Human Embryonic Stem Cells Cultivation Protocol

 

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures.

At minimum, the cultures must be fed every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, oder “picking” differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Protocol

1. Wartung: Observing Cultures Under the Microscope

Remove one plate of hES cells from the 37°C incubator and bring to the microscope.
Beobachten Sie die Kolonien bei geringer Leistung, mit 2-facher oder 5-facher Vergrößerung, um die Gesamtqualität der Kultur zu beurteilen. Beachten Sie Folgendes: normale mittlere Farbe, keine sichtbaren Verunreinigungen vorhanden sind, Gesamtkoloniegröße, Qualität und Dichte, und alle anderen Beobachtungen.
Beobachten Sie mittlere Farbveränderungen.

Aufgrund der Änderung des pH-Werts und der Erschöpfung der Nährstoffe im Medium nach einer Inkubation über Nacht mit den hES-Zellen, Das Medium ändert sich von einem roten Farbton zu einem “Stroh” Farbe. Wenn das Medium lila erscheint, Es ist eine grundlegende pH-Verschiebung aufgetreten. Wenn das Medium extrem gelb erscheint, Das Medium ist angesäuert. Sehr gelbes Medium kann das Ergebnis extrem überfüllter Kolonien in der Vertiefung oder einer Kontamination sein.

Das Medium sollte jederzeit klar erscheinen. Ein gewisser Anteil an Zelltrümmern im Medium ist jedoch normal, es sollte niemals trüb erscheinen. Wenn ein hoher Anteil an Zelltrümmern beobachtet wird, Die Kultur ist nicht gesund und möglicherweise kontaminiert.
Wenn die Kulturen keine Wartung oder Passage erfordern, Sie können zur Fütterung in die biologische Sicherheitswerkbank gebracht werden

Wenn die Kulturen mehr als ungefähr enthalten 10% differenzierende Kolonien, Die Zellen sollten sein “aufgeräumt” durch manuelles Entfernen der differenzierten Bereiche

Wenn die Kulturen große oder dichte Kolonien enthalten, oder die MEF-Feederschicht ist mehr als 12 Tage alt, Die Zellen sollten passagiert werden

2. Fütterung von hES-Zellen

In einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank, Nehmen Sie den Deckel der Kulturschale ab und saugen Sie das verbrauchte Medium ab. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze keinen anderen Teil der Platte berührt als direkt innerhalb der Vertiefungen. Wenn Bedenken hinsichtlich einer Kontamination bestehen, zu einem neuen wechseln, sterile Pipette.
Mit einer sterilen Glaspipette, Geben Sie in jede Vertiefung die entsprechende Menge erwärmten hES-Zellkulturmediums. Für Kulturen in einer 6-Well-Platte, hinzufügen 2.5 ml Medium pro Vertiefung.
Bringen Sie die Platte wieder in den Inkubator, damit sie bei 37 °C bleibt 5% CO2.

3. Entfernen der Differenzierung aus hES-Zellkulturen

Verwandeln 9 Zoll Glas-Pasteurpipetten werden zu Aufnahmewerkzeugen, indem die Spitzen über der kontrollierten Flamme eines Alkoholbrenners geformt werden. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Pipette versiegelt ist, um eine Kontamination zu verhindern, und abgerundet ist, um ein Verkratzen des Kunststoffs der Kulturschale zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Pflückwerkzeuge vor der Verwendung mit der UV-Lichtquelle in der biologischen Sicherheitswerkbank oder im Pflückgehäuse.
Entfernen Sie die differenzierten Bereiche. Die Differenzierung erfolgt häufig nur in einem Teil einer hES-Zellkolonie, meist entlang der Ränder oder als vereinzelte Flecken in der Mitte. Wenn sich nur ein Teil einer Kolonie differenziert, Es muss lediglich der differenzierte Bereich entfernt werden. Die Differenzierung kann oft in einem von der Platte gelöst werden “klebrig” Blatt, und es ist hilfreich, zunächst die differenzierten Zellen vom Rest der Kolonie zu trennen, indem man mit dem Ende des Pflückwerkzeugs eine Linie durch die Kolonie zieht.
Sobald die Teile der Kolonie getrennt sind, Gleiten Sie mit dem Pflücker vorsichtig über die Platte, um die unerwünschten Zellen abzulösen. Achten Sie darauf, bei diesem Vorgang nicht zu viel von der MEF-Feederschicht zwischen den Kolonien abzukratzen.
Wenn alle differenzierten Zellen von der Platte entfernt sind (und im Medium schwebend), Bringen Sie die Kultur zurück in die biologische Sicherheitswerkbank. Das Medium mit den differenzierten Zellen absaugen und durch frisches hES-Zellkulturmedium ersetzen.

