Última atualização: Agosto 17, 2026
Succinato extracelular derivado de macrófagos licencia células-tronco neurais para suprimir neuroinflamação crônica
Destaques
• NSCs de tecidos somáticos ou reprogramação direta reprimem igualmente a neuroinflamação
•Succinato extracelular ativa SUCNR1/GPR91 em NSCs
• NSCs ativadas secretam PGE2 e eliminam succinato, assim reprogramando o tipo 1 Deputados
•As NSCs mutantes Sucnr1 reduziram a atividade anti-inflamatória após o transplante
Resumo
Célula-tronco neural (NSC) o transplante pode influenciar as respostas imunológicas e suprimir a inflamação no SNC. Metabólitos, como succinato, modular o fenótipo e a função das células imunológicas, mas não está claro se e como as NSCs também são ativadas por esses imunometabólitos para controlar a imunorreatividade e as respostas inflamatórias. Aqui, mostramos que as NSCs somáticas e diretamente induzidas transplantadas melhoram a inflamação crônica do SNC, reduzindo os níveis de succinato no líquido cefalorraquidiano, diminuindo assim o fagócito mononuclear (Deputado) infiltração e dano secundário ao SNC. MPs inflamatórios liberam succinato, que ativa o receptor de succinato 1 (SUCNR1)/GPR91 em NSCs, levando-os a secretar prostaglandina E2 e eliminar succinato extracelular com conseqüentes efeitos antiinflamatórios. Por isso, nosso trabalho revela um papel inesperado para o eixo succinato-SUCNR1 em NSCs somáticas e diretamente induzidas, que controla a resposta das células-tronco aos sinais metabólicos inflamatórios liberados por tipo 1 MPs no cérebro cronicamente inflamado.
Introdução
Os avanços na biologia das células estaminais aumentaram a esperança de que as doenças do SNC possam ser melhoradas por medicamentos com células estaminais não hematopoiéticas. (Martino e Pluchino, 2006). Fornecemos evidências convincentes de que o transplante de células-tronco neurais somáticas (NSC) melhora as características clínico-patológicas de modelos animais de distúrbios inflamatórios do SNC. Além da substituição estrutural de células lesionadas do SNC, nosso trabalho mostrou que as NSCs transplantadas se envolvem em programas complexos de comunicação entre enxerto e hospedeiro de células-tronco, em geral, levando ao suporte trófico e à modulação das respostas imunes adaptativas e inatas (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino e Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009b). Especificamente, Os transplantes de NSC reduzem a carga de inflamação no local da lesão (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009um), diminuir o número do tipo 1 fagócitos mononucleares inflamatórios (Deputados) (Cusimano et al., 2012), e promover a cura do SNC lesionado através de mecanismos ainda pouco caracterizados.
No entanto, a tradução clínica de terapias experimentais de NSC ainda é limitada pelas fontes de onde as NSC humanas (hNSCs) são derivados (Anderson et al., 2017), a imunogenicidade intrínseca de linhas hNSC alogênicas (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Arroz et al., 2013), e a estabilidade do chamado “lote de células clínicas pretendido” (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). NSCs induzidos diretamente autólogos e estavelmente expansíveis (iNSCs) dos fibroblastos dérmicos dos pacientes estão emergindo como uma alternativa válida às terapias NSC (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). A reprogramação direta em iNSCs evita a laboriosa progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação em linhagens desejadas descritas para células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) tecnologia (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Portanto, produzir iNSCs estavelmente expansíveis a partir de células somáticas representa a maneira mais viável de obter células-tronco cerebrais autólogas para aplicações clínicas posteriores (Wörsdörfer et al., 2013). No entanto, a eficácia das iNSCs reprogramadas diretamente no tratamento de distúrbios inflamatórios do SNC ainda não foi testada.
Em formas progressivas de esclerose múltipla (EM), a inflamação crônica do SNC é sustentada pela ativação generalizada de MPs que incluem microglia residente no SNC e macrófagos infiltrantes derivados de monócitos (Mallucci et al., 2015). MPs são encontrados em lesões de substância cinzenta, perto de neurites em degeneração e corpos celulares neuronais (Peterson et al., 2001), e em lesões de substância branca, onde a borda externa da microglia ativada está associada a danos crônicos nos tecidos (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Áreas de substância branca de aparência normal também são caracterizadas por acúmulo de MP, o que leva à formação de nódulos microgliais que conduzem à patologia da doença, independentemente da ativação concomitante de células T (Moll et al., 2011). O papel prejudicial da inflamação crónica causada por MP na EM progressiva também é apoiado por evidências em modelos de doenças animais, onde sua carga geral se correlaciona com a função neuronal prejudicada (Planche et al., 2017), atrofia cerebral (Árvore et al., 2015), e respostas regenerativas reduzidas (Jiang et al., 2014).
