يعمل البربرين على تحسين استقلاب الجلوكوز من خلال تحريض تحلل السكر

 

https://www.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajpendo.00211.2007

 

 

بربارين, قلويد نباتي يستخدم للسيطرة على نسبة السكر في الدم في النوع 2 مرض السكري في الصين, تم الإبلاغ مؤخرًا عن تنشيط AMPK. لكن, ليس من الواضح كيف يتم تنشيط AMPK بواسطة البربارين. في هذه الدراسة, تم التحقيق في نشاط وآلية عمل البربارين في الجسم الحي وفي المختبر. في الفئران السمنة الغذائية, زاد البربارين من حساسية الأنسولين بعد تناوله لمدة 5 أسابيع. انخفض الأنسولين الصائم و HOMA-IR بنسبة 46 و 48%, على التوالى, في الفئران. في خطوط الخلايا بما في ذلك الخلايا الشحمية 3T3-L1, أنابيب L6, C2C12 myotubes, وخلايا الكبد H4IIE, تم العثور على بربارين لزيادة استهلاك الجلوكوز, 2-امتصاص ديوكسيجلوكوز, وبدرجة أقل 3-O-ميثيل الجلوكوز (3-يا إلهي) امتصاص بشكل مستقل عن الأنسولين. تم تعزيز امتصاص الجلوكوز الناجم عن الأنسولين بواسطة البربارين في غياب التغيير في IRS-1 (Ser307/312), أكت, ص70 س6, والفسفرة ERK. تمت زيادة فسفرة AMPK بواسطة البربارين عند 0.5 ح, وبقيت الزيادة لمدة ≥16 ساعة. تم تصميم التنفس الهوائي واللاهوائي لفهم آلية عمل البربارين. ارتبط الفسفرة طويلة الأمد لـ AMPK بالارتفاع المستمر في نسبة AMP/ATP وانخفاض استهلاك الأكسجين. وقد لوحظت زيادة في تحلل السكر مع زيادة في إنتاج حمض اللاكتيك. لم يُظهر البربرين أي سمية للخلايا, وقام بحماية غشاء البلازما في الأنابيب العضلية L6 في مزرعة الخلايا. تشير هذه النتائج إلى أن البربارين يعزز استقلاب الجلوكوز عن طريق تحفيز تحلل السكر, والذي يرتبط بتثبيط أكسدة الجلوكوز في الميتوكوندريا. من المحتمل أن يكون تنشيط AMPK الناجم عن البربارين نتيجة لتثبيط الميتوكوندريا الذي يزيد من نسبة AMP / ATP.

البربارين هو قلويد نباتي موجود في جذور ولحاء العديد من النباتات, بما في ذلك القبطية الصينية الفرنسية, عشبة صينية قديمة تم استخدامها لعلاج مرض السكري منذ آلاف السنين في الصين. البربارين هو المركب النشط الرئيسي للعشب. بالإضافة إلى أنشطته الأيضية, يتمتع البربارين بأنشطة مضادة للميكروبات راسخة في مكافحة العدوى بالبكتيريا, الفيروسات, فطريات, الأوليات, والديدان الطفيلية (8, 14). وهو دواء بدون وصفة طبية لعلاج التهابات الجهاز الهضمي في الصين. في 1988, تم العثور على تأثير انخفاض السكر في الدم من البربارين عندما تم استخدام البربارين لعلاج الإسهال لدى مرضى السكري في الصين (13). منذ ذلك الحين, تم استخدام البربارين كعامل خافض لسكر الدم من قبل العديد من الأطباء في الصين. هناك العديد من التقارير السريرية حول عمل البربارين الخافض لسكر الدم في الأدب الصيني.

