Zuletzt aktualisiert: August 17, 2026
Aus Makrophagen gewonnenes extrazelluläres Succinat lizenziert neurale Stammzellen zur Unterdrückung chronischer Neuroinflammation
Höhepunkte
•NSCs aus somatischen Geweben oder direkte Reprogrammierung unterdrücken gleichermaßen Neuroinflammation
•Extrazelluläres Succinat aktiviert SUCNR1/GPR91 auf NSCs
•Aktivierte NSCs sezernieren PGE2 und fangen Succinat ab, also Neuprogrammierungstyp 1 Abgeordnete
•Sucnr1-mutierte NSCs haben nach der Transplantation eine verringerte entzündungshemmende Aktivität
Zusammenfassung
Neurale Stammzelle (NSC) Eine Transplantation kann Immunreaktionen beeinflussen und Entzündungen im ZNS unterdrücken. Metaboliten, wie Succinat, modulieren den Phänotyp und die Funktion von Immunzellen, Ob und wie NSCs jedoch auch durch solche Immunmetaboliten aktiviert werden, um Immunreaktivität und Entzündungsreaktionen zu kontrollieren, ist unklar. Hier, Wir zeigen, dass transplantierte somatische und direkt induzierte NSCs chronische ZNS-Entzündungen lindern, indem sie den Succinatspiegel in der Liquor cerebrospinalis senken, Dadurch verringert sich die Zahl der mononukleären Phagozyten (Abgeordneter) Infiltration und sekundäre ZNS-Schädigung. Inflammatorische Abgeordnete setzen Succinat frei, welches den Succinatrezeptor aktiviert 1 (SUCNR1)/GPR91 auf NSCs, Dies führt dazu, dass sie Prostaglandin E2 absondern und extrazelluläres Succinat abfangen, was zu einer entzündungshemmenden Wirkung führt. Daher, Unsere Arbeit zeigt eine unerwartete Rolle der Succinat-SUCNR1-Achse in somatischen und direkt induzierten NSCs, das die Reaktion von Stammzellen auf entzündliche Stoffwechselsignale steuert, die vom Typ freigesetzt werden 1 MPs im chronisch entzündeten Gehirn.
Einführung
Fortschritte in der Stammzellbiologie haben die Hoffnung geweckt, dass Erkrankungen des ZNS durch nicht-hämatopoetische Stammzellmedikamente gelindert werden könnten (Martino und Pluchino, 2006). Wir haben überzeugende Beweise dafür geliefert, dass die Transplantation somatischer neuronaler Stammzellen (NSCs) verbessert die klinisch-pathologischen Merkmale von Tiermodellen entzündlicher ZNS-Erkrankungen. Über den strukturellen Ersatz verletzter ZNS-Zellen hinaus, Unsere Arbeit hat gezeigt, dass transplantierte NSCs an komplexen Kommunikationsprogrammen zwischen Stammzelltransplantat und Wirt beteiligt sind, Dies führt insgesamt zu einer trophischen Unterstützung und einer Modulation der adaptiven und angeborenen Immunantworten (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino und Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009B). Speziell, NSC-Transplantationen reduzieren die Entzündungslast an der Verletzungsstelle (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009A), Verringern Sie die Anzahl der Typen 1 entzündliche mononukleäre Phagozyten (Abgeordnete) (Cusimano et al., 2012), und fördern die Heilung des verletzten ZNS über noch wenig charakterisierte Mechanismen.
Jedoch, Die klinische Umsetzung experimenteller NSC-Therapien ist immer noch durch die Quellen begrenzt, aus denen menschliche NSCs stammen (hNSCs) abgeleitet sind (Anderson et al., 2017), die intrinsische Immunogenität allogener hNSC-Linien (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Rice et al., 2013), und die Stabilität der sogenannten „beabsichtigten klinischen Zellcharge“ (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). Autologe und stabil expandierbare direkt induzierte NSCs (iNSCs) aus dermalen Fibroblasten von Patienten entwickeln sich zu einer gültigen Alternative zu NSC-Therapien (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Die direkte Umprogrammierung in iNSCs vermeidet das mühsame Fortschreiten durch einen pluripotenten Zustand und die anschließende Differenzierung in gewünschte Abstammungslinien, die für induzierte pluripotente Stammzellen beschrieben werden (iPSC) Technologie (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). daher, Die Herstellung stabil expandierbarer iNSCs aus somatischen Zellen stellt die praktikabelste Möglichkeit dar, autologe Hirnstammzellen für nachgelagerte klinische Anwendungen zu gewinnen (Wörsdörfer et al., 2013). Jedoch, Die Wirksamkeit direkt umprogrammierter iNSCs bei der Behandlung entzündlicher ZNS-Erkrankungen wurde noch nicht getestet.
Bei fortschreitenden Formen der Multiplen Sklerose (MS), Chronische ZNS-Entzündungen werden durch eine weit verbreitete Aktivierung von MPs aufrechterhalten, zu denen sowohl im ZNS ansässige Mikroglia als auch aus Monozyten stammende infiltrierende Makrophagen gehören (Mallucci et al., 2015). MPs werden in Läsionen der grauen Substanz gefunden, in der Nähe degenerierender Neuriten und neuronaler Zellkörper (Peterson et al., 2001), und bei Läsionen der weißen Substanz, wo der äußere Rand der aktivierten Mikroglia mit chronischen Gewebeschäden verbunden ist (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Bereiche mit normal erscheinender weißer Substanz sind ebenfalls durch MP-Ansammlung gekennzeichnet, Dies führt zur Bildung von Mikroglia-Knötchen, die unabhängig von der gleichzeitigen T-Zell-Aktivierung die Krankheitspathologie vorantreiben (Moll et al., 2011). Die schädliche Rolle chronischer MP-bedingter Entzündungen bei fortschreitender MS wird auch durch Beweise in Tiermodellen für Krankheiten gestützt, wobei seine Gesamtbelastung mit einer beeinträchtigten neuronalen Funktion korreliert (Planche et al., 2017), Gehirnatrophie (Baum et al., 2015), und reduzierte regenerative Reaktionen (Jiang et al., 2014).
