC
Des tableaux d'expression génique de NSC stimulés par le succinate ont révélé que, à part Ptgs2, NaCT/Slc13a5 figurait parmi les gènes les plus régulés positivement chez les espèces sauvages. (POIDS) NSC (changement de pli log2 = 0.49), mais pas dans les NSC Sucnr1−/− (changement de pli log2 = −0,12). SLC13A5 est un co-transporteur dicarboxylate connu pour être impliqué dans le transport du succinate (Srisawang et coll., 2007). Compte tenu de l'épuisement constant du succinate trouvé in vivo dans le LCR des iNSC- ou des souris EAE transplantées par NSC et in vitro en co-cultures avec MφLPS, nous avons émis l'hypothèse que les iNSC/NSC activeraient SLC13A5 pour récupérer le succinate.

Nous avons constaté que l'expression de SLC13A5, ainsi que du co-transporteur dicarboxylate de haute affinité SLC13A3, ont été significativement augmentés dans les iNSC et les NSC, mais pas dans les NSC Sucnr1−/−, lors d'une stimulation par le succinate (Figure 5A). De la même manière, Les hiNSC exposés au succinate ont régulé positivement les niveaux d'expression protéique de ces deux co-transporteurs SLC13 in vitro (Figure 5B).

Nous avons ensuite étudié le rôle de ces co-transporteurs en mesurant l'absorption du succinate dans les iNSC et les NSC.. Nous avons constaté que les iNSC et les NSC accumulaient de manière significative [14C]-succinate (Figure 5C) tout en réduisant la quantité d'extracellulaire [14C]-succinate dans les milieux de culture tissulaire (Figure 5D). Sucnr1−/− NSC ni accumulés [14C]-succinate intracellulaire et ils ne l'ont pas épuisé extracellulairement (Figures 5C et 5D). Fait intéressant, Sucnr1−/− NSC, dont nous avons montré qu'il n'avait aucun effet sur l'expression de Il1b dans MφLPS (Figure 4F), n'a pas réussi à réduire les niveaux de succinate extracellulaire dans les co-cultures avec MφLPS (Figure 5E). Comme preuve supplémentaire de l'importance de la déplétion en succinate dans la modulation du phénotype du type 1 députés pro-inflammatoires, nous montrons que le traitement par recombinant actif (r)La sous-unité A du complexe SDH est capable de réduire considérablement l'expression de Il1b dans MφLPS (Figure S5).

Ainsi, La signalisation SUCNR1 dans les NSC déclenche l'absorption du succinate immunométabolite, épuisant ainsi le pool extracellulaire disponible soutenant l'activation autocrine et paracrine de type 1 députés.

La transplantation de CSN avec perte de fonction Sucnr1 montre une capacité altérée à améliorer la neuroinflammation chronique in vivo
Confirmer le rôle de l'axe succinate-SUCNR1 dans la médiation de la réponse des greffons NSC au succinate in vivo, nous avons évalué les effets de la transplantation icv de NSC Sucnr1−/− chez des souris atteintes d'EAE chronique.

À 30 département, Les NSC Sucnr1−/− ont survécu, distribué, et intégré dans le cerveau et la moelle épinière de l'EAE sans différences significatives par rapport aux NSC témoins (Figure S6). Cependant, la transplantation de NSC Sucnr1−/− n'a induit qu'une légère récupération des déficits comportementaux de l'EAE par rapport aux souris EAE témoins traitées au PBS (Score EAE – Sucnr1−/− NSC: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), ce qui était nettement moins prononcé (50% de l'effet) que celui observé chez les souris EAE transplantées avec des NSC témoins (Score EAE – NSC: 2.1 ± 0.3; Figure 6A).

Une analyse basée sur la cytométrie en flux ex vivo de la composition des infiltrats inflammatoires du SNC a montré que la transplantation de souris EAE avec des NSC Sucnr1−/− n'a pas réussi à modifier les proportions de type 1 MP inflammatoires et anti-inflammatoires, y compris les microglies CX3CR1+ et les macrophages infiltrants dérivés de monocytes CCR2+, contrairement aux effets des NSC témoins (Figures 6B et 6C). La pathologie tissulaire post mortem a en outre confirmé la réduction des effets protecteurs des tissus des greffes Sucnr1−/− NSC (Figures 6D et 6E).

Nous avons ensuite étudié les niveaux de PGE2 et de succinate dans des échantillons appariés de LCR et de plasma provenant de souris EAE témoins transplantées par NSC et traitées au PBS.. Nous avons constaté que les NSC Sucnr1−/− et les NSC témoins n'ont pas réussi à induire de changements significatifs dans les niveaux de PGE2 dans le LCR.. La PGE2 plasmatique a augmenté de manière significative chez les souris EAE uniquement (versus des témoins sains), sans effet thérapeutique observé (Figure 6F). Surtout, alors que la transplantation de NSC témoins réduisait le succinate du LCR (HC: 5.524 × 107 au.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 au.u. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 au.u. ± 0.44), Les greffes Sucnr1−/− NSC n'ont montré aucun effet (Sucnr1−/− NSC: 10.40 × 107 au.u. ± 2.59; Figure 6G).