فيما يتعلق بآلية عمل البربارين, وجدنا أن البربارين يزيد من استقلاب الجلوكوز في الخلايا المستنبتة, وكان هذا النشاط مشابهًا للنشاط الذي لوحظ بالنسبة للميتفورمين 2002 (20). تم تأكيد هذا النشاط لاحقًا في دراسات أخرى, واقترح AMPK للتوسط في الأنشطة الأيضية للبربرين (2, 3, 9, 22). في 2006, أفيد أن البربارين كان قادرًا على تنشيط AMPK لتثبيط تخليق الدهون في خلايا الكبد البشرية (2). تم الإبلاغ عن أن البربارين يقلل من وزن الجسم ويحسن استقلاب الجلوكوز في النماذج الحيوانية لمتلازمة التمثيل الغذائي (9). تم العثور على البربارين للحث على الفسفرة من AMPK في الخلايا الشحمية 3T3-L1 والأنابيب العضلية L6, واقترح AMPK لشرح تأثير البربارين على توعية الأنسولين (9). ولوحظ أيضًا تنشيط مسار AMPK بواسطة البربارين من قبل مجموعتين أخريين (3, 22). على الرغم من تنشيط AMPK بواسطة البربارين, تتطلب الظروف الأيضية التي تؤدي إلى هذا التأثير مزيدًا من التحقيق. تبين أن البربارين يمنع دورة حمض الستريك في الميتوكوندريا المعزولة (1, 11, 12). لكن, ليس من الواضح ما إذا كان من الممكن ملاحظة هذا النشاط في الخلايا الحية لتنشيط AMPK.

في هذه الدراسة, تم فحص النشاط الأيضي للبربرين في الفئران المصابة بداء السكري, وتم دراسة آلية العمل في النماذج الخلوية. تشير النتيجة إلى أن البربارين يحفز استقلاب الجلوكوز من خلال تحريض تحلل السكر. يرتبط تنشيط AMPK بواسطة البربارين بزيادة نسبة AMP/ATP. قد يساهم تثبيط أكسدة الجلوكوز في الميتوكوندريا في زيادة نسبة AMP/ATP وتفعيل AMPK.

تصميم البحث وطرقه
الكواشف.
دميم, 3-إيزوبوتيل-1-ميثيلكسانثين (آي بي إم إكس), ديكساميثازون, محلول الأنسولين, 2-ديوكسي-د-الجلوكوز, 3-أو-ميثيل-د-جلوكوبيرانوز, وتم شراء السيتوكالاسين B من شركة Sigma Chemicals (شارع. لويس, شهر). مصل بقري جنيني (FBS) تم شراؤها من أتالانتا بيولوجيكس (لورنسفيل, جا). تم شراء كاشف لون الجلوكوز من Raichem (سان دييغو, كاليفورنيا). 2-ديوكسي-د-[3ح]الجلوكوز و3-O-d-[ميثيل-14C]تم شراء الجلوكوز من PerkinElmer (بوسطن, ماجستير). الأجسام المضادة للفوسفو-أكت (Thr308) والفوسفو-p70 S6 كيناز (ثر389) تم شراؤها من تكنولوجيا تشوير الخلية (دانفرز, ماجستير). مكافحة الماعز IgG [بيروكسيداز الفجل (برنامج الصحة البشرية) مترافق], الأجسام المضادة لAkt1/2, GLUT4, والفوسفو-IRS-1 (Tyr632) تم الحصول عليها من سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الصليب المقدس, كاليفورنيا). الأجسام المضادة للفوسفو-IRS-1 (Ser307) تم شراؤه من Upstate (شارلوتسفيل, فرجينيا). تم الحصول على الأجسام المضادة لـ α-tubulin وGLUT1 من Abcam (كامبريدج, ماجستير). تم شراء IgG المضاد للأرنب أو IgG المضاد للفأر من HRP من GE Healthcare UK (باكينجهامشير, المملكة المتحدة). تم شراء غشاء PVDF للبقع المناعية من Bio-Rad (هرقل, كاليفورنيا). تم شراء مجموعة فحص البروتين من بيرس (روكفورد, إيل). كان البربارين المخصص للتجارب على الحيوانات من مصنع Materia Medica في مقاطعة Meitan, مقاطعة قويتشو, الصين. البربارين للتجارب المختبرية كان من شركة سيجما للكيماويات (شارع. لويس, شهر).