A ativação de MPs por estímulos pró-inflamatórios causa uma mudança metabólica em direção à glicólise e redução da fosforilação oxidativa (OXPHOS) (Kelly e O'Neill, 2015). Evidências recentes sugerem que, dentro desta religação metabólica, tipo 1 MPs inflamatórios acumulam succinato, com implicações fisiopatológicas importantes (Tannahill et al., 2013). O succinato intracelular inibe a atividade das enzimas prolil hidroxilases (Doutorados), estabilizando assim o elemento responsivo à hipóxia (SEI)-1α e induzindo a transcrição de interleucina (IL)-1b (Tannahill et al., 2013). Além disso, oxidação do succinato pela succinato desidrogenase (DSS) reaproveita mitocôndrias da síntese de ATP para espécies reativas de oxigênio (ROS) produção como sinal pró-inflamatório adicional (Mills et al., 2016). Tipo 1 MPs inflamatórios também liberam succinato extracelularmente e regulam positivamente seu receptor cognato de succinato 1 (SUCNR1), um receptor acoplado à proteína G (também conhecido como GPR91), que funciona como sensor autócrino e parácrino para aumentar a produção de IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).
Como tal, O metabolismo está emergindo como um importante alvo terapêutico para modular a ativação de ambos os macrófagos (Kelly e O'Neill, 2015) e microglia (Orihuela et al., 2016), e as vias relacionadas ao succinato têm funções moduladoras imunológicas importantes para doenças inflamatórias agudas e crônicas (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).
Dadas as propriedades imunomoduladoras estabelecidas das NSCs (Pluchino e Cossetti, 2013), nós hipotetizamos que as NSCs podem exercer seus efeitos terapêuticos na neuroinflamação crônica, modulando o metabolismo do MP para a redução do dano secundário ao SNC.
Nesse trabalho, investigamos os mecanismos moleculares que sustentam a capacidade das NSCs somáticas e diretamente induzidas de neutralizar as alterações metabólicas do tipo 1 MPs inflamatórios in vivo e in vitro. Mostramos que iNSCs e NSCs transplantadas são funcionalmente equivalentes na melhoria da neuroinflamação crônica em camundongos com encefalomielite autoimune experimental (EAE). iNSCs / NSCs transplantadas mudam o perfil de ativação de microglia residente no SNC e macrófagos infiltrantes derivados de monócitos em direção a um fenótipo antiinflamatório, bem como reduzir os níveis do succinato imunometabólico no líquido cefalorraquidiano (LCR). iNSCs/NSCs também diminuem o succinato extracelular liberado por tipo 1 MPs inflamatórios para reprogramar seu metabolismo em direção a OXPHOS in vitro. Mecanisticamente, mostramos que o succinato é secretado por tipo 1 MPs provocam em iNSCs/NSCs uma cascata de sinalização SUCNR1 a jusante, o que permite sua atividade anti-inflamatória. Esta função anti-inflamatória licenciada por succinato de iNSCs/NSCs é mediada pela secreção de prostaglandina (PG) E2, bem como pela eliminação considerável de succinato extracelular. A perda da função Sucnr1 em NSCs leva a atividades antiinflamatórias significativamente reduzidas in vitro e in vivo após transplante em EAE.
Nosso estudo revela um eixo succinato-SUCNR1 que esclarece como as NSCs respondem a sinais metabólicos inflamatórios para inibir a ativação do tipo 1 MPs na neuroinflamação crônica.
Resultados
O transplante de NSC melhora a neuroinflamação crônica e está associado à redução do imunometabólito succinato no líquido cefalorraquidiano
Primeiro avaliamos os efeitos da injeção intracerebroventricular (ICV) transplante no pico da doença (DP) de iNSCs ou NSCs em camundongos com EAE crônica induzida por MOG35-55 e comparou-os com camundongos EAE controle tratados com PBS. Antes do transplante, iNSCs e NSCs foram expandidos, caracterizado (Figura S1), e rotulado com farnesilado (f)GFP in vitro. No 30 dias pós-transplante (dpt), Os transplantes iNSC e NSC sobreviveram, distribuído, e integrado no cérebro EAE e na medula espinhal (Figura S2). Apenas uma minoria de células fGFP+ recuperadas (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) estavam proliferando (Figura 1A) ou expressando neuronal (Figura 1B), astroglial (Figura 1C), ou oligodendroglial (Figura 1D) marcadores de linhagem (Figura S2). A maioria (∼75%) descobriu-se que das iNSCs que sobreviveram ao transplante não expressavam nenhum dos marcadores de linhagem neural testados e estavam localizadas em torno de áreas semelhantes a nichos perivasculares meníngeos próximas a MPs endógenos F4/80+ (Figura 1E), como observado em enxertos somáticos de NSC (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). O transplante de iNSCs induziu um efeito significativo e duradouro (até 90 dpt) melhoria das pontuações EAE, que começou a partir 15 para 20 dpt em diante (Figuras 1F e S2). A recuperação funcional também foi confirmada pela análise automatizada da marcha assistida por computador (Figura S2). Geral, iNSCs transplantados por icv foram seguros e levaram à recuperação comportamental e patológica.