Die Aktivierung von MPs durch entzündungsfördernde Reize führt zu einer metabolischen Umstellung hin zur Glykolyse und einer verringerten oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) (Kelly und O’Neill, 2015). Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, innerhalb dieser metabolischen Neuverkabelung, Typ 1 entzündliche MPs reichern Succinat an, mit wichtigen pathophysiologischen Implikationen (Tannahill et al., 2013). Intrazelluläres Succinat hemmt die Aktivität der Prolylhydroxylase-Enzyme (Doktoranden), Dadurch wird das auf Hypoxie reagierende Element stabilisiert (HIF)-1α und induziert die Transkription von Interleukin (IL)-1B (Tannahill et al., 2013). Außerdem, Oxidation von Succinat durch Succinatdehydrogenase (SDH) wandelt Mitochondrien von der ATP-Synthese in reaktive Sauerstoffspezies um (ROS) Produktion als zusätzliches proinflammatorisches Signal (Mills et al., 2016). Typ 1 entzündliche MPs setzen Succinat auch extrazellulär frei und regulieren den zugehörigen Succinatrezeptor hoch 1 (SUCNR1), ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (auch bekannt als GPR91), der als autokriner und parakriner Sensor fungiert, um die IL-1β-Produktion zu steigern (Littlewood-Evans et al., 2016).
Als solche, Der Stoffwechsel entwickelt sich zu einem wichtigen therapeutischen Ziel, um die Aktivierung beider Makrophagen zu modulieren (Kelly und O’Neill, 2015) und Mikroglia (Orihuela et al., 2016), und Succinat-bezogene Signalwege haben wichtige immunmodulatorische Funktionen bei akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungen (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).
Angesichts der nachgewiesenen immunmodulatorischen Eigenschaften von NSCs (Pluchino und Cossetti, 2013), Wir stellten die Hypothese auf, dass NSCs ihre therapeutische Wirkung bei chronischer Neuroinflammation entfalten könnten, indem sie den MP-Metabolismus in Richtung einer Reduzierung sekundärer ZNS-Schäden modulieren.
In dieser Arbeit, Wir untersuchten die molekularen Mechanismen, die der Fähigkeit somatischer und direkt induzierter NSCs zugrunde liegen, den metabolischen Veränderungen des Typs entgegenzuwirken 1 entzündliche MPs sowohl in vivo als auch in vitro. Wir zeigen, dass transplantierte iNSCs und NSCs bei der Linderung chronischer Neuroinflammationen bei Mäusen mit experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis funktionell gleichwertig sind (EAE). Transplantierte iNSCs/NSCs verändern das Aktivierungsprofil von ZNS-residenten Mikroglia und von Monozyten abgeleiteten infiltrierenden Makrophagen in Richtung eines entzündungshemmenden Phänotyps, sowie die Konzentration des Immunmetaboliten Succinat in der Liquor cerebrospinalis reduzieren (CSF). iNSCs/NSCs verringern auch je nach Typ die Freisetzung von extrazellulärem Succinat 1 entzündliche MPs, um ihren Stoffwechsel in vitro auf OXPHOS umzuprogrammieren. Mechanistisch, Wir zeigen, dass Succinat nach Typ sezerniert wird 1 MPs löst in iNSCs/NSCs eine Signalkaskade stromabwärts von SUCNR1 aus, was ihre entzündungshemmende Wirkung ermöglicht. Diese Succinat-lizenzierte entzündungshemmende Funktion von iNSCs/NSCs wird durch die Sekretion von Prostaglandin vermittelt (PG) E2, sowie durch beträchtliches Abfangen von extrazellulärem Succinat. Der Verlust der Sucnr1-Funktion in NSCs führt nach der Transplantation bei EAE zu einer deutlich verringerten entzündungshemmenden Aktivität in vitro und in vivo.
Unsere Studie deckt eine Succinat-SUCNR1-Achse auf, die verdeutlicht, wie NSCs auf entzündliche Stoffwechselsignale reagieren, um die Aktivierung des Typs zu hemmen 1 MPs bei chronischer Neuroinflammation.
Ergebnisse
NSC-Transplantation lindert chronische Neuroinflammation und ist mit einer Reduzierung des Immunmetaboliten Succinat in der Liquor cerebrospinalis verbunden
Wir haben zunächst die Auswirkungen der intrazerebroventrikulären Untersuchung untersucht (icv) Transplantation auf dem Höhepunkt der Krankheit (PD) von iNSCs oder NSCs in Mäusen mit MOG35-55-induzierter chronischer EAE und verglich sie mit PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen. Vor der Transplantation, iNSCs und NSCs wurden erweitert, gekennzeichnet (Abbildung S1), und mit Farnesyl markiert (F)GFP in vitro. Bei 30 Tage nach der Transplantation (dpt), iNSC- und NSC-Transplantationen überlebten, verteilt, und in das EAE-Gehirn und Rückenmark integriert (Abbildung S2). Nur eine Minderheit der entnommenen fGFP+-Zellen (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSCs: 1.7% ± 0.1%) vermehrten sich (Abbildung 1A) oder neuronal exprimieren (Abbildung 1B), astrogliale (Abbildung 1C), oder oligodendrogliale (Abbildung 1D) Abstammungsmarkierungen (Abbildung S2). Die Mehrheit (∼75 %) Bei den iNSCs, die die Transplantation überlebten, wurde stattdessen festgestellt, dass sie keinen der getesteten neuralen Abstammungsmarker exprimierten und sich um meningeale perivaskuläre nischenartige Bereiche in der Nähe endogener F4/80+-MPs lokalisierten (Abbildung 1E), wie bei somatischen NSC-Transplantaten beobachtet (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). Die Transplantation von iNSCs führte zu einer signifikanten und lang anhaltenden Wirkung (bis zu 90 dpt) Verbesserung der EAE-Scores, was begann mit 15 Zu 20 dpt weiter (Abbildungen 1F und S2). Die funktionelle Erholung wurde auch durch eine computergestützte automatisierte Ganganalyse bestätigt (Abbildung S2). Gesamt, icv-transplantierte iNSCs waren sicher und führten zu einer Verhaltens- und pathologischen Erholung.
