Protocolo de cultivo de células madre embrionarias humanas
Tallo embrionario humano (él es) Las células deben ser monitoreadas y cuidadas para mantenerse saludables., culturas indiferenciadas.
Como mínimo, Los cultivos deben alimentarse todos los días realizando un cambio completo de medio para reponer los nutrientes perdidos y mantener los cultivos libres de factores de diferenciación no deseados.. Aunque es normal y esperada una pequeña cantidad de diferenciación en cultivos de células madre, el cultivo debe limpiarse de forma rutinaria retirando manualmente, o «cosecha» zonas diferenciadas. Identificar y eliminar el exceso de diferenciación de los cultivos de células hES son técnicas esenciales para el mantenimiento de una población saludable de células..
Protocolo
1. Mantenimiento: Observación de cultivos bajo el microscopio
Retire una placa de células hES de la incubadora a 37 ° C y llévela al microscopio..
Observa las colonias a baja potencia., usando un aumento de 2X o 5X, para evaluar la calidad general de la cultura. Tenga en cuenta lo siguiente: color medio normal, ausencia de cualquier contaminación visible, tamaño total de la colonia, calidad y densidad, y cualquier otra observación.
Observar cambios de color medios..
Debido al cambio de pH y al agotamiento de los nutrientes en el medio después de una incubación durante la noche con las células hES, el medio cambiará de un tono rojo a un «paja» color. Si el medio aparece morado, Se ha producido un cambio de pH básico.. Si el medio aparece extremadamente amarillo, el medio se ha acidificado. Un medio muy amarillo puede ser el resultado de colonias extremadamente superpobladas en el pozo o de contaminación..
El medio debe aparecer claro en todo momento.. Aunque es normal que haya un cierto nivel de restos celulares en el medio., nunca debe aparecer nublado. Si se observa un alto nivel de restos celulares, el cultivo no es saludable y puede estar contaminado.
Si los cultivos no requieren mantenimiento o paso, se pueden llevar al gabinete de seguridad biológica para ser alimentados
Si los cultivos contienen más de aproximadamente 10% colonias diferenciadoras, las células deben ser «limpiado» eliminando manualmente las áreas diferenciadas
Si los cultivos contienen colonias grandes o densas, o la capa de alimentación MEF es más de 12 días de edad, las células deben ser pasadas
2. Alimentando células hES
En una cabina de seguridad biológica estéril, Retire la tapa de la placa de cultivo y aspire el medio gastado.. No permita que la punta de la pipeta toque ninguna parte de la placa que no sea directamente dentro de los pocillos.. Si hay alguna preocupación de contaminación, cambiar a un nuevo, pipeta estéril.
Usando una pipeta de vidrio esterilizada, agregue la cantidad adecuada de medio de cultivo de células hES calentado a cada pocillo. Para cultivos en una placa de 6 pocillos, agregar 2.5 ml de medio por pocillo.
Regrese la placa a la incubadora para que permanezca a 37°C y 5% CO2.
3. Eliminación de la diferenciación de cultivos de células hES
Transformar 9 Pasteur de vidrio de una pulgada pipeta en herramientas de recolección moldeando las puntas sobre la llama controlada de un quemador de alcohol.. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté sellada para evitar la contaminación y redondeada para evitar rayar el plástico de la placa de cultivo.. Esterilice las herramientas de recolección antes de usarlas utilizando la fuente de luz ultravioleta en el gabinete de seguridad biológica o en el recinto de recolección..
Eliminar las zonas diferenciadas. La diferenciación a menudo ocurre sólo en una porción de una colonia de células hES, generalmente a lo largo de los bordes o como puntos aislados en el centro. Si sólo una sección de una colonia se está diferenciando, sólo es necesario eliminar la zona diferenciada. La diferenciación a menudo puede despegar del plato en un «pegajoso» hoja, y es útil separar primero las células diferenciadas del resto de la colonia trazando una línea a través de la colonia con el extremo de la herramienta de selección..
Una vez separados los pedazos de la colonia, Deslice suavemente la herramienta de recolección a lo largo de la placa para separar las células no deseadas.. Tenga cuidado de no raspar demasiado la capa de alimentación de MEF entre las colonias en este proceso..
Cuando todas las células diferenciadas se eliminan de la placa. (y flotando en el medio), devolver el cultivo a la cabina de seguridad biológica. Aspire el medio que contiene las células diferenciadas y reemplácelo con medio de cultivo de células hES fresco.
4. Pasaje de células hES
Incubación de enzimas
En una cabina de seguridad biológica estéril, Retire la tapa de la placa de cultivo de 6 pocillos y aspire el medio gastado de los pocillos que se van a pasar.. No permita que la punta de la pipeta toque ninguna parte de la placa que no sea directamente dentro de los pocillos..
Usando una pipeta de vidrio esterilizada, agregar 1 mL de colagenasa IV calentada a cada pocillo que se va a pasar.
Regrese la placa a la incubadora a 37° C para 5 minutos.
Raspado y agrupación de células hES
Después de incubar las células con colagenasa., observar las colonias bajo el microscopio. La enzima debería provocar un cambio sutil pero observable en los bordes de la colonia..
En la cabina de seguridad biológica, Aspire suavemente la enzima de cada pocillo y reemplácela con 2.0 ml de medio de cultivo celular hES.
Incline la placa de cultivo ligeramente hacia usted y tome la 2.0 mL de medio en el primer pocillo con un 5 pipeta de vidrio ml.
Sosteniendo la pipeta perpendicular al fondo de la placa, Deslice suavemente la punta de la pipeta por el pocillo mientras libera lentamente el medio..
Repita el movimiento de raspado y pipeteo. 3-4 veces hasta que todas las colonias hayan sido eliminadas del pozo.. Pipetee suavemente para evitar romper las colonias en pedazos demasiado pequeños.. Cuando se hayan eliminado las células del primer pocillo., Deje el contenido en el pocillo y comience a raspar las células del siguiente pocillo..
Cuando todos los pozos a atravesar hayan sido raspados, Reúna el medio que contiene los trozos de colonia de cada pocillo en un recipiente estéril. 15 tubo cónico de ml.
Enjuague los pocillos raspados añadiendo 1 mL de medio de cultivo de células hES para cada pocillo. Recoja este enjuague y transfiéralo al tubo cónico..
Pipetee las células suavemente en el tubo para romper los trozos de colonia hasta alcanzar el tamaño deseado..
Centrifugar las células para 5 minutos a las 200 x g.
Recubrimiento de células hES
Mientras las células hES están en la centrífuga, preparar una nueva placa de alimentación MEF de 6 pocillos. Etiquete la placa con la información apropiada de las células hES.: linea celular, nuevo número de pasaje, y fecha de paso. Aspirar el medio MEF de los pocillos y agregar 1.0 mL de PBS a cada pocillo. Agite suavemente el tampón alrededor de los pocillos y aspire el lavado de PBS.. Agregar 1.5 mL de medio de cultivo de células hES a cada pocillo y dejar la placa a un lado.
Cuando las células hES hayan terminado de centrifugarse, llevar el tubo de regreso al gabinete de seguridad biológica. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular suelto.
Resuspender las células en el sedimento con suficiente medio para 1 mL de medio de cultivo de células hES por pocillo a sembrar. Al dividirse en 6 nuevos pozos, resuspender el pellet en 6 ml de medio.
Agregue suave y uniformemente 1 mL de la suspensión celular a cada pocillo preparado de la placa alimentadora MEF.
Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y deslícela con cuidado de adelante hacia atrás., y de lado a lado para distribuir uniformemente las células por todo el pozo.
Permita que las células se adhieran a 37°C durante la noche..
5. Resultados representativos:
Las células hES indiferenciadas son pequeñas, muy apretado, y generalmente consisten en más grandes, células más dispersas.
Se pueden observar diferentes morfologías a bajo aumento bajo el microscopio.. Una buena morfología celular contiene pequeñas, células muy compactas que crecen en una monocapa. Las celdas deben estar limpias., bordes definidos, con poca o ninguna diferenciación.
Se debe mantener la esterilidad en todo momento cuando se trabaja con células hES. Limpie y esterilice la cabina de seguridad biológica y todo el equipo antes de su uso..
Todos los reactivos deben filtrarse utilizando un 0.22 Filtro de tamaño de poro μm antes de su uso.. El uso de antibióticos en cultivos de células hES no es necesario y debe evitarse..
Se debe establecer un entorno separado como estación de recolección designada.. El recinto estéril de la estación puede ser un recinto estático. (como una estación de trabajo PCR) con una fuente de luz ultravioleta, una campana de flujo laminar, o una cabina de seguridad biológica.
Se necesita un microscopio de disección dentro de la estación de recolección para observar las colonias a medida que se eliminan las áreas diferenciadas.. El panel de vidrio frontal de un recinto estático o una cabina de seguridad biológica debe modificarse para permitir que los oculares del microscopio se extiendan a través del panel sin comprometer el flujo de aire y la esterilidad adecuados..
Para mantener cultivos de células hES saludables, Las células deben pasarse en el momento óptimo., normalmente cada 4-7 días. En este momento las colonias han alcanzado su tamaño máximo y pueden estar comenzando a fusionarse.. Las colonias fusionadas pueden aumentar la tasa de diferenciación en la cultura.. Los ratios de división generalmente caen entre 1:3 y 1:5, dependiendo del número de colonias sembradas, tasa de expansión, y condiciones culturales.
Colonias sobreplacadas (relación de división demasiado baja) probablemente se fusionarán prematuramente y será necesario pasarlos antes de que alcancen su tamaño máximo.
Cultivos en una capa alimentadora de MEF que es más de 2 semanas de antigüedad deben transferirse a nuevos MEF que apoyen el crecimiento y la proliferación indiferenciados.
Dado que la diferenciación ocurre naturalmente en cultivos de células hES, se espera una pequeña cantidad. Puede ocurrir una diferenciación frecuente o excesiva si los cultivos no reciben la atención adecuada.. Las células deben ser alimentadas todos los días., Se debe evitar el crecimiento excesivo entre pasajes.. Utilice siempre reactivos nuevos.
todos los medios, Los MEF y los reactivos deben usarse dentro de 14 días para evitar el crecimiento de células hES indiferenciadas. Nuevos lotes de reactivos, como el reemplazo del suero Knockout, FBS y MEF, debe ser examinado antes de su uso. Recuerde que cualquier célula diferenciada que no se elimine antes del pase se transferirá a los nuevos cultivos..
También, Trate de mantener las células a 37°C siempre que sea posible.. Minimizar el tiempo que las células pasan fuera de la incubadora (p.ej. en la platina del microscopio o en la cabina de seguridad biológica.) Una platina de microscopio calentada puede ser muy beneficiosa si las células estarán en la incubadora durante largos períodos de tiempo..
Al observar los cultivos de células hES bajo el microscopio., Primero evalúe la calidad general y el tamaño de la vista de las colonias usando una potencia baja. (2x o 5x) objetivo. Si se observan células potencialmente diferenciadas a baja potencia, confirmar la morfología diferenciada utilizando un objetivo de mayor aumento (10incógnita).