Em seguida, analisamos a composição dos infiltrados inflamatórios do SNC via citometria de fluxo ex vivo em iNSC- e camundongos EAE controle transplantados com NSC versus tratados com PBS. O transplante de iNSCs ou NSCs não teve efeitos na fração de células T infiltrantes do SNC, Células B, e total de deputados, bem como nos subconjuntos de células T CD3+/CD4+ (incluindo Th1, Segunda-feira, Treg, ThGM-CSF, e subconjuntos Th17) no 30 dpt (Figura S3). Em vez de, iNSC- ou camundongos EAE transplantados com NSC mostraram uma mudança significativa no perfil de ativação de células CX3CR1+ com diminuição de 1,5 vezes do tipo CD80+ 1 microglia inflamatória e aumento paralelo da microglia anti-inflamatória MRC1+ (Figura 1G). Da mesma maneira, Infiltração no SNC (derivado de monócitos) Macrófagos CCR2+ de iNSC- ou camundongos EAE transplantados com NSC sofreram mudança fenotípica significativa com diminuição de ∼1,3 vezes do tipo CD80+ 1 macrófagos inflamatórios e aumento paralelo de 1,8 vezes dos macrófagos anti-inflamatórios MRC1 + (Figura 1H). Este efeito foi acompanhado por uma redução significativa da expressão do tipo 1 marcador inflamatório MP induzível óxido nítrico sintase (iNOS) por MPs F4/80+ in vivo (Figuras 1I e S3).
Em seguida, analisamos os níveis de expressão dos principais profissionais- e genes anti-inflamatórios em todo o SNC. iNSC- e camundongos EAE transplantados com NSC exibiram níveis significativamente reduzidos de interleucina-1 beta (II1b) no cérebro e na medula espinhal e níveis aumentados de receptor de manose tipo C 1 (Mrc1) na medula espinhal, tanto em 10 dpt (Figura 1J).
Não encontramos diferenças significativas na barreira hematoencefálica (BBB) permeabilidade em 30 dpt ao comparar iNSC-/NSC transplantados com camundongos EAE controle tratados com PBS (Figura S3).
Finalmente, iNSC- e camundongos EAE transplantados com NSC acumularam perda axonal significativamente reduzida (Figura 1K) e desmielinização (Figura 1L) na medula espinhal.
Dada a importância estabelecida do metabolismo na regulação do fenótipo e função dos MPs, investigamos se os transplantes de NSC afetaram o microambiente metabólico neuroinflamatório. Para este fim, realizamos um perfil metabólico não direcionado de metabólitos polares por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) de amostras de LCR e plasma correspondentes (Tabela S1). Camundongos EAE controle tratados com PBS mostraram um aumento significativo de vários níveis de LCR (mas não plasma) metabólitos, entre os quais o succinato só atingiu o pico em 45 dias pós-imunização (dpi) (correspondente a 30 dpt; Figura 1M). Camundongos EAE não submetidos à cirurgia também apresentaram aumento significativo de succinato apenas no LCR em 45 dpi (versus ratos de controle saudáveis), que não foi diferente dos níveis de succinato nos camundongos EAE controle tratados com PBS no LCR (Figura S3).
Considerando que não detectamos nenhuma alteração significativa nos níveis de metabólitos plasmáticos entre camundongos EAE controle transplantados com iNSC / NSC e tratados com PBS (Tabela S1), descobrimos que o transplante de iNSCs ou NSCs levou a uma queda significativa no succinato no LCR em 30 dpt (Figura 1M; Tabela S1).
Avançar, não encontramos diferenças significativas no succinato do LCR ao comparar camundongos EAE tratados com PBS versus camundongos EAE injetados icv com fibroblastos de camundongo (MFs) como células de controle (Figura S3).
Por isso, iNSCs e NSCs injetados diretamente no EAE CNS induzem uma mudança fenotípica específica de MPs, que está associado à redução do imunometabólito succinato apenas no LCR e à melhora da neuroinflamação crônica.
NSCs reduzem os níveis de succinato e reprogramam o metabolismo do tipo 1 Mφ inflamatório in vitro
Em seguida, investigamos os mecanismos moleculares através dos quais iNSCs/NSCs exibem atividades anti-inflamatórias no tipo 1 Deputados, usando um sistema in vitro que recapitula as interações entre MPs e iNSCs/NSCs. Macrófagos ingênuos derivados da medula óssea (Mφ) foram polarizados em um tipo 1 fenótipo inflamatório com LPS (MφLPS), conforme descrito (Tannahill et al., 2013). MφLPS foram então co-cultivados com iNSCs (MφLPS-iNSCs) ou NSCs (MφLPS-NSCs) em um sistema trans-well que evita contatos célula a célula (Figura 2A). Mφ não polarizados foram usados como controles.