Anschließend analysierten wir die Zusammensetzung von ZNS-Entzündungsinfiltraten mittels Ex-vivo-Durchflusszytometrie in iNSC- und NSC-transplantierte versus PBS-behandelte Kontroll-EAE-Mäuse. Die Transplantation von iNSCs oder NSCs hatte keine Auswirkungen auf den Anteil ZNS-infiltrierender T-Zellen, B-Zellen, und Gesamtzahl der Abgeordneten, sowie in der von CD3+/CD4+ T-Zell-Untergruppen (einschließlich Th1, Montag, Treg, ThGM-CSF, und Th17-Teilmengen) bei 30 dpt (Abbildung S3). Stattdessen, iNSC- oder NSC-transplantierte EAE-Mäuse zeigten einen signifikanten Wechsel im Aktivierungsprofil von CX3CR1+-Zellen mit einer etwa 1,5-fachen Abnahme des CD80+-Typs 1 entzündliche Mikroglia und paralleler Anstieg der entzündungshemmenden Mikroglia MRC1+ (Abbildung 1G). Ebenfalls, ZNS-infiltrierend (Monozyten-abgeleitet) CCR2+-Makrophagen von iNSC- oder NSC-transplantierte EAE-Mäuse erlebten einen signifikanten Phänotypwechsel mit einer etwa 1,3-fachen Abnahme des CD80+-Typs 1 entzündliche Makrophagen und paralleler etwa 1,8-facher Anstieg der entzündungshemmenden MRC1+-Makrophagen (Abbildung 1H). Dieser Effekt ging mit einer deutlichen Verringerung der Ausprägung des Typs einher 1 entzündlicher MP-Marker induzierbare Stickoxid-Synthase (iNOS) durch F4/80+ MPs in vivo (Abbildungen 1I und S3).
Anschließend analysierten wir die Ausdrucksniveaus des Hauptprofis- und entzündungshemmende Gene im gesamten ZNS. iNSC- und NSC-transplantierte EAE-Mäuse zeigten beide deutlich verringerte Interleukin-1-Beta-Spiegel (II1b) im Gehirn und Rückenmark und erhöhte Konzentrationen des Mannoserezeptors C-Typ 1 (Mrc1) im Rückenmark, beides bei 10 dpt (Abbildung 1J).
Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der Blut-Hirn-Schranke (BBB) Durchlässigkeit bei 30 dpt beim Vergleich von iNSC-/NSC-transplantierten mit PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen (Abbildung S3).
Endlich, iNSC- und NSC-transplantierte EAE-Mäuse akkumulierten einen deutlich verringerten axonalen Verlust (Abbildung 1K) und Demyelinisierung (Abbildung 1L) im Rückenmark.
Angesichts der nachgewiesenen Bedeutung des Stoffwechsels für die Regulierung des Phänotyps und der Funktion von MPs, Wir untersuchten, ob NSC-Transplantationen die neuroinflammatorische metabolische Mikroumgebung beeinflussen. Zu diesem Zweck, Wir führten ein ungezieltes Stoffwechselprofil polarer Metaboliten durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie durch (LC-MS) passender Liquor- und Plasmaproben (Tabelle S1). Mit PBS behandelte Kontroll-EAE-Mäuse zeigten einen signifikanten Anstieg um mehrere CSF (aber kein Plasma) Metaboliten, unter denen Succinat nur einen Höchstwert erreichte 45 Tage nach der Impfung (dpi) (entsprechend 30 dpt; Abbildung 1M). EAE-Mäuse, die keiner Operation unterzogen wurden, zeigten ebenfalls einen signifikant erhöhten Succinatspiegel nur im Liquor 45 dpi (im Vergleich zu gesunden Kontrollmäusen), Dies unterschied sich nicht von den Succinatspiegeln in den mit CSF PBS behandelten Kontroll-EAE-Mäusen (Abbildung S3).
Während wir keine signifikante Veränderung der Plasmametabolitenspiegel zwischen iNSC/NSC-transplantierten und PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen feststellen konnten (Tabelle S1), Wir fanden heraus, dass die Transplantation von iNSCs oder NSCs zu einem signifikanten Rückgang des CSF-Succinats führte 30 dpt (Abbildung 1M; Tabelle S1).
Weiter, Beim Vergleich von PBS-behandelten EAE-Mäusen mit EAE-Mäusen, denen icv Mausfibroblasten injiziert wurden, fanden wir keine signifikanten Unterschiede im CSF-Succinat (MFs) als Kontrollzellen (Abbildung S3).
Daher, iNSCs und NSCs, die direkt in das EAE-ZNS injiziert werden, induzieren einen spezifischen Phänotypwechsel von MPs, Dies geht nur mit einer Verringerung des Immunmetaboliten Succinat im Liquor und einer Linderung chronischer Neuroinflammationen einher.