تجارب على الحيوانات.
ذكور فئران ويستار (مركز الحيوانات التجريبية الأكاديمية الصينية, شنغهاي, الصين), 2عمر ∼ 3 أشهر ووزن الجسم ∼ 240 جم, تم إيواءهم بشكل فردي في أقفاص سلكية في غرفة يمكن التحكم في درجة حرارتها (22 ± 1 درجة مئوية) على أ 12:12-ح دورة الضوء والظلام. تم تغذية الحيوانات بنظام غذائي غني بالدهون (اتش اف دي; شحم الخنزير, 59% من السعرات الحرارية) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. تمت الموافقة على البروتوكول الحيواني من قبل مجلس المراجعة المؤسسية. بعد 6 مو على HFD, تم تقسيم الحيوانات إلى السيطرة (ن = 6) والمعالجة بالبربارين (ن = 6) المجموعات. تم إعطاء البربارين في 125 ملغم/كغم مرتين يومياً 1000 و 2200 عن طريق تكميم المعدة ل 5 أسبوع. تم تغذية فئران التحكم بكمية متساوية من المركبات (الماء المقطر). بعد العلاج لمدة 5 أسابيع, اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (إيبغت) أجريت بين 0900 و 1100 على الحيوانات الصامتة لمدة 10 ساعات. تم جمع الدم الصائم أولاً عن طريق تمزيق الوريد الذيل قبل إعطاء الجلوكوز 2 جم/كجم من وزن الجسم (40% محلول الجلوكوز). ثم تم جمع عينات الدم في 2 ح. تم اكتشاف الأنسولين الصائم باستخدام مجموعة LINCO Rat Insulin RIA Kit (شارع. تشارلز, شهر). تقييم نموذج التوازن (هوما) تم استخدام الطريقة لتحديد مقاومة الأنسولين (هوما-IR) (10): HOMA-IR = الأنسولين الصائم (ميكرويو/مل) × الجلوكوز الصائم (مليمول / لتر)/22.5.

الخلايا.
الخلايا الليفية الفأرية 3T3-L1, الخلايا العضلية الهيكلية للفئران L6, الخلايا العضلية الفأرية C2C12, وتم شراء خط خلايا سرطان الكبد الفئران H4IIE من مجموعة American Type Culture Collection (ماناساس, فرجينيا) والحفاظ عليها في وسط الثقافة DMEM تستكمل مع 10% FBS, 4 مليمول / لتر الجلوتامين, و 50 ملغم/لتر جنتاميسين في جو من 5% ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. لتكوين الشحوم, 3تمت زراعة الخلايا الشحمية T3-L1 لتلتقي في صفيحة بحجم 100 ملم ثم تمت معالجتها بكوكتيل شحمي (5 ميكروجرام/مل أنسولين, 0.5 مليمول / لتر إيبمكس, و 10 ميكرومول/لتر ديكساميثازون) ل 4 أيام. وأعقب ذلك الحضانة في وسط مكمل للأنسولين للحصول على كمية إضافية 3 أيام. تم استخدام الوسيلة العادية في اليوم 7 للحفاظ على الخلايا الشحمية (6). للتمايز بين myotubes, تم تربيتها الخلايا L6 في DMEM مع 10% فبس ل 24 ح. ثم تم حفظ الخلايا فيها 2% وسيط FBS (α-MEM) ل 6 أيام للحث على التمايز. تم تغيير الوسيط كل 48 ح (15). لخلايا C2C12, تستكمل DMEM مع 2% تم استخدام مصل الحصان للحث على التمايز. كانت عملية التحفيز مشابهة لتلك الخاصة بخلايا L6 (16).

استهلاك الجلوكوز.
وتم تربيتها الخلايا في لوحات زراعة الأنسجة 96-جيدا. عندما أجريت التجارب, تم استبدال وسط الاستزراع الطبيعي بـ DMEM المكمل بـ 0.25% ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة). ثم, عولجت الخلايا بالبربرين و/أو الأنسولين (التركيز النهائي 100 نانومول / لتر) ل 24 ح. تم تحديد تركيز الجلوكوز في الوسط بطريقة أوكسيديز الجلوكوز. تم طرح الجلوكوز في الآبار التي تحتوي على خلايا من الجلوكوز في الآبار الفارغة للحصول على كمية استهلاك الجلوكوز (20).