O perfil de expressão gênica de microarray mostrou alterações transcricionais significativas em MφLPS com 7,401 genes afetados (versus Mφ; valor p ajustado < 0.1; Figura 2B; Tabela S2) e 51 genes diferencialmente expressos em MφLPS-iNSCs ou MφLPS-NSCs (versus MφLPS; valor p ajustado < 0.1; Figuras 2B e 2C; Tabela S2). Este último conjunto de genes foi enriquecido em processos biológicos relacionados à regulação positiva da ativação de leucócitos (IR: 0002696), diferenciação de leucócitos mieloides (IR: 0002761), e processos do sistema imunológico (IR: 0002376). A validação independente de qRT-PCR de genes pró-inflamatórios Mφ selecionados confirmou uma regulação negativa significativa dos níveis de expressão de Il12b, Il15, Il15ra, e CD69, bem como os genes inflamatórios clássicos Nos2, fator de necrose tumoral (TNF), e Il1b em MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSCs (versus MφLPS; Figura 2D). Este efeito foi acoplado à concomitante regulação positiva dos níveis de expressão de genes associados a um fenótipo antiinflamatório Mφ, como uronil-2-sulfotransferase (Ust) e antígeno de células estromais da medula óssea 1 (Bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), bem como arginase 1 (Arg1) e Mrc1 (versus MφLPS; Figura 2E). Quando iNSCs/NSCs foram cocultivados com lipopolissacarídeo (LPS)-células microgliais BV2 de camundongo ativadas como antes, também foi observada redução significativa dos níveis de expressão dos genes pró-inflamatórios Nos2 e Il1b (Figura 2F).
Para vincular perfis de expressão gênica com estados metabólicos funcionais, avaliamos a taxa basal de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) de MφLPS como leituras de seu ácido tricarboxílico (ACT) ciclo e atividades glicolíticas, respectivamente. Encontramos uma redução significativa de OCR e um aumento significativo de ECAR em MφLPS (versus Mφs). Em vez de, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSCs passaram por restauração significativa dos valores de OCR e ECAR (versus MφLPS; Figuras 2G e 2H), como observado em Mφ mudando para um fenótipo antiinflamatório (O'Neill e Pearce, 2016).
Num esforço para esclarecer os determinantes metabólicos destes efeitos anti-inflamatórios, realizamos uma análise LC-MS não direcionada do conteúdo extracelular e intracelular de metabólitos de moléculas pequenas de MφLPS. Como esperado, A estimulação de LPS mudou profundamente o meio metabólico extracelular e intracelular de Mφ (MφLPS) (versus Mφ; Tabela S3). Em co-culturas, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSCs mostraram redução significativa de glutamato extracelular, GABA, e succinato (versus MφLPS; Figura 2I; Tabela S3). Além disso, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSCs também apresentaram uma redução significativa de succinato e itaconato intracelular (versus MφLPS; Figura 2J; Tabela S3).
Consistente com a redução dos níveis de succinato, descobrimos que MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSCs exibiram níveis significativamente reduzidos de HIF-1α, da isozima M2 da proteína piruvato quinase a montante (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figura 2K), bem como de IL-1β (versus MφLPS; Figura 2L).
Completamente, estes dados in vitro fornecem evidências de que iNSCs/NSCs reduzem o acúmulo de succinato intracelular e extracelular em coculturas com tipo 1 deputados inflamatórios, reprogramando-os para um fenótipo antiinflamatório OXPHOS.
Sinais de succinato via SUCNR1/GPR91 em NSCs de camundongos e humanos
Dada a importância do succinato como sinal imunometabólico, investigamos se o succinato liberado por tipo 1 MPs pró-inflamatórios poderiam regular a atividade das células circundantes in situ, incluindo o de iNSCs/NSCs transplantados.
Descobrimos que iNSCs/NSCs transplantados detectados nas proximidades de áreas perivasculares meníngeas (Figuras 3A e 3B ) e deputados F4/80+ (Figura 3C) expressou SUCNR1 in vivo no SNC. SUCNR1 também foi expressa em nível proteico em iNSCs e NSCs in vitro, mas não em MFs (Figura 3D).
Para avaliar melhor se SUCNR1 em iNSCs/NSCs foi funcionalmente ativado por succinato, investigamos sua cascata de sinalização a jusante in vitro. Quando exposto ao succinato (Figura 3E; Rubik et al., 2008), 34.2% (±7,4%) de iNSCs e 31.7% (±6,5%) de NSCs mostraram uma liberação de reservas intracelulares de cálcio (Figuras S4 e 3F). Esta resposta foi seguida por uma regulação positiva significativa da proteína quinase ativada por mitógeno fosfo-p38 (Figura 3G), indicativo de sua ativação. Confirmamos a expressão de SUCNR1 e SUCNR1 também em NSCs fetais humanos (hNSCs) e iNSCs humanos (hiNSCs) (Figuras 3H e 3I). Como em iNSCs de mouse, sinalização p38 dependente de succinato foi evocada em hiNSCs, mas não em hiNSCs pré-tratados com o inibidor seletivo de SUCNR1 4c (Figura 3J).