Ces données confirment la nécessité d'une voie de signalisation fonctionnelle SUCNR1 dans la régulation des effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs des greffes de NSC in vivo et soulignent l'importance de l'élimination du succinate en tant que mécanisme d'action anti-inflammatoire prédominant des NSC..

Discussion
Il existe un besoin clinique non satisfait de développer des approches cellulaires et moléculaires pour cibler les principaux facteurs de la physiopathologie des maladies neuroinflammatoires chroniques qui incluent les formes progressives de SEP. (Volpé et coll., 2016). En principe, les cellules souches possèdent un potentiel thérapeutique distinct de celui des petites molécules et des produits biologiques et s'étend bien au-delà du domaine classique de la médecine régénérative. En partie médicament et en partie dispositif, les cellules souches pourraient fonctionner comme agents biologiques modifiant la maladie (DMA) qui détectent divers signaux, migrer vers des sites spécifiques du corps, intégrer les données pour prendre des décisions, et exécuter des comportements de réponse complexes dans le contexte d'un microenvironnement tissulaire spécifique (Fischbach et al., 2013). Tous ces attributs pourraient être exploités pour traiter plusieurs processus pathologiques, y compris l'inflammation persistante provoquée par les MP et la dégénérescence tissulaire qui surviennent dans la SEP progressive.

Ici, nous avons utilisé accessible, autologue, et des iNSC extensibles de manière stable (Thier et coll., 2012), ainsi que les NSC somatiques, étudier les effets de la transplantation de cellules souches cérébrales dans un modèle murin de neuroinflammation chronique, qui imite la cascade inflammatoire observée dans la SEP progressive.

Nous avons constaté que la transplantation de iNSC dans la circulation du LCR de souris EAE favorise des résultats équivalents à ceux précédemment observés chez des souris transplantées avec des NSC somatiques. (Pluchino et coll., 2003). Les iNSC ou NSC transplantés ont induit une amélioration clinique significative, ainsi qu'une réduction des dommages aux axones et à la myéline, sans réduction significative de la perméabilité de la BBB à 30 département. D'autres études aideront à clarifier si des changements dans la perméabilité de la BBB ou le recrutement de monocytes inflammatoires dans le SNC se produisent immédiatement après la transplantation d'iNSC/NSC.. Un tel effet est-il susceptible de modifier les principaux résultats cliniques des maladies à forte prévalence d'infiltration du SNC par des cellules inflammatoires ?, comme EAE/MS, est difficile à anticiper.

Plutôt, nous avons constaté que notre paradigme de transplantation était associé à un changement spécifique dans le profil d'activation des cellules microgliales CX3CR1+ et des macrophages infiltrants dérivés des monocytes CCR2+ avec une diminution de type CD80+. 1 MP inflammatoires et augmentation parallèle des MP anti-inflammatoires MRC1+. Les iNSC/NSC transplantés distribués et ont survécu dans le SNC de souris EAE, tout en s'accumulant préférentiellement au niveau des zones périvasculaires méningées en juxtaposition aux MP endogènes. Tout à fait, ces résultats impliqueraient la présence de mécanismes encore inconnus de couplage intercellulaire entre cellules souches greffées et MP inflammatoires. Il reste à déterminer si cette communication iNSC/NSC-MP in vivo a lieu uniquement dans des niches périvasculaires ou également au niveau d'autres structures cérébrales émergentes de type capteur immunitaire, notamment le plexus choroïde. (Ge et al., 2017).

Nous avons ensuite étudié les mécanismes immunologiques sous-jacents à l'origine des effets bénéfiques des NSC sur les MP au cours de la neuroinflammation chronique.. L'analyse non ciblée de petites molécules d'échantillons appariés de LCR et de plasma a révélé de profonds changements métaboliques dans le LCR de souris EAE, avec des différences entre les phases précoces et tardives de la maladie.

Carnitine, leucine + isoleucine, citrulline, allantoïne, ornithine, et l'acide urique étaient tous significativement augmentés chez les souris témoins EAE traitées au PBS au pic de la maladie.. Nos résultats concordent avec les preuves publiées montrant que la leucine, ainsi que l'acide urique et son sous-produit, l'allantoïne, sont tous augmentés dans le LCR des sujets atteints de SEP (Amorini et al., 2009, Hooper et coll., 1998, Monaco et coll., 1979). Alors qu'une augmentation de la carnitine dans le LCR n'a pas été rapportée dans la SEP, des augmentations importantes ont été décrites dans des conditions inflammatoires du SNC non liées à la SEP, comme l'encéphalite (Wikoff et coll., 2008) et méningite (Shinawi et coll., 1998).