NSCs reduzieren den Succinatspiegel und programmieren den Typstoffwechsel neu 1 Entzündliches Mφ in vitro
Anschließend untersuchten wir die molekularen Mechanismen, durch die iNSCs/NSCs je nach Typ entzündungshemmende Aktivitäten zeigen 1 Abgeordnete, unter Verwendung eines In-vitro-Systems, das die Wechselwirkungen zwischen MPs und iNSCs/NSCs rekapituliert. Naive, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (Mφ) wurden zu einem Typus polarisiert 1 entzündlicher Phänotyp mit LPS (MφLPS), wie beschrieben (Tannahill et al., 2013). MφLPS wurden dann zusammen mit iNSCs kultiviert (MφLPS-iNSCs) oder NSCs (MφLPS-NSCs) in einem Trans-Well-System, das Kontakte von Zelle zu Zelle vermeidet (Abbildung 2A). Als Kontrollen wurden unpolarisierte Mφ verwendet.
Microarray-Genexpressionsprofile zeigten signifikante Transkriptionsänderungen in MφLPS mit 7,401 Gene betroffen (versus Mφ; angepasster p-Wert < 0.1; Abbildung 2B; Tabelle S2) Und 51 Gene, die in MφLPS-iNSCs oder MφLPS-NSCs unterschiedlich exprimiert werden (versus MφLPS; angepasster p-Wert < 0.1; Abbildungen 2B und 2C; Tabelle S2). Dieser letztere Satz von Genen wurde mit biologischen Prozessen angereichert, die mit der positiven Regulierung der Leukozytenaktivierung zusammenhängen (GEHEN: 0002696), Differenzierung myeloischer Leukozyten (GEHEN: 0002761), und Prozesse des Immunsystems (GEHEN: 0002376). Die unabhängige qRT-PCR-Validierung ausgewählter proinflammatorischer Mφ-Gene bestätigte eine signifikante Herunterregulierung der Expressionsniveaus von Il12b, Il15, Il15ra, und Cd69, sowie die klassischen Entzündungsgene Nos2, Tumornekrosefaktor (Tnf), und Il1b in MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs (versus MφLPS; Abbildung 2D). Dieser Effekt war mit der gleichzeitigen Hochregulierung der Expressionsniveaus von Genen verbunden, die mit einem entzündungshemmenden Mφ-Phänotyp assoziiert sind, wie Uronyl-2-Sulfotransferase (Ust) und Knochenmark-Stromazellantigen 1 (Bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), sowie Arginase 1 (Arg1) und Mrc1 (versus MφLPS; Abbildung 2E). Wenn iNSCs/NSCs zusammen mit Lipopolysaccharid kultiviert wurden (LPS)-aktivierte Maus-BV2-Mikrogliazellen wie zuvor, Es wurde auch eine signifikante Verringerung der Expressionsniveaus der proinflammatorischen Gene Nos2 und Il1b beobachtet (Abbildung 2F).
Verknüpfung von Genexpressionsprofilen mit funktionellen Stoffwechselzuständen, Wir haben die basale Sauerstoffverbrauchsrate ermittelt (OCR) und extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) von MφLPS als Messwerte ihrer Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und glykolytische Aktivitäten, jeweils. Wir fanden eine signifikante Verringerung der OCR und einen signifikanten Anstieg der ECAR bei MφLPS (versus Mφs). Stattdessen, Bei MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs kam es zu einer deutlichen Wiederherstellung der OCR- und ECAR-Werte (versus MφLPS; Abbildungen 2G und 2H), wie beim Übergang von Mφ zu einem entzündungshemmenden Phänotyp beobachtet (O’Neill und Pearce, 2016).
In dem Bemühen, die metabolischen Determinanten dieser entzündungshemmenden Wirkungen zu klären, Wir führten eine ungezielte LC-MS-Analyse des extrazellulären und intrazellulären Gehalts an niedermolekularen Metaboliten von MφLPS durch. Wie erwartet, Die LPS-Stimulation veränderte das extrazelluläre und intrazelluläre Stoffwechselmilieu von Mφ tiefgreifend (MφLPS) (versus Mφ; Tabelle S3). In Co-Kulturen, Sowohl MφLPS-iNSCs als auch MφLPS-NSCs zeigten eine signifikante Reduktion des extrazellulären Glutamats, GABA, und Succinat (versus MφLPS; Abbildung 2I; Tabelle S3). Außerdem, MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs zeigten ebenfalls eine signifikante Reduzierung von intrazellulärem Succinat und Itaconat (versus MφLPS; Abbildung 2J; Tabelle S3).
Im Einklang mit der Reduzierung des Succinatspiegels, Wir fanden heraus, dass MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs deutlich verringerte HIF-1α-Spiegel aufwiesen, des vorgeschalteten Proteins Pyruvatkinase-Isozym M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Abbildung 2K), sowie von IL-1β (versus MφLPS; Abbildung 2L).
Insgesamt, Diese In-vitro-Daten liefern Hinweise darauf, dass iNSCs/NSCs die Akkumulation von intrazellulärem und extrazellulärem Succinat in Co-Kulturen mit Typ reduzieren 1 aufrührerische Abgeordnete, Sie werden in Richtung eines entzündungshemmenden OXPHOS-Phänotyps umprogrammiert.
Succinatsignale über SUCNR1/GPR91 in NSCs von Mäusen und Menschen
Angesichts der Bedeutung von Succinat als immunmetabolisches Signal, Wir haben untersucht, ob Succinat nach Typ freigesetzt wird 1 Proinflammatorische MPs könnten die Aktivität umgebender Zellen in situ regulieren, einschließlich der von transplantierten iNSCs/NSCs.
Wir fanden heraus, dass transplantierte iNSCs/NSCs in der Nähe meningealer perivaskulärer Bereiche nachgewiesen wurden (Abbildungen 3A und 3B ) und F4/80+ MPs (Abbildung 3C) exprimierte SUCNR1 in vivo im ZNS. SUCNR1 wurde in vitro auch auf Proteinebene sowohl auf iNSCs als auch auf NSCs exprimiert, aber nicht in MFs (Abbildung 3D).