Por isso, iNSCs e NSCs de camundongos e humanos expressam SUCNR1 funcional, que induz uma via de sinalização a jusante de sua estimulação com o imunometabólito succinato.
Estimulação SUCNR1 inicia a secreção de prostaglandina E2 por NSCs
Para esclarecer as consequências funcionais da sinalização SUCNR1 em NSCs, geramos NSCs de ratos sem Sucnr1 (Sucnr1-/- NSCs) (Rubik et al., 2008; Figura S4). Comparado com NSCs de controle, Sucnr1 -/- NSCs mostraram curvas de crescimento e diferenciação semelhantes in vitro (Figura S4). No entanto, quando exposto ao succinato em diferentes momentos e concentrações, Sucnr1 -/- NSCs não mostraram regulação positiva de fosfo-p38 (Figura S4). Estimulação com glutamato ou ATP + tapsigargina induziu em NSCs Sucnr1 -/- uma resposta de cálcio semelhante à de NSCs de controle (Figura S4). Pelo contrário, o tratamento com succinato não provocou liberação de cálcio dos estoques intracelulares (Figura S4), que indicou uma sinalização SUCNR1 defeituosa em Sucnr1 -/- NSCs.
Em seguida, realizamos um microarranjo de perfil de expressão gênica após tratamento com succinato em NSCs de controle e NSCs Sucnr1 -/- (Tabela S4). Descobrimos que a prostaglandina-endoperóxido sintase 2 (Ptgs2), a enzima chave na biossíntese de PG que codifica o PTGS2 induzível, foi o gene mais regulado positivamente em NSCs de controle estimuladas por succinato (mudança de dobra log2 1.05), mas não em NSCs Sucnr1 -/- estimuladas por succinato (mudança de dobra log2 −0,43; Figura 4A). Validamos esses resultados em Ptgs2 por qRT-PCR, confirmando que seus níveis de expressão foram significativamente regulados positivamente (2.1- para uma mudança de 2,7 vezes) em iNSCs e NSCs estimulados por succinato, enquanto eles não estavam em NSCs Sucnr1 -/- tratados com succinato (Figura 4B).
Dado o papel da PGE2 como reguladora dos efeitos imunossupressores das células-tronco mesenquimais (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), testamos seu acúmulo em meios de cultura de tecidos de iNSCs, NSC, e Sucnr1 -/- NSCs após estimulação com succinato. iNSCs e NSCs, mas não Sucnr1-/- NSCs, mostrou significativo (>2.5-dobrar) aumento de sua liberação basal de PGE2 já 30 min após succinato. Este efeito induzido pelo succinato foi abolido pelo pré-tratamento com o bloqueador irreversível PTGS2 SC-58125 (Figura 4C). Como em iNSCs de mouse, a exposição de hiNSCs ao succinato provocou um aumento significativo das concentrações de PGE2 em meios de cultura de tecidos, considerando que novamente o pré-tratamento com SC-58125 ou 4c impediu sua liberação (Figura 4D).
Para estender ainda mais a relevância dessas descobertas às coculturas entre NSCs e MφLPS, analisamos os níveis de PGE2 em meios de cultura de tecidos. Descobrimos que os MφLPS-NSCs acumularam níveis mais elevados de PGE2 em comparação com os MφLPS, Considerando que o pré-tratamento de NSCs co-cultivadas com SC-58125 reduziu significativamente os níveis de PGE2 (Figura 4E). O pré-tratamento SC-58125 de NSCs também foi associado a um aumento significativo da expressão de Il1b em MφLPS (Figura 4F) e com uma redução dos valores de OCR indicativos de um fenótipo pró-inflamatório (Figura 4G). No entanto, notamos que as NSCs pré-tratadas com SC-58125 retiveram alguns efeitos antiinflamatórios residuais no MφLPS em comparação com as NSCs Sucnr1 -/- (Figura 4F). Pelo contrário, A perda de função do Sucnr1 nas NSCs aboliu completamente seus efeitos antiinflamatórios no MφLPS (Figuras 4F e 4G). Nós também mostramos que a capacidade antiinflamatória dependente de PGE2 observada das NSCs é conservada e relevante para NSCs humanas.
Como tal, hiNSCs induziram uma redução significativa da expressão de Il1b em MφLPS em co-culturas (Figura 4H), que foi juntamente com uma restauração dos valores de OCR (Figura 4I) e aumento dos níveis de PGE2 em meios de cultura de tecidos (Figura 4J). Estes efeitos foram completamente suprimidos pelo pré-tratamento de hiNSCs com o inibidor seletivo de SUCNR1 4c (Figuras 4H–4J).
