Vuelo espacial activa la proteína quinasa C Alfa señalización y modifica el estado de desarrollo de las células neonatales humano cardiovascular Progenitoras

 

impactos Spaceflight función cardiovascular en los astronautas; sin embargo, su impacto en el desarrollo cardíaco y las células madre que forman la base para la reparación cardíaca es desconocida. En consecuencia, se necesita más investigación para descubrir la relevancia potencial de tales cambios en la salud humana. El uso de la microgravedad simulada (SMG) generada por clinorotation de dos dimensiones y la cultura a bordo de la Estación Espacial Internacional (ISS), se evaluaron los efectos de la descarga mecánica en células progenitoras cardiovascular neonatal humana (CPC) propiedades de desarrollo y de señalización. Tras 6-7 días de SMG y 12 días de cultivo ISS, se analizaron los cambios en la expresión génica. Ambos entornos indujeron la expresión de genes que normalmente se asocia con un estado anterior de desarrollo cardiovascular. Para comprender el mecanismo por el cual la ocurrencia de tales cambios, se evaluó la expresión de pequeñas RhoGTPases mechanosensitive en CPC SMG-cultivadas y observó disminución de los niveles de RhoA y CDC42. Dado el efecto de estas moléculas en los niveles de calcio intracelulares, evaluamos los cambios en la señalización no canónica de Wnt / calcio. Después de 6-7 días bajo SMG, CPC mostraron niveles elevados de WNT5A y PRKCA. similar, CPC ISS-cultivadas mostraron niveles elevados de manejo del calcio y la señalización de genes, que correspondía a la proteína quinasa C alfa (PKC), una proteína quinasa dependiente de calcio, después de la activación 30 dias. Akt se activa, mientras que los niveles quinasa regulada por señales extracelulares fosforilados se mantuvieron sin cambios. Para explorar el efecto de la inducción de calcio en CPC neonatales, activamos PKC mediante el tratamiento hWnt5a en la Tierra. Después, primeros niveles de los marcadores de desarrollo cardiovasculares fueron elevados. Transcripciones inducidos por SMG y hWnt5a-tratamiento se expresan dentro del nodo sinoatrial, que puede representar miocardio embrionario mantenido en su estado primitivo. la señalización de calcio es sensible a la descarga mecánica y dirige propiedades de desarrollo de CPC. La investigación adicional en el espacio y en la Tierra puede ayudar a perfeccionar el uso de CPC en las terapias basadas en células madre y destacar los eventos moleculares del desarrollo.

Introducción
A medida que la humanidad se prepara para una mayor presencia en el espacio, los efectos moleculares de microgravedad (MG) han vuelto cada vez más objeto de investigación. Como esta investigación ha evolucionado, la aplicación de MG, ya sea real o simulada, se ha encontrado que tienen un potencial uso terapéutico en la Tierra [1-3]. Así, los esfuerzos para caracterizar la respuesta biológica a las condiciones de gravedad reducida, incluyendo a un nivel molecular, beneficiará a la sociedad, tanto en el espacio y en la Tierra.

La investigación en nuestro laboratorio han demostrado que la microgravedad simulada (SMG) impactos del perfil de desarrollo de células progenitoras cardiovasculares humanos (CPC) de una manera dependiente de la edad [4]. Curiosamente, el análisis de microarrays en esos experimentos identificados pequeñas RhoGTPases y la señalización de Wnt como siendo algunos de los sistemas afectados por el medio ambiente SMG en CPC neonatales.

El efecto de descarga mecánica sobre las células madre embrionarias de ratón (mESCs) se ha demostrado que el impacto diferenciación y stemness, con experimentos realizados por Blaber et al. [5] lo que demuestra que los cuerpos embrioides conservan los marcadores de la auto-renovación y exhibición reducen la expresión del marcador capa germinal definitiva cuando volado en el espacio. sin embargo, en los mismos estudios, cuando los cuerpos embrioides mecánicamente sin carga regresaron a la Tierra, que eran capaces de diferenciar más fácilmente en colonias de cardiomiocitos contráctiles. similar, Jha et al. [6] encontraron que las células madre pluripotentes inducidos por el hombre diferencian más fácilmente en cardiomiocitos usando cultivo en tres dimensiones, junto con transitoria, la exposición temprana a SMG.