Um weiter zu beurteilen, ob SUCNR1 in iNSCs/NSCs durch Succinat funktionell aktiviert wurde, Wir haben die nachgeschaltete Signalkaskade in vitro untersucht. Bei Exposition gegenüber Succinat (Abbildung 3E; Rubik et al., 2008), 34.2% (±7,4 %) von iNSCs und 31.7% (±6,5 %) der NSCs zeigten eine Freisetzung intrazellulärer Kalziumspeicher (Abbildungen S4 und 3F). Auf diese Reaktion folgte eine signifikante Hochregulierung der Phospho-p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (Abbildung 3G), ein Hinweis auf seine Aktivierung. Wir haben die Expression von SUCNR1 und SUCNR1 auch in menschlichen fetalen NSCs bestätigt (hNSCs) und menschliche iNSCs (hiNSCs) (Abbildungen 3H und 3I). Wie bei Maus-iNSCs, Succinat-abhängige p38-Signalisierung wurde in hiNSCs hervorgerufen, jedoch nicht bei hiNSCs, die mit dem selektiven SUCNR1-Inhibitor 4c vorbehandelt wurden (Abbildung 3J).
Daher, iNSCs und NSCs von Mäusen und Menschen exprimieren funktionelles SUCNR1, das einen seiner Stimulation nachgeschalteten Signalweg mit dem Immunmetaboliten Succinat induziert.
Die SUCNR1-Stimulation initiiert die Sekretion von Prostaglandin E2 durch NSCs
Um die funktionellen Konsequenzen der SUCNR1-Signalübertragung in NSCs zu klären, Wir haben NSCs aus Mäusen generiert, denen Sucnr1 fehlt (Sucnr1−/− NSCs) (Rubik et al., 2008; Abbildung S4). Im Vergleich zu Kontroll-NSCs, Sucnr1−/− NSCs zeigten in vitro ähnliche Wachstumskurven und Differenzierung (Abbildung S4). Jedoch, bei Exposition gegenüber Succinat zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Konzentrationen, Sucnr1–/– NSCs zeigten keine Hochregulierung von Phospho-p38 (Abbildung S4). Stimulation mit Glutamat oder ATP + Thapsigargin induzierte in Sucnr1-/--NSCs eine Kalziumreaktion, die der von Kontroll-NSCs ähnelte (Abbildung S4). Im Gegenteil, Die Behandlung mit Succinat löste keine Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern aus (Abbildung S4), Dies deutete auf eine fehlerhafte SUCNR1-Signalisierung in Sucnr1-/--NSCs hin.
Anschließend führten wir nach der Behandlung mit Succinat in Kontroll-NSCs und Sucnr1-/--NSCs einen Genexpressionsprofilierungs-Microarray durch (Tabelle S4). Wir haben die Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase gefunden 2 (Ptgs2), das Schlüsselenzym in der PG-Biosynthese, das das induzierbare PTGS2 kodiert, war das am stärksten hochregulierte Gen in Succinat-stimulierten Kontroll-NSCs (log2-fache Änderung 1.05), jedoch nicht in Succinat-stimulierten Sucnr1-/--NSCs (log2-fache Änderung −0,43; Abbildung 4A). Wir haben diese Ergebnisse auf Ptgs2 durch qRT-PCR validiert, Dies bestätigt, dass seine Expressionsniveaus deutlich hochreguliert waren (2.1- bis 2,7-fache Veränderung) in Succinat-stimulierten iNSCs und NSCs, wohingegen sie nicht in Succinat-behandelten Sucnr1-/--NSCs vorkamen (Abbildung 4B).
Angesichts der Rolle von PGE2 als Regulator der immunsuppressiven Wirkung mesenchymaler Stammzellen (MSCs) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), Wir haben seine Anreicherung in Gewebekulturmedien von iNSCs getestet, NSCs, und Sucnr1–/– NSCs nach Stimulation mit Succinat. iNSCs und NSCs, aber nicht Sucnr1−/− NSCs, deutlich gezeigt (>2.5-falten) Erhöhung ihrer basalen PGE2-Freisetzung 30 min nach Succinat. Dieser Succinat-induzierte Effekt wurde durch eine Vorbehandlung mit dem irreversiblen PTGS2-Blocker SC-58125 aufgehoben (Abbildung 4C). Wie bei Maus-iNSCs, Die Exposition von hiNSCs gegenüber Succinat löste einen signifikanten Anstieg der PGE2-Konzentrationen in Gewebekulturmedien aus, wohingegen wiederum eine Vorbehandlung mit SC-58125 oder 4c seine Freisetzung verhinderte (Abbildung 4D).
Um die Relevanz dieser Ergebnisse auf Kokulturen zwischen NSCs und MφLPS weiter auszudehnen, Wir haben die PGE2-Spiegel in Gewebekulturmedien analysiert. Wir fanden heraus, dass MφLPS-NSCs im Vergleich zu MφLPS höhere Mengen an PGE2 akkumulierten, wohingegen die Vorbehandlung kokultivierter NSCs mit SC-58125 die PGE2-Spiegel deutlich senkte (Abbildung 4E). Die Vorbehandlung von NSCs mit SC-58125 war auch mit einem signifikanten Anstieg der Il1b-Expression in MφLPS verbunden (Abbildung 4F) und mit einer Verringerung der OCR-Werte, was auf einen proinflammatorischen Phänotyp hinweist (Abbildung 4G). Jedoch, Wir stellten fest, dass mit SC-58125 vorbehandelte NSCs im Vergleich zu Sucnr1-/−-NSCs einige verbleibende entzündungshemmende Wirkungen auf MφLPS beibehielten (Abbildung 4F). Im Gegenteil, Der Funktionsverlust von Sucnr1 in NSCs hob deren entzündungshemmende Wirkung auf MφLPS vollständig auf (Abbildungen 4F und 4G). Wir zeigen auch, dass die beobachtete PGE2-abhängige entzündungshemmende Fähigkeit von NSCs erhalten bleibt und für menschliche NSCs relevant ist.