Por isso, a ativação da via de sinalização SUCNR1 em NSCs de camundongos e humanos desencadeia a liberação de PGE2 levando a efeitos antiinflamatórios no tipo 1 Deputados.
No entanto, experimentos de inibição direcionados ao PTGS2 ou ao SUCNR1 antecipam que mecanismos adicionais dependentes de SUCNR1 - independentes de PGE2 - provavelmente desempenharão um papel fundamental nos efeitos antiinflamatórios das NSCs.
A estimulação SUCNR1 desencadeia a absorção de succinato pelas NSCs
Matrizes de expressão gênica de NSCs estimuladas por succinato revelaram que, além de Ptgs2, NaCT/Slc13a5 estava entre os genes mais regulados positivamente no tipo selvagem (Peso) NSC (mudança de dobra log2 = 0.49), mas não em NSCs Sucnr1-/- (mudança de dobra log2 = −0,12). SLC13A5 é um cotransportador de dicarboxilato conhecido por estar envolvido no transporte de succinato (Srisawang et al., 2007). Dada a depleção consistente de succinato encontrada tanto in vivo no LCR de iNSC- ou camundongos EAE transplantados com NSC e in vitro em coculturas com MφLPS, levantamos a hipótese de que iNSCs/NSCs ativariam SLC13A5 para eliminar succinato.
Descobrimos que a expressão de SLC13A5, bem como do cotransportador de dicarboxilato de alta afinidade SLC13A3, foram significativamente aumentados em iNSCs e NSCs, mas não em NSCs Sucnr1-/-, após estimulação com succinato (Figura 5A). De forma similar, hiNSCs expostos ao succinato regularam positivamente os níveis de expressão proteica de ambos os co-transportadores SLC13 in vitro (Figura 5B).
Em seguida, investigamos o papel desses co-transportadores medindo a captação de succinato em iNSCs e NSCs. Descobrimos que tanto os iNSCs como os NSCs acumularam significativamente [14C]-succinato (Figura 5C) enquanto reduz a quantidade de extracelular [14C]-succinato em meios de cultura de tecidos (Figura 5D). Sucnr1-/- NSCs nem acumulados [14C]-succinato intracelularmente nem o esgotaram extracelularmente (Figuras 5C e 5D). Interessantemente, Sucnr1-/- NSCs, que demonstramos não ter efeitos na expressão de Il1b em MφLPS (Figura 4F), não conseguiu reduzir os níveis de succinato extracelular em co-culturas com MφLPS (Figura 5E). Como mais uma prova da importância da depleção de succinato na modulação do fenótipo do tipo 1 deputados pró-inflamatórios, mostramos que o tratamento com recombinante ativo (R)A subunidade A do complexo SDH é capaz de reduzir significativamente a expressão de Il1b em MφLPS (Figura S5).
Por isso, A sinalização SUCNR1 em NSCs estimula a captação do imunometabólito succinato, esgotando assim o pool extracelular disponível que sustenta a ativação autócrina e parácrina do tipo 1 Deputados.
Transplante de NSCs com perda de função Sucnr1 mostra capacidade prejudicada de melhorar a neuroinflamação crônica in vivo
Para confirmar o papel do eixo succinato-SUCNR1 na mediação da resposta dos enxertos NSC ao succinato in vivo, avaliamos os efeitos do transplante icv de NSCs Sucnr1 -/- em camundongos com EAE crônica.
No 30 dpt, Sucnr1 -/- NSCs sobreviveram, distribuído, e integrado no cérebro e medula espinhal da EAE sem diferenças significativas em comparação com NSCs de controle (Figura S6). No entanto, o transplante de NSCs Sucnr1 -/- induziu apenas uma ligeira recuperação de déficits comportamentais de EAE versus camundongos EAE de controle tratados com PBS (Pontuação EAE — Sucnr1-/- NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), que foi significativamente menos pronunciado (50% do efeito) do que o observado em camundongos EAE transplantados com NSCs de controle (Pontuação EAE – NSCs: 2.1 ± 0.3; Figura 6A).
A análise ex vivo baseada em citometria de fluxo da composição de infiltrados inflamatórios do SNC mostrou que o transplante de camundongos EAE com NSCs Sucnr1 -/- não conseguiu mudar as proporções do tipo 1 MPs inflamatórios e antiinflamatórios - incluindo micróglia CX3CR1 + e macrófagos infiltrantes derivados de monócitos CCR2 + - em contraste com os efeitos dos NSCs de controle (Figuras 6B e 6C). A patologia tecidual post mortem confirmou ainda os efeitos reduzidos de proteção tecidual dos enxertos Sucnr1 -/- NSC (Figuras 6D e 6E).