Estos experimentos separados pueden representar un fenómeno similar en el que un cultivo de baja gravedad promueve un estado mejorado de stemness bajo SMG o MG que resulta en una mayor capacidad de diferenciación cuando las células se devuelven a las condiciones normales de gravedad. Así, terapias con células madre relevantes para la reparación cardíaca pueden ser mejoradas mediante la manipulación de los mecanismos pertinentes de la señalización mecánica en progenitores cardiovasculares. En particular, inducir mejorada stemness en progenitores cardiovasculares puede facilitar un efecto clínico correspondientemente mejorada en el trasplante.

Las alteraciones en las moléculas de detección mecánicos, tales como las pequeñas RhoGTPases, se cree que está implicada en la adaptación molecular a MG [7,8]. En tono rimbombante, estas moléculas también son capaces de afectar a vías de señalización intracelular, tales como oscilaciones de calcio, que posteriormente se puede activar AKT [9] y extracelular quinasa regulada por señales (ERK) [10]. En el contexto de cardiogenesis, estos procesos son críticos para el mantenimiento de un equilibrio entre las señales inductivas y proliferativas [11,12]. Por lo tanto, manipular el ambiente de gravedad normal de primeros CPC puede poner de relieve un importante mecanismo por el cual primeros progenitores cardíacos desarrollar o ampliar. Estas ideas se pueden aplicar para entender mejor el desarrollo cardiovascular y mejorar los resultados de las células madre basado en terapias regenerativas.

En el contexto de la reparación cardíaca, primeros ensayos clínicos de este tipo de terapias son prometedores [13-15], sino que están bloqueados por un fallo del injerto de células y controversia sobre el tipo celular apropiado [16]. Por lo tanto, la aplicación de los resultados de los experimentos de MG a los experimentos basados ​​en la Tierra puede ayudar a superar las deficiencias de las pruebas clínicas sobre el uso de CPC para la reparación cardíaca.

En un esfuerzo por caracterizar tanto los efectos de MG en una población de primeros CPC, así como el uso potencial de estos cambios en la Tierra, cultivamos CPC humanos neonatales usando un clinostat de dos dimensiones y en el Laboratorio Nacional a bordo de la Estación Espacial Internacional (ISS). Hemos tratado de identificar los cambios en la transcripción de genes implicados en la señalización en respuesta a SMG y MG, así como los efectos de tales cambios de señalización en stemness. entonces Modelamos características de estos cambios moleculares in vitro utilizando una molécula pequeña en condiciones normales de gravedad. Al hacerlo, presentamos componentes de la respuesta celular adaptativa a MG y sus implicaciones para la mejora del potencial regenerativo de CPC neonatales.

Materiales y métodos
Aislamiento y cultivo de principios de CPC
La Junta Institucional de la Universidad de Loma Linda Revisión aprobó el protocolo para el uso de tejido que fue descartado durante la cirugía cardiovascular, sin información privada identificable, para este estudio con una renuncia de consentimiento informado. CPC fueron aisladas de tejido cardiaco de los recién nacidos (1 días-1 mes), como se describió previamente [17]. Brevemente, tejido auricular se cortó en pequeños grupos (~ 1.0 mm3) y después se digirió enzimáticamente usando colagenasa (Roche, Indianápolis, EN) a una concentración de trabajo de 1,0 mg / mL. Después, la solución resultante se pasó a través de un filtro de células de 40 micras. Las células se clonaron en una placa de 96 pocillos por dilución limitante para una concentración final de 0.8 células por pocillo para crear poblaciones de expansión.

Entonces, clones fueron seleccionados para la coexpresión de Isl1 y c-Kit y se suplementaron con medio de crecimiento que comprende 10% suero bovino fetal (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts), 100g / ml de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, California), 1.0% solución no esencial medio esencial mínimo aminoácidos (Life Technologies), y 22% medios de crecimiento de células endoteliales (Lonza, Basilea, Suiza) en Medio 199 (Life Technologies). El kit de detección de Mycoplasma MycoAlert PLUS (Lonza, Basilea, Suiza) se utilizó para la prueba de contaminación por micoplasma

 

 

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