Als solche, hiNSCs führten in Co-Kulturen zu einer signifikanten Verringerung der Il1b-Expression in MφLPS (Abbildung 4H), was mit einer Wiederherstellung der OCR-Werte verbunden war (Abbildung 4I) und erhöhte PGE2-Spiegel in Gewebekulturmedien (Abbildung 4J). Diese Effekte wurden durch die Vorbehandlung von hiNSCs mit dem selektiven SUCNR1-Inhibitor 4c vollständig unterdrückt (Abbildungen 4H–4J).
Daher, Die Aktivierung des SUCNR1-Signalwegs in NSCs von Mäusen und Menschen löst die Freisetzung von PGE2 aus, was zu entzündungshemmenden Wirkungen auf den Typ führt 1 Abgeordnete.
Jedoch, Hemmungsexperimente, die entweder auf PTGS2 oder SUCNR1 abzielen, gehen davon aus, dass zusätzliche SUCNR1-abhängige – PGE2-unabhängige – Mechanismen wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei der entzündungshemmenden Wirkung von NSCs spielen.
Die SUCNR1-Stimulation löst die Aufnahme von Succinat durch NSCs aus
Genexpressions-Arrays von Succinat-stimulierten NSCs zeigten dies, außer Ptgs2, NaCT/Slc13a5 gehörte zu den am stärksten hochregulierten Genen im Wildtyp (WT) NSCs (log2 Fold Change = 0.49), aber nicht in Sucnr1−/− NSCs (log2-fache Änderung = −0,12). SLC13A5 ist ein Dicarboxylat-Cotransporter, von dem bekannt ist, dass er am Succinattransport beteiligt ist (Srisawang et al., 2007). Angesichts der konsistenten Erschöpfung von Succinat, die sowohl in vivo im Liquor von iNSC festgestellt wurde- oder NSC-transplantierte EAE-Mäuse und in vitro in Co-Kulturen mit MφLPS, Wir stellten die Hypothese auf, dass iNSCs/NSCs SLC13A5 aktivieren würden, um Succinat abzufangen.
Wir fanden heraus, dass die Expression von SLC13A5, sowie des hochaffinen Dicarboxylat-Cotransporters SLC13A3, waren bei iNSCs und NSCs signifikant erhöht, aber nicht in Sucnr1−/− NSCs, bei Succinat-Stimulation (Abbildung 5A). Ähnlich, hiNSCs, die Succinat ausgesetzt waren, regulierten die Proteinexpressionsniveaus dieser beiden SLC13-Cotransporter in vitro hoch (Abbildung 5B).
Als nächstes untersuchten wir die Rolle dieser Co-Transporter, indem wir die Succinataufnahme in iNSCs und NSCs maßen. Wir fanden heraus, dass sich sowohl iNSCs als auch NSCs signifikant anhäuften [14C]-Succinat (Abbildung 5C) während gleichzeitig die Menge an extrazellulärem Material reduziert wird [14C]-Succinat in Gewebekulturmedien (Abbildung 5D). Sucnr1−/− NSCs haben sich nicht angesammelt [14C]-Succinat wurde weder intrazellulär noch extrazellulär abgebaut (Abbildungen 5C und 5D). Interessant, Sucnr1−/− NSCs, Wir haben gezeigt, dass dies keine Auswirkungen auf die Il1b-Expression in MφLPS hat (Abbildung 4F), gelang es nicht, die extrazellulären Succinatspiegel in Co-Kulturen mit MφLPS zu senken (Abbildung 5E). Als weiterer Beweis für die Bedeutung des Succinatabbaus bei der Modulation des Phänotyps des Typs 1 proinflammatorische Abgeordnete, Wir zeigen, dass die Behandlung mit aktiven Rekombinanten (R)Die SDH-Komplex-Untereinheit A ist in der Lage, die Expression von Il1b in MφLPS deutlich zu reduzieren (Abbildung S5).
Daher, Die SUCNR1-Signalübertragung in NSCs löst die Aufnahme des Immunmetaboliten Succinat aus, Dadurch wird der verfügbare extrazelluläre Pool erschöpft, wodurch die autokrine und parakrine Aktivierung des Typs aufrechterhalten wird 1 Abgeordnete.
Die Transplantation von Sucnr1-NSCs mit Funktionsverlust zeigt eine eingeschränkte Fähigkeit, chronische Neuroinflammation in vivo zu lindern
Um die Rolle der Succinat-SUCNR1-Achse bei der Vermittlung der Reaktion von NSC-Transplantaten auf Succinat in vivo zu bestätigen, Wir haben die Auswirkungen der ICV-Transplantation von Sucnr1-/--NSCs bei Mäusen mit chronischer EAE untersucht.
Bei 30 dpt, Sucnr1−/− NSCs überlebten, verteilt, und in das EAE-Gehirn und Rückenmark integriert, ohne signifikante Unterschiede im Vergleich zu Kontroll-NSCs (Abbildung S6). Jedoch, Die Transplantation von Sucnr1-/--NSCs führte nur zu einer geringfügigen Erholung der EAE-Verhaltensdefizite im Vergleich zu PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen (EAE-Score – Sucnr1−/− NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), was deutlich schwächer ausgeprägt war (50% der Wirkung) als bei EAE-Mäusen beobachtet, denen Kontroll-NSCs transplantiert wurden (EAE-Score – NSCs: 2.1 ± 0.3; Abbildung 6A).
Eine auf Ex-vivo-Durchflusszytometrie basierende Analyse der Zusammensetzung von ZNS-Entzündungsinfiltraten zeigte, dass die Transplantation von EAE-Mäusen mit Sucnr1-/--NSCs die Typverhältnisse nicht veränderte 1 entzündliche und entzündungshemmende MPs – einschließlich CX3CR1+-Mikroglia und CCR2+-Monozyten-abgeleitete infiltrierende Makrophagen – im Gegensatz zu den Wirkungen von Kontroll-NSCs (Abbildungen 6B und 6C). Die postmortale Gewebepathologie bestätigte weiterhin die verringerte gewebeschützende Wirkung von Sucnr1-/-NSC-Transplantaten (Abbildungen 6D und 6E).