4. Passage von hES-Zellen

Enzyminkubation
In einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank, Nehmen Sie den Deckel der 6-Well-Kulturschale ab und saugen Sie das verbrauchte Medium aus den zu passierenden Wells ab. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze keinen anderen Teil der Platte berührt als direkt innerhalb der Vertiefungen.
Mit einer sterilen Glaspipette, hinzufügen 1 mL erwärmte Kollagenase IV in jede zu passagierende Vertiefung geben.
Legen Sie die Platte erneut in den 37 °C warmen Inkubator zurück 5 Minuten.
Abschaben und Poolen der hES-Zellen

Nach Inkubation der Zellen mit Kollagenase, Beobachten Sie die Kolonien unter dem Mikroskop. Das Enzym sollte eine subtile, aber sichtbare Veränderung an den Kolonierändern verursachen.
In der biologischen Sicherheitswerkbank, Saugen Sie das Enzym vorsichtig aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie es durch 2.0 ml hES-Zellkulturmedium.
Kippen Sie die Kulturplatte leicht in Ihre Richtung und nehmen Sie sie auf 2.0 mL Medium in die erste Vertiefung mit a 5 ml-Glaspipette.

Halten Sie die Pipette senkrecht zur Unterseite der Platte, Gleiten Sie mit der Pipettenspitze vorsichtig über die Vertiefung, während Sie das Medium langsam freigeben.
Wiederholen Sie die Schabe- und Pipettierbewegung 3-4 so lange, bis alle Kolonien aus der Vertiefung entfernt wurden. Vorsichtig pipettieren, um zu vermeiden, dass die Kolonien in zu kleine Stücke zerfallen. Wenn die Zellen aus der ersten Vertiefung entfernt wurden, Lassen Sie den Inhalt in der Vertiefung und beginnen Sie, die Zellen aus der nächsten Vertiefung abzukratzen.

Wenn alle zu passierenden Brunnen ausgekratzt sind, Poolen Sie das Medium, das die Koloniestücke aus jeder Vertiefung enthält, in einem sterilen Behälter 15 Konisches ml-Röhrchen.
Spülen Sie die ausgeschabten Vertiefungen durch Zugabe aus 1 mL hES-Zellkulturmedium in jede Vertiefung geben. Sammeln Sie diese Spülung und übertragen Sie sie in das konische Röhrchen.

Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in das Röhrchen, um die Koloniestücke auf die gewünschte Größe aufzubrechen.
Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten um 200 x g.

Ausplattieren der hES-Zellen

Während sich die hES-Zellen in der Zentrifuge befinden, Bereiten Sie eine neue 6-Well-MEF-Feederplatte vor. Beschriften Sie die Platte mit den entsprechenden hES-Zellinformationen: Zelllinie, neue Passagennummer, und Durchgangsdatum. Das MEF-Medium aus den Vertiefungen absaugen und hinzufügen 1.0 ml PBS in jede Vertiefung geben. Schwenken Sie den Puffer vorsichtig um die Vertiefungen und saugen Sie die PBS-Waschlösung ab. Hinzufügen 1.5 Geben Sie in jede Vertiefung ml hES-Zellkulturmedium und legen Sie die Platte beiseite.