Em seguida, investigamos os níveis de PGE2 e succinato em amostras de LCR e plasma correspondentes de camundongos EAE controle transplantados com NSC e tratados com PBS. Descobrimos que tanto os NSCs Sucnr1 -/- quanto os NSCs de controle não conseguiram induzir mudanças significativas nos níveis de PGE2 no LCR. A PGE2 plasmática aumentou significativamente apenas em camundongos EAE (versus controles saudáveis), sem efeito de tratamento observado (Figura 6F). Importante, enquanto o transplante de NSCs de controle reduziu o succinato no LCR (HC: 5.524 × 107 você. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 você. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 você. ± 0.44), Os enxertos Sucnr1 −/− NSC não mostraram efeitos (Sucnr1-/- NSCs: 10.40 × 107 você. ± 2.59; Figura 6G).
Estes dados confirmam a necessidade de uma via de sinalização SUCNR1 funcional na regulação dos efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores dos transplantes de NSC in vivo e sublinham a importância da eliminação de succinato como um mecanismo de ação anti-inflamatório predominante das NSC..
Discussão
Existe uma necessidade clínica não atendida de desenvolver abordagens celulares e moleculares para atingir os principais fatores da fisiopatologia das condições neuroinflamatórias crônicas que incluem formas progressivas de EM (Volpe et al., 2016). Em princípio, as células-tronco possuem um potencial terapêutico distinto daquele das pequenas moléculas e dos produtos biológicos e se estende muito além da área da medicina regenerativa clássica. Parte droga e parte dispositivo, células-tronco podem funcionar como agentes biológicos modificadores de doenças (DMAs) que detectam diversos sinais, migram para locais específicos do corpo, integrar entradas para tomar decisões, e executar comportamentos de resposta complexos no contexto de um microambiente tecidual específico (Fischbach et al., 2013). Todos esses atributos poderiam ser aproveitados para tratar vários processos de doenças, incluindo a inflamação persistente causada por MP e a degeneração tecidual que ocorre na EM progressiva.
Aqui, usamos acessível, autólogo, e iNSCs expansíveis de forma estável (Thier et al., 2012), bem como NSCs somáticos, investigar os efeitos do transplante de células-tronco cerebrais em um modelo de neuroinflamação crônica em camundongos, que imita a cascata inflamatória observada na EM progressiva.
Descobrimos que o transplante de iNSCs para a circulação do LCR de camundongos EAE promove resultados equivalentes aos observados anteriormente em camundongos transplantados com NSCs somáticas (Pluchino et al., 2003). iNSCs ou NSCs transplantadas induziram melhora clínica significativa, bem como redução do dano axonal e da mielina, sem redução significativa da permeabilidade BBB em 30 dpt. Estudos adicionais ajudarão a esclarecer se alterações na permeabilidade da BHE ou recrutamento de monócitos inflamatórios para o SNC ocorrem imediatamente após o transplante de iNSCs/NSCs. Se tal efeito tem probabilidade de alterar os principais desfechos clínicos de doenças com alta prevalência de infiltração do SNC por células inflamatórias, como EAE/MS, é difícil prever.
Em vez de, descobrimos que nosso paradigma de transplante estava associado a uma mudança específica no perfil de ativação de células microgliais CX3CR1+ e macrófagos infiltrantes derivados de monócitos CCR2+ com uma diminuição do tipo CD80+ 1 MPs inflamatórios e aumento paralelo dos MPs antiinflamatórios MRC1 +. iNSCs/NSCs transplantados distribuídos e sobreviveram no SNC de camundongos EAE, enquanto se acumula preferencialmente ao nível das áreas perivasculares meníngeas em justaposição aos MPs endógenos. Completamente, essas descobertas implicariam a presença de alguns mecanismos ainda desconhecidos de acoplamento intercelular entre células-tronco enxertadas e MPs inflamatórias. Se esta comunicação iNSC/NSC-MP in vivo ocorre apenas em nichos perivasculares ou também ao nível de outras estruturas emergentes do cérebro, semelhantes a sensores imunológicos, que incluem o plexo coróide, ainda precisa ser abordado. (Ge et al., 2017).
Em seguida, investigamos os mecanismos imunológicos subjacentes que impulsionam os efeitos benéficos das NSCs nas MPs durante a neuroinflamação crônica. A análise de pequenas moléculas não direcionadas de amostras de LCR e plasma correspondentes revelou profundas alterações metabólicas no LCR de camundongos EAE, com diferenças entre as fases inicial e tardia da doença.
Carnitina, leucina + isoleucina, citrulina, alantoína, ornitina, e o ácido úrico aumentaram significativamente nos camundongos EAE controle tratados com PBS no pico da doença. Nossas descobertas são consistentes com evidências publicadas que mostram que a leucina, bem como ácido úrico e seu subproduto alantoína, estão todos aumentados no LCR de indivíduos com EM (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Mônaco et al., 1979). Considerando que o aumento da carnitina no LCR não foi relatado na EM, aumentos importantes foram descritos em condições inflamatórias do SNC não relacionadas à EM, como encefalite (Wikoff et al., 2008) e meningite (Shinawi et al., 1998).