امتصاص الجلوكوز.
3الخلايا الشحمية T3-L1, L6, أو تم تمييز الخلايا العضلية C2C12 إلى خلايا شحمية ناضجة أو أنابيب عضلية في صفيحة مكونة من 12 بئرًا.. ل2-ديوكسيجلوكوز (أو 3-يا إلهي) استيعاب, بعد علاج البربارين في DMEM الخالي من المصل مع 0.25% جيش صرب البوسنة ل 16 ح, عولجت الخلايا بالأنسولين (200 نانومول / لتر) ل 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد). بعد الغسيل في برنامج تلفزيوني, تم تحضين الخلايا فيها 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 مليمول / لتر 2-ديوكسي-د-جلوكوز (أو 3-O-ميثيل-د-جلوكوز) و 1 μCi/مل 2-ديوكسي-د-[3ح]الجلوكوز (أو 3-O-d-[ميثيل-14C]الجلوكوز) ل 5 دقيقة. ثم, تم غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني بارد بالثلج وإزالتها 0.4 مل من 1% كبريتات دوديسيل الصوديوم. [3ح]الجلوكوز (أو [14ج]الجلوكوز) تم تحديد المحتوى في 4 مل من الوامض باستخدام عداد التلألؤ Beckman LS6500. يتم قياس امتصاص الجلوكوز غير النوعي في وجود 20 ميكرومول/لتر السيتوشالاسين B وطرحه من إجمالي الامتصاص للحصول على امتصاص محدد للجلوكوز (6, 18).

النشاف الغربي.
عولجت الخلايا بالبربرين في وسط خالٍ من المصل 0.25% جيش صرب البوسنة. في بعض التجارب, الأنسولين (200 نانومول / لتر) تمت إضافة 20 دقيقة قبل جمع الخلايا. تم إجراء محللة الخلية بأكملها بواسطة صوتنة في المخزن المؤقت للتحلل (1% تريتون اكس-100, 50 مليمول / لتر بوكل, 25 مليمول / لتر هيبس, الرقم الهيدروجيني 7.8, 10 ميكروجرام/مل من الليوببتين, 20 ميكروجرام/مل أبروتينين, 125 ميكرومول/لتر ديثيوثريتول, 1 مليمول / لتر فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل, 1 مليمول / لتر أورثوفانادات الصوديوم). البروتين (100 ميكروغرام) تم غليه ل 5 دقيقة, حل في 7% مصغرة SDS-PAGE ل 90 بلدي ذلك 100 V, وممسحة على غشاء البولي فينيلدين ديفلورايد (بيو راد). بعد أن يتم نقعها مسبقًا في محلول الحليب 30 دقيقة, تم مسح الغشاء بالجسم المضاد الأول لمدة 2-12 ساعة والجسم المضاد الثانوي لمدة 2-12 ساعة 30 دقيقة. تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP مع كاشف التألق الكيميائي (بيركن إلمر لعلوم الحياة) لتوليد الإشارة الضوئية. للكشف عن إشارات متعددة من غشاء واحد, تمت معالجة الغشاء باستخدام عازلة تجريد (0.5 مول/لتر هيدروكسيد الصوديوم) ل 20 دقيقة بعد كل دورة من النشاف لإزالة الأجسام المضادة المرتبطة. أجريت جميع التجارب ثلاث مرات (5). تم استخدام ImageJ 1.37V لقياس الإشارات الغربية.

فحص السمية الخلوية LDH.
3T3-L1 adipocytes and L6 myotubes were cultured in 24-well plates. After berberine treatment for 24 h in serum-free DMEM supplemented with 0.25% جيش صرب البوسنة, lactate dehydragenase (LDH) concentration in the medium was detected with the LDH-Cytotoxicity Assay Kit II (BioVision, Mountain View, كاليفورنيا).

Oxygen consumption.
Oxygen consumption was performed in BD Oxygen Biosensor Systems (BD Biosciences, Bedford, ماجستير). After differentiation, the 3T3-L1 adipocytes or L6 myotubes were trypsinized and plated to a plate embedded with an oxygen-sensitive dye in DMEM culture medium supplemented with 10% FBS. بعد 6 ح, berberine and/or insulin (التركيز النهائي 100 نانومول / لتر) was added to the medium. Fluorescence reading was taken at different times. The units of oxygen consumption were normalized relative fluorescence units (NRFU), which were obtained by dividing the fluorescence values of cells by the value of the blank wells.