Anschließend untersuchten wir die Konzentrationen von PGE2 und Succinat in passenden CSF- und Plasmaproben von NSC-transplantierten und PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen. Wir fanden heraus, dass sowohl Sucnr1-/--NSCs als auch Kontroll-NSCs keine signifikanten Veränderungen der PGE2-Spiegel im Liquor hervorrufen konnten. Plasma-PGE2 stieg nur bei EAE-Mäusen signifikant an (im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen), ohne dass ein Behandlungseffekt beobachtet wurde (Abbildung 6F). Wichtig, wohingegen die Transplantation von Kontroll-NSCs das CSF-Succinat reduzierte (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSCs: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1−/− NSC-Transplantate zeigten keine Auswirkungen (Sucnr1−/− NSCs: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Abbildung 6G).
Diese Daten bestätigen die Notwendigkeit eines funktionellen SUCNR1-Signalwegs bei der Regulierung der entzündungshemmenden und neuroprotektiven Wirkung von NSC-Transplantaten in vivo und unterstreichen die Bedeutung der Succinat-Fängung als vorherrschender entzündungshemmender Wirkmechanismus von NSCs.
Diskussion
Es besteht ein ungedeckter klinischer Bedarf an der Entwicklung zellulärer und molekularer Ansätze, um die zentralen Treiber der Pathophysiologie chronischer neuroinflammatorischer Erkrankungen, zu denen auch progressive Formen der MS gehören, anzugehen (Volpe et al., 2016). Grundsätzlich, Stammzellen besitzen ein therapeutisches Potenzial, das sich von dem kleiner Moleküle und Biologika unterscheidet und weit über den Bereich der klassischen regenerativen Medizin hinausgeht. Teils Medikament, teils Gerät, Stammzellen könnten als biologische krankheitsmodifizierende Wirkstoffe wirken (DMAs) die verschiedene Signale wahrnehmen, wandern zu bestimmten Stellen im Körper, Integrieren Sie Eingaben, um Entscheidungen zu treffen, und komplexe Reaktionsverhalten im Kontext einer spezifischen Gewebemikroumgebung ausführen (Fischbach et al., 2013). All diese Eigenschaften könnten zur Behandlung mehrerer Krankheitsprozesse genutzt werden, einschließlich der anhaltenden MP-bedingten Entzündung und Gewebedegeneration, die bei fortschreitender MS auftreten.
Hier, Wir haben barrierefrei genutzt, autolog, und stabil erweiterbare iNSCs (Thier et al., 2012), sowie somatische NSCs, um die Auswirkungen einer Hirnstammzelltransplantation in einem Mausmodell chronischer Neuroinflammation zu untersuchen, Dies ahmt die Entzündungskaskade nach, die bei progressiver MS beobachtet wird.
Wir fanden heraus, dass die Transplantation von iNSCs in den Liquorkreislauf von EAE-Mäusen zu gleichwertigen Ergebnissen führt wie zuvor bei Mäusen, denen somatische NSCs transplantiert wurden (Pluchino et al., 2003). Transplantierte iNSCs oder NSCs führten zu einer signifikanten klinischen Verbesserung, sowie reduzierte Axon- und Myelinschäden, ohne wesentliche Verringerung der BHS-Durchlässigkeit 30 dpt. Weitere Studien werden zur Klärung beitragen, ob unmittelbar nach der Transplantation von iNSCs/NSCs Veränderungen der BHS-Permeabilität oder die Rekrutierung von entzündlichen Monozyten in das ZNS auftreten. Ob ein solcher Effekt wahrscheinlich die wichtigsten klinischen Ergebnisse von Krankheiten mit hoher Prävalenz der ZNS-Infiltration durch Entzündungszellen verändert, wie EAE/MS, ist schwer vorhersehbar.
Stattdessen, Wir fanden heraus, dass unser Transplantationsparadigma mit einem spezifischen Wechsel im Aktivierungsprofil sowohl von CX3CR1+-Mikrogliazellen als auch von CCR2+-Monozyten-abgeleiteten infiltrierenden Makrophagen mit einer Abnahme des CD80+-Typs verbunden war 1 entzündliche MPs und paralleler Anstieg der entzündungshemmenden MRC1+ MPs. Transplantierte iNSCs/NSCs verteilten sich und überlebten im ZNS von EAE-Mäusen, während sie sich vorzugsweise auf der Ebene der meningealen perivaskulären Bereiche neben endogenen MPs ansammeln. Insgesamt, Diese Ergebnisse würden das Vorhandensein einiger noch unbekannter Mechanismen der interzellulären Kopplung zwischen transplantierten Stammzellen und entzündlichen MPs implizieren. Ob diese iNSC/NSC-MP-Kommunikation in vivo nur in perivaskulären Nischen oder auch auf der Ebene anderer neu entstehender immunsensorähnlicher Strukturen des Gehirns, einschließlich des Plexus choroideus, stattfindet, muss noch geklärt werden (Ge et al., 2017).
Anschließend untersuchten wir die zugrunde liegenden immunologischen Mechanismen, die die positiven Auswirkungen von NSCs auf MPs während einer chronischen Neuroinflammation auslösen. Die ungezielte Analyse kleiner Moleküle passender Liquor- und Plasmaproben ergab tiefgreifende Stoffwechselveränderungen im Liquor von EAE-Mäusen, mit Unterschieden zwischen der frühen und der verzögerten Krankheitsphase.
Carnitin, Leucin + Isoleucin, Citrullin, Allantoin, Ornithin, und Harnsäure waren bei den mit PBS behandelten Kontroll-EAE-Mäusen auf dem Höhepunkt der Erkrankung alle signifikant erhöht. Unsere Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Beweisen überein, die zeigen, dass Leucin, sowie Harnsäure und ihr Nebenprodukt Allantoin, sind alle im Liquor von MS-Patienten erhöht (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Bei MS wurde dagegen kein erhöhter Carnitinspiegel im Liquor berichtet, Bei nicht-MS-bedingten entzündlichen Erkrankungen des ZNS wurde ein erheblicher Anstieg beschrieben, wie Enzephalitis (Wikoff et al., 2008) und Meningitis (Shinawi et al., 1998).
Umgekehrt, nur Succinat zeigte eine verzögerte Wirkung (d.h., 45 dpi) Anstieg des Liquor von PBS-behandelten Kontroll-EAE-Mäusen. Succinat entwickelt sich zu einem wertvollen In-vivo-Biomarker für Stoffwechselstörungen und Entzündungsaktivität (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills und O’Neill, 2014). Wichtig, Wir fanden heraus, dass Succinat im Liquor von iNSC-/NSC-transplantierten Mäusen signifikant verringert war. Die Reduzierung von CSF-Succinat nach iNSC oder NSC-Transplantation war von Interesse und könnte eine herausragende Rolle bei der Beeinträchtigung chronischer Neuroinflammation spielen.
Vom Typ freigesetztes Succinat 1 Inflammatorische MPs sind ein wichtiges Entzündungssignal, das mit seinem spezifischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor SUCNR1 interagiert. SUCNR1 fungiert als Frühdetektor für metabolischen Stress bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen, einschließlich Renin-induzierter Hypertonie, Ischämie/Reperfusionsschaden, Entzündung, Blutplättchenaggregation, und retinale Angiogenese (de Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Vor allem, Wir fanden heraus, dass die Expression von SUCNR1 für die therapeutische Wirkung transplantierter NSCs in vivo erforderlich ist.
Die durch Succinat vermittelte Aktivierung von SUCNR1 auf iNSCs und NSCs von Nagetieren und Menschen aktiviert die Kalziumsignalisierung und die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierung in vitro, Dies löste den Erwerb eines konzertierten entzündungshemmenden Phänotyps in NSCs aus. Einerseits, SUCNR1 aktivierte die Sekretion von PGE2, ein etablierter pleiotroper Immunmodulator, dessen Funktion auf mehrere Zelltypen innerhalb der entzündeten Mikroumgebung abzielt, darunter auch Abgeordnete (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). Auf der anderen Seite, Die Succinat-SUCNR1-Signalisierung in iNSCs und NSCs führte zur Hochregulierung von zwei Mitgliedern der SLC13-Cotransporterfamilie (d.h., SLC13A3 und SLC13A5) und Aufnahme von extrazellulärem Succinat.
In vivo, Wir zeigen ein wirksames Abfangen von extrazellulärem lokalem Succinat durch NSCs, die EAE-Mäusen über den Liquorkreislauf injiziert werden, was vorherrschend ist, im Vergleich zur Sekretion von PGE2. Der Verlust der SUCNR1-abhängigen Signalübertragung in transplantierten NSCs führte zu einer deutlichen Verringerung ihrer entzündungshemmenden und neuroprotektiven Wirkungen, wohingegen Sucnr1-/- NSC-Transplantate keinen Unterschied im Überleben zeigten, Verteilung, und Differenzierung gegenüber Kontroll-NSCs.
Wir gehen dann davon aus, dass das extrazelluläre Succinat je nach Typ sezerniert wird 1 Inflammatorische MPs initiieren ein Auffangverhalten, das transplantierte NSCs als Reaktion auf eine erhöhte Substratverfügbarkeit anpassen (Srisawang et al., 2007). Diese neuartige interzelluläre Stoffwechselkopplung passt gut zu der verfügbaren Literatur, die dies zeigt, innerhalb spezifischer Mikroumgebungen, Zellen konkurrieren um verfügbare Nährstoffe, die Funktion und das Schicksal des anderen beeinflussen (Pearce und Pearce, 2013).
Wir gehen davon aus, dass der Succinatabbau durch SUCNR1-exprimierende iNSCs und NSCs eine entscheidende Rolle bei der Verringerung der Verfügbarkeit eines wichtigen Stoffwechselsignals in entzündlichen Kontexten spielen könnte, in denen die Wechselwirkungen zwischen transplantierten Stammzellen und Wirtsimmunzellen komplementär werden (Pluchino und Cossetti, 2013). Allgemeiner, Unsere Erkenntnisse stimmen mit dem Provokativen überein, und doch immer noch im Entstehen begriffen, Konzept von NSCs als angestammten Wächtern des Gehirns, die mehrere komplementäre immunmodulatorische und gewebetrophische Wirkungen ausüben können (Martino und Pluchino, 2007).
Weitere Studien sind erforderlich, um die Funktion der Succinat-SUCNR1-Achse bei neuroimmunen Interaktionen weiter zu charakterisieren, liefern zusätzliche Einblicke in die entscheidende Rolle des Zellstoffwechsels für neurale Stamm-/Vorläuferzellen (Knobloch and Jessberger, 2017), und ergänzende pharmakologische Interventionen zu entwickeln, die auf diesen Signalweg im chronisch entzündeten Gehirn abzielen.
Abschließend, Wir zeigen hier, dass NSCs das extrazelluläre Succinat wahrnehmen, das sich im chronisch entzündeten ZNS ansammelt, um die Neuroinflammation über Succinat-SUCNR1-abhängige Mechanismen zu lindern. Unsere Arbeit identifiziert einen neuartigen entzündungshemmenden Mechanismus, der das Regenerationspotenzial somatischer und direkt induzierter NSCs untermauert, Damit wird der Weg für eine neue Ära personalisierter Stammzellmedikamente für chronisch entzündliche und degenerative neurologische Erkrankungen geebnet.
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