Por outro lado, apenas o succinato apresentou atraso (ou seja, 45 dpi) aumento no LCR de camundongos EAE controle tratados com PBS. O succinato está se tornando um valioso biomarcador in vivo de sofrimento metabólico e atividade inflamatória (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills e O'Neill, 2014). Importante, descobrimos que o succinato estava significativamente diminuído no LCR de camundongos transplantados com iNSC-/NSC. A redução do succinato no LCR após o transplante de iNSC ou NSC foi de interesse e pode ter um papel proeminente na interferência na neuroinflamação crônica.
Succinato liberado do tipo 1 MPs inflamatórios são um sinal inflamatório chave que interage com seu receptor específico acoplado à proteína G, SUCNR1. SUCNR1 atua como um detector precoce de estresse metabólico em diversas condições fisiológicas e patológicas, incluindo hipertensão induzida por renina, lesão de isquemia/reperfusão, inflamação, agregação plaquetária, e angiogênese retinal (de Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Notavelmente, descobrimos que a expressão de SUCNR1 é necessária para os efeitos terapêuticos de NSCs transplantadas in vivo.
A ativação de SUCNR1 mediada por succinato em iNSCs e NSCs de roedores e humanos ativa a sinalização de cálcio e a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPA) fosforilação in vitro, provocando assim a aquisição de um fenótipo antiinflamatório combinado em NSCs. Por um lado, SUCNR1 ativou a secreção de PGE2, um modulador imunológico pleiotrópico bem estabelecido, cuja função tem como alvo vários tipos de células dentro do microambiente inflamado, incluindo deputados (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). Por outro lado, sinalização de succinato-SUCNR1 em iNSCs e NSCs levou à regulação positiva de dois membros da família de co-transportadores SLC13 (ou seja, SLC13A3 e SLC13A5) e captação de succinato extracelular.
In vivo, demonstramos a eliminação eficaz de succinato local extracelular por NSCs injetados em camundongos EAE através da circulação do LCR, que é predominante, em comparação com a secreção de PGE2. A perda da sinalização dependente de SUCNR1 em NSCs transplantadas levou a uma redução significativa nos seus efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores, enquanto os enxertos Sucnr1 -/- NSC não mostraram diferença na sobrevida, distribuição, e diferenciação versus controle NSCs.
Nossa hipótese é então que o succinato extracelular secretado por tipo 1 MPs inflamatórios iniciam um comportamento de eliminação que as NSCs transplantadas ajustam em resposta ao aumento da disponibilidade de substrato (Srisawang et al., 2007). Este novo acoplamento metabólico intercelular se ajusta bem à literatura disponível, mostrando que, dentro de microambientes específicos, as células competem pelos nutrientes disponíveis, afetando a função e o destino um do outro (Pearce e Pearce, 2013).
Prevemos que a depleção de succinato por iNSCs e NSCs que expressam SUCNR1 pode desempenhar um papel crucial na redução da disponibilidade de um sinal metabólico chave em contextos inflamatórios onde as interações entre células-tronco transplantadas e células imunes do hospedeiro se tornam complementares (Pluchino e Cossetti, 2013). Mais geralmente, nossas descobertas estão de acordo com o provocativo, mas ainda emergente, conceito de NSCs como guardiões ancestrais do cérebro capazes de exercer vários efeitos imunomoduladores e tróficos teciduais complementares (Martino e Pluchino, 2007).
Estudos adicionais são necessários para caracterizar melhor a função do eixo succinato-SUCNR1 nas interações neuroimunes, fornecer insights adicionais sobre o papel crítico do metabolismo celular para células-tronco neurais/progenitoras (Knobloch e Jessberger, 2017), e desenvolver intervenções farmacológicas complementares visando esta via no cérebro cronicamente inflamado.
Para concluir, mostramos aqui que as NSCs detectam o succinato extracelular que se acumula no SNC cronicamente inflamado para melhorar a neuroinflamação através de mecanismos dependentes de succinato-SUCNR1. Nosso trabalho identifica um novo mecanismo antiinflamatório que sustenta o potencial regenerativo de NSCs somáticas e diretamente induzidas, abrindo assim caminho para uma nova era de medicamentos personalizados com células estaminais para doenças neurológicas inflamatórias crónicas e degenerativas.
Revisão de Caso Científico
Você gostaria de entender se os programas clínicos atuais, desenvolvimentos de pesquisa recentes, ou abordagens emergentes podem ser relevante para sua situação individual?
Envie sua dúvida para nossa equipe científica. A sede da NBScience no Reino Unido coordena consultas em toda a rede internacional de centros médicos, cientistas, e consultores especializados.
- Revisão das informações que você fornece
- Informações relevantes sobre pesquisas e programas clínicos
- Uma resposta clara focada na sua situação
Sem obrigação. Sua pergunta será analisada confidencialmente.
Apenas informações educacionais e de pesquisa. Este serviço não constituem aconselhamento médico, diagnóstico, prescrição, ou um personalizado recomendação de tratamento.