Inversement, seul le succinate a montré un retard (c'est-à-dire, 45 ppp) augmentation du LCR des souris EAE témoins traitées au PBS. Le succinate devient un biomarqueur in vivo précieux de la détresse métabolique et de l'activité inflammatoire (Littlewood-Evans et coll., 2016, Mills et O'Neill, 2014). Surtout, nous avons constaté que le succinate était significativement diminué dans le LCR des souris transplantées par iNSC-/NSC. La réduction du succinate de LCR après une transplantation iNSC ou NSC était intéressante et pourrait jouer un rôle important dans l'interférence avec la neuroinflammation chronique.

Succinate libéré du type 1 Les MP inflammatoires sont un signal inflammatoire clé qui interagit avec son récepteur spécifique couplé à la protéine G, SUCNR1.. SUCNR1 agit comme un détecteur précoce de stress métabolique dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques, y compris l'hypertension induite par la rénine, lésion d'ischémie/reperfusion, inflammation, agrégation plaquettaire, et angiogenèse rétinienne (de Castro Fonesca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Notamment, nous avons constaté que l'expression de SUCNR1 est nécessaire pour les effets thérapeutiques des NSC transplantés in vivo.

L'activation de SUCNR1 médiée par le succinate sur les iNSC et les NSC de rongeurs et d'humains active la signalisation calcique et la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) phosphorylation in vitro, suscitant ainsi l'acquisition d'un phénotype anti-inflammatoire concerté dans les NSC. D'une part, SUCNR1 a activé la sécrétion de PGE2, un modulateur immunitaire pléiotropique bien établi, dont la fonction cible plusieurs types de cellules dans le microenvironnement enflammé, y compris les députés (Kota et coll., 2017, Vasandan et al., 2016). D'autre part, La signalisation succinate-SUCNR1 dans les iNSC et les NSC a conduit à la régulation positive de deux membres de la famille des co-transporteurs SLC13 (c'est-à-dire, SLC13A3 et SLC13A5) et l'absorption du succinate extracellulaire.

In vivo, nous démontrons l'élimination efficace du succinate local extracellulaire par les NSC injectés à des souris EAE via la circulation du LCR, qui est prédominant, par rapport à la sécrétion de PGE2. La perte de signalisation dépendante de SUCNR1 dans les NSC transplantés a entraîné une réduction significative de leurs effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs, alors que les greffes Sucnr1−/− NSC n'ont montré aucune différence de survie, distribution, et différenciation par rapport aux NSC témoins.

Nous émettons alors l’hypothèse que le succinate extracellulaire sécrété par type 1 les MP inflammatoires initient un comportement de récupération que les NSC transplantés s'ajustent en réponse à la disponibilité accrue de substrat (Srisawang et coll., 2007). Ce nouveau couplage métabolique intercellulaire correspond bien à la littérature disponible montrant que, dans des microenvironnements spécifiques, les cellules sont en compétition pour les nutriments disponibles, affectant la fonction et le destin de chacun (Pearce et Pearce, 2013).

Nous prévoyons que l'épuisement en succinate par les iNSC et les NSC exprimant SUCNR1 pourrait jouer un rôle crucial dans la réduction de la disponibilité d'un signal métabolique clé dans des contextes inflammatoires où les interactions entre les cellules souches transplantées et les cellules immunitaires de l'hôte deviennent complémentaires. (Pluchino et Cossetti, 2013). Plus généralement, nos conclusions sont conformes aux propos provocateurs, mais toujours émergent, concept des NSC comme gardiens ancestraux du cerveau capables d'exercer plusieurs effets complémentaires immunomodulateurs et trophiques tissulaires (Martino et Pluchino, 2007).

Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux caractériser la fonction de l'axe succinate-SUCNR1 dans les interactions neuro-immunes, fournir des informations supplémentaires sur le rôle critique du métabolisme cellulaire pour les cellules souches/progénitrices neurales (Knobloch et Jessberger, 2017), et développer des interventions pharmacologiques complémentaires ciblant cette voie dans le cerveau chroniquement enflammé.

En conclusion, nous montrons ici que les NSC détectent le succinate extracellulaire qui s'accumule dans le SNC chroniquement enflammé pour améliorer la neuroinflammation via des mécanismes dépendants du succinate-SUCNR1. Nos travaux identifient un nouveau mécanisme anti-inflammatoire qui sous-tend le potentiel régénérateur des CSN somatiques et directement induits, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle ère de médicaments personnalisés à base de cellules souches pour les maladies neurologiques inflammatoires et dégénératives chroniques.