Wenn die hES-Zellen mit dem Zentrifugieren fertig sind, Bringen Sie das Röhrchen zurück zur biologischen Sicherheitswerkbank. Den Überstand absaugen, Achten Sie darauf, das lose gepackte Zellpellet nicht zu stören.
Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet mit ausreichend Medium für 1 mL hES-Zellkulturmedium pro auszuplattierendes Well. Beim Aufteilen in 6 neue Brunnen, Das Pellet darin resuspendieren 6 ml Medium.

Vorsichtig und gleichmäßig hinzufügen 1 ml der Zellsuspension in jede vorbereitete Vertiefung der MEF-Zufuhrplatte geben.
Legen Sie die Platte in den 37 °C warmen Inkubator und schieben Sie die Platte vorsichtig von vorne nach hinten, und hin und her, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen.
Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C anhaften.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Undifferenzierte hES-Zellen sind klein, dicht gepackt, und bestehen meist aus größeren, mehr ausgebreitete Zellen.

Unter dem Mikroskop sind bei geringer Vergrößerung unterschiedliche Morphologien erkennbar. Eine gute Zellmorphologie enthält kleine, dicht gepackte Zellen, die in einer Monoschicht wachsen. Die Zellen sollten sauber sein, definierte Kanten, mit wenig bis gar keiner Differenzierung.

Sterility must be maintained at all times when working with hES cells. Clean and sterilize the biological safety cabinet and all equipment before use.

All reagents must be filtered using a 0.22 μm pore size filter prior to use. The use of antiboiotics in hES cell culture is not necessary and should be avoided.

 

A separate environment should be set up as a designated picking station. The sterile enclosure for the station can be a static enclosure (such as a PCR workstation) with a UV light source, a laminar flow hood, or a biological safety cabinet.

A dissecting microscope inside the picking station is needed to observe the colonies as the differentiated areas are removed. The front glass panel of a static enclosure or a biological safety cabinet must be modified to allow for the oculars of the microscope to extend through the panel without compromising proper airflow and sterility.

To maintain healthy hES cell cultures, cells must be passaged at the optimal time, typically every 4-7 Tage. At this time the colonies have reached their maximum size and may be beginning to merge. Merged colonies can increase the rate of differentiation in the culture. Split ratios generally fall between 1:3 Und 1:5, depending on the number of colonies plated, expansion rate, and culture conditions.

Overplated colonies (split ratio too low) will likely merge prematurely and need to be passaged before they reach their maximum size.

Cultures on an MEF feeder layer that is more than 2 Wochen alte Daten müssen an neue MEFs weitergegeben werden, die undifferenziertes Wachstum und Verbreitung unterstützen.

Da die Differenzierung in hES-Zellkulturen natürlich erfolgt, eine kleine Menge wird erwartet. Wenn die Kulturen nicht angemessen gepflegt werden, kann es zu einer häufigen oder übermäßigen Differenzierung kommen. Die Zellen müssen täglich gefüttert werden, Überwucherungen zwischen Passagen sollten vermieden werden. Verwenden Sie immer frische Reagenzien.

Alle Medien, MEFs und Reagenzien sollten darin verwendet werden 14 Tage, um undifferenziertes hES-Zellwachstum zu vermeiden. Neue Chargen von Reagenzien, wie Knockout Serum Replacement, FBS und MEFs, sollten vor der Verwendung überprüft werden. Denken Sie daran, dass alle differenzierten Zellen, die vor der Passage nicht entfernt wurden, in die neuen Kulturen übertragen werden.

Auch, Versuchen Sie, die Zellen nach Möglichkeit auf 37 °C zu halten. Minimize the time the cells spend outside of the incubator (z.B. on the microscope stage or in the biological safety cabinet.) A heated microscope stage can be very beneficial if the cells will be of the incubator for extended periods of time.

When observing the hES cell cultures under the microscope, first assess the overall quality and size of the colonies view using a low power (2x or 5x) objective. If potentially differentiated cells are observed at low power, confirm the differentiated morphology using a higher magnification objective (10X).