Son güncelleme: Ağustos 17, 2026
İnsan Embriyonik Kök Hücre Yetiştirme Protokolü
İnsan embriyonik sapı (oES) Sağlıklı kalabilmek için hücrelerin izlenmesi ve bakımının yapılması gerekir., farklılaşmamış kültürler.
En azından, Kaybolan besin maddelerini yenilemek ve kültürleri istenmeyen farklılaşma faktörlerinden uzak tutmak için kültürler her gün tam bir ortam değişimi yapılarak beslenmelidir.. Kök hücre kültürlerinde az miktarda farklılaşma normal ve beklenen bir durum olmasına rağmen, kültür manuel olarak çıkarılarak rutin olarak temizlenmelidir., veya “toplama” farklılaşmış alanlar. İnsan ES hücre kültürlerindeki aşırı farklılaşmanın belirlenmesi ve ortadan kaldırılması, sağlıklı bir hücre popülasyonunun korunmasında temel tekniklerdir..
Protokol
1. Bakım: Kültürlerin Mikroskop Altında İncelenmesi
37°C'lik inkübatörden bir tabak hES hücresini çıkarın ve mikroskoba getirin.
Kolonileri düşük güçte gözlemleyin, 2X veya 5X büyütme kullanma, genel kültür kalitesini değerlendirmek. Aşağıdakilere dikkat edin: normal orta renk, gözle görülür herhangi bir kirlenmenin olmaması, genel koloni büyüklüğü, kalite ve yoğunluk, ve diğer gözlemler.
Orta renk değişikliklerini gözlemleyin.
pH'daki değişiklik ve hES hücreleriyle gece boyunca inkübasyonun ardından ortamdaki besin maddelerinin tükenmesi nedeniyle, ortam kırmızı bir renk tonuna dönüşecek “pipet” renk. Ortam mor görünüyorsa, temel bir pH değişimi meydana geldi. Ortam aşırı derecede sarı görünüyorsa, ortam asitlendi. Çok sarı besiyeri kuyudaki aşırı kalabalık kolonilerin veya kontaminasyonun sonucu olabilir.
Ortam her zaman net görünmelidir. Ortamda belirli bir düzeyde hücre döküntüsü normal olmasına rağmen, asla bulutlu görünmemelidir. Yüksek düzeyde hücre döküntüsü gözlenirse, kültür sağlıklı değil ve kirlenmiş olabilir.
Kültürler bakım veya geçiş gerektirmiyorsa, beslenmek üzere biyolojik güvenlik kabinine alınabilirler
Kültürler yaklaşık olarak daha fazlasını içeriyorsa 10% farklılaşan koloniler, hücreler olmalı “temizlendi” farklılaştırılmış alanları manuel olarak kaldırarak
Kültürler büyük veya yoğun koloniler içeriyorsa, veya MEF besleyici katmanı birden fazla 12 günler eski, hücreler pasajlanmalıdır
2. hES Hücrelerini Beslemek
Steril bir biyolojik güvenlik kabininde, kültür kabının kapağını çıkarın ve harcanan ortamı aspire edin. Pipetin ucunun kuyucukların içi dışında plakanın herhangi bir yerine temas etmesine izin vermeyin.. Herhangi bir kirlenme endişesi varsa, yenisiyle değiştir, steril pipet.
Steril bir cam pipet kullanma, her kuyucuğa uygun miktarda ısıtılmış hES hücre kültürü ortamı ekleyin. 6 oyuklu bir plakadaki kültürler için, eklemek 2.5 Kuyu başına mL ortamı.
Plakayı 37°C'de kalacak şekilde inkübatöre geri koyun ve 5% CO2.
3. hES Hücre Kültürlerinden Farklılaşmanın Kaldırılması
Dönüştür 9 inçlik cam Pasteur, uçları bir alkol yakıcının kontrollü alevi üzerinde kalıplayarak toplama araçlarına pipetler. Pipetin ucunun kontaminasyonu önlemek için kapatıldığından ve kültür kabının plastiğinin çizilmesini önlemek için yuvarlandığından emin olun.. Biyolojik güvenlik kabinindeki veya toplama muhafazasındaki UV ışık kaynağını kullanarak toplama araçlarını kullanmadan önce sterilize edin.
Farklılaştırılmış alanları kaldırın. Farklılaşma genellikle hES hücre kolonisinin yalnızca bir kısmında meydana gelir, genellikle kenarlar boyunca veya merkezde izole noktalar halinde. Bir koloninin yalnızca bir bölümü farklılaşıyorsa, yalnızca farklılaşmış alanın kaldırılması gerekir. Farklılaşma sıklıkla plakayı kaldırabilir “yapışkan” çarşaf, ve toplama aracının ucuyla koloni boyunca bir çizgi çizerek ilk önce farklılaşmış hücreleri koloninin geri kalanından ayırmak yararlı olacaktır..
Koloninin parçaları ayrıldıktan sonra, İstenmeyen hücreleri ayırmak için toplama aletini plaka boyunca yavaşça kaydırın. Bu süreçte koloniler arasındaki MEF besleyici katmanının çok fazlasını kazımamaya dikkat edin..
Farklılaşmış hücrelerin tümü plakadan çıkarıldığında (ve ortada yüzen), kültürü biyolojik güvenlik kabinine iade edin. Farklılaşmış hücreleri içeren ortamı aspire edin ve taze hES hücre kültürü ortamıyla değiştirin.
4. hES Hücrelerinin Geçişi
Enzim İnkübasyonu
Steril bir biyolojik güvenlik kabininde, 6 kuyulu kültür kabının kapağını çıkarın ve harcanan ortamı geçirilecek kuyucuklardan aspire edin. Pipetin ucunun kuyucukların içi dışında plakanın herhangi bir yerine temas etmesine izin vermeyin..
Steril bir cam pipet kullanma, eklemek 1 Geçirilecek her kuyucuğa mL ısıtılmış kollajenaz IV.
Plakayı 37°C'lik inkübatöre geri koyun. 5 dakika.
hES Hücrelerini Kazıma ve Havuzlama
Hücreleri kollajenazla inkübe ettikten sonra, kolonileri mikroskop altında gözlemleyin. Enzim koloni kenarlarında hafif ama gözlemlenebilir bir değişikliğe neden olmalıdır.
Biyolojik güvenlik kabininde, enzimi her kuyucuktan yavaşça aspire edin ve yerine 2.0 mL hES hücre kültürü ortamı.
Kültür plakasını hafifçe kendinize doğru eğin ve 2.0 İlk kuyucukta mL ortamı 5 mL cam pipet.
Pipetin plakanın altına dik tutulması, besiyerini yavaşça serbest bırakırken pipet ucunu kuyu boyunca yavaşça kaydırın.
Kazıma ve pipetleme hareketini tekrarlayın 3-4 tüm koloniler kuyudan çıkarılıncaya kadar. Kolonilerin çok küçük parçalara ayrılmasını önlemek için yavaşça pipetleyin. Hücreler ilk kuyucuktan çıkarıldığında, İçeriği kuyucuğa bırakın ve bir sonraki kuyucuktaki hücreleri kazımaya başlayın.
Geçilecek tüm kuyular kazındığında, her bir kuyucuktan koloni parçalarını içeren ortamı steril bir ortamda havuzlayın 15 mL konik tüp.
Kazıdığınız kuyucukları ekleyerek durulayın. 1 Her kuyucuğa mL hES hücre kültürü ortamı. Bu durulamayı toplayın ve konik tüpe aktarın.
Koloni parçalarını istenen boyuta kadar parçalamak için hücreleri yavaşça tüpe pipetleyin.
Hücreleri santrifüj edin 5 dakika 200 x g.
hES Hücre Hücrelerinin Kaplaması
hES hücreleri santrifüjdeyken, yeni bir 6 kuyulu MEF besleyici plakası hazırlayın. Plakayı uygun hES hücre bilgileriyle etiketleyin: hücre hattı, yeni geçiş numarası, ve geçiş tarihi. MEF ortamını kuyulardan aspire edin ve ekleyin 1.0 Her kuyucuğa mL PBS. Tamponu kuyucukların etrafında yavaşça döndürün ve PBS yıkamasını aspire edin.. Eklemek 1.5 mL hES hücre kültürü ortamını her kuyucuğa koyun ve plakayı bir kenara koyun..
hES hücrelerinin santrifüjlenmesi bittiğinde, tüpü biyolojik güvenlik kabinine geri getirin. Süpernatantı aspire edin, gevşek bir şekilde paketlenmiş hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat etmek.
Peletteki hücreleri yeterli ortamla yeniden süspanse edin. 1 Kaplanacak kuyucuk başına mL hES hücre kültürü ortamı. Bölündüğünde 6 yeni kuyular, pelleti tekrar süspanse edin 6 mL ortamı.
Yavaşça ve eşit şekilde ekleyin 1 MEF besleyici plakasının hazırlanan her kuyucuğuna hücre süspansiyonunun mL'si.
Plakayı 37°C'lik inkübatöre yerleştirin ve plakayı dikkatlice ileri geri kaydırın., ve hücreleri kuyu boyunca eşit şekilde dağıtmak için yan yana.
Hücrelerin gece boyunca 37°C'de bağlanmasına izin verin.
5. Temsilci Sonuçlar:
Farklılaşmamış hES hücreleri küçüktür, sıkıca paketlenmiş, ve genellikle daha büyüklerden oluşur, daha fazla yayılmış hücre.
Mikroskop altında düşük büyütmede farklı morfolojiler görülebilir. İyi bir hücre morfolojisi küçük içerir, tek tabaka halinde büyüyen, sıkı bir şekilde paketlenmiş hücreler. Hücreler temiz olmalı, tanımlanmış kenarlar, çok az veya hiç farklılaşma olmadan.
hES hücreleriyle çalışırken sterilite her zaman korunmalıdır. Kullanmadan önce biyolojik güvenlik kabinini ve tüm ekipmanı temizleyin ve sterilize edin.
Tüm reaktifler bir filtre kullanılarak filtrelenmelidir. 0.22 μm gözenek boyutu filtresi kullanımdan önce. hES hücre kültüründe antibiyotik kullanımı gerekli değildir ve kaçınılmalıdır..
Belirlenmiş bir toplama istasyonu olarak ayrı bir ortam kurulmalıdır. İstasyonun steril muhafazası statik bir muhafaza olabilir (PCR iş istasyonu gibi) UV ışık kaynağı ile, laminer akış başlığı, veya biyolojik güvenlik kabini.
Farklılaşmış alanlar uzaklaştırılırken kolonileri gözlemlemek için toplama istasyonunun içinde bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. Statik bir mahfazanın veya biyolojik güvenlik kabininin ön cam paneli, mikroskobun okülerlerinin uygun hava