فحص محتويات النوكليوتيدات الأدينين.
3تمت زراعة الخلايا الشحمية T3-L1 والأنابيب العضلية L6 في أطباق ذات ستة بئر. تم علاجهم بها 5 ميكرومول/لتر بربارين 0.5 أو 16 h في وسط خالي من المصل مع 0.25% جيش صرب البوسنة. ثم تم قياس محتويات الخلايا ATP وAMP باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء (HPLC) كما وصفها Wynants وآخرون. (17). باختصار, تم تحلل الخلايا فيها 0.6 N HClO4 وتم تحييده بـ 1 N KHCO3. تم تطوير تحليل HPLC على نظام HPLC (دلتا المياه 600, مياه, ميلفورد, ماجستير) تتكون من وحدة مضخة توصيل المذيبات (مياه 600), أخذ عينات تلقائية (مياه 717 زائد), وكاشف مصفوفة الصمام الثنائي UV-Vis (مياه 2996 كاشف صفيف الثنائي الضوئي, 190-800 نانومتر). تم التحكم في النظام بواسطة الكمبيوتر وتحليله باستخدام نظام برنامج Empower (دلتا المياه 600). تم إجراء الفصل باستخدام عمود Atlantis T3 (5.0 ميكرومتر, 4.6 × 150 معرف مم; مياه) مع عمود الحراسة (4.6 × 20 معرف مم; مياه). يتكون الطور المتحرك من محلول مائي يحتوي على 0.15 م حامض الفوسفوريك (10 مل من 85% H3PO4/لتر) تعديلها إلى الرقم الهيدروجيني 6.00 مع هيدروكسيد الأمونيوم (∼8 مل; أ) وخليط من الأسيتونتريل والميثانول (50:50, المجلد/المجلد; ب). تم تعيين المرحلة المتنقلة الأمثل على النحو التالي: 0-5 دقائق, 100% أ; 5-25 دقيقة, التدرج إلى A/B = 90:10; تم تعيين معدل التدفق كما 0.7 مل / دقيقة, وتم ضبط الطول الموجي عند 259 نانومتر. ظهر ATP وAMP في 9.6 و 18.1 دقيقة, على التوالى.

فحص اللاكتات.
تم استزراع الخلايا في طبق مكون من 24 بئرًا وتم علاجها بالبربرين و/أو الأنسولين في DMEM خالي من المصل ومكمل بـ 0.25% جيش صرب البوسنة. تم الكشف عن تركيز اللاكتات في الوسط باستخدام مجموعة فحص اللاكتات من مركز خدمة البحوث الطبية الحيوية, جامعة بوفالو (الجاموس, نيويورك).

التحليل الإحصائي.
يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SE. تم إجراء جميع التجارب على الخلايا في ثلاث نسخ على الأقل. عندما تم إجراء مقارنة واحدة, تم تحليل أهمية الاختلافات بين الوسائل عن طريق اختبار الطالب. عندما تم إجراء مقارنات متعددة, تم تحليل الأهمية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه (برنامج SPSS 12.0). عندما تم العثور على تأثير كبير, تم تحديد الاختلافات بين الوسائل بواسطة اختبار فيشر الأقل أهمية بعد الاختبار. تم تحديد المستوى P عند 0.05.

نتائج
قام البربارين بتحسين حساسية الأنسولين لدى الفئران التي تعاني من السمنة المفرطة.
في هذه الدراسة, تم استخدام الفئران التي تعاني من السمنة المفرطة كنموذج حيواني لمقاومة الأنسولين. في 6 مو على HFD, كان مستوى الجلوكوز في الدم مرتفعًا بشكل ملحوظ في فئران ويستار في ظروف الصيام والتغذية. مع علاج لمدة 5 أسابيع بواسطة البربارين, كلا من جلوكوز الدم الصائم (FBG) وجلوكوز الدم بعد الأكل (ببجي) تم تخفيضها بشكل ملحوظ في الجرذان التي تعاني من السمنة المفرطة (تين. 1أ). تم تخفيض FBG من 5.74 ل 5.39 مليمول / لتر (ف = 0.035). تم تخفيض PBG من 10.4 ل 7.6 مليمول / لتر (ف = 0.039), وهو قريب من مستوى الجلوكوز الطبيعي. انخفض مستوى الأنسولين الصائم بنسبة 46% (ف = 0.045; تين. 1ب). تمت زيادة حساسية الأنسولين بشكل ملحوظ عن طريق البربارين, كما أشار أ 48% تخفيض (ف = 0.036; تين. 1ج) في هوما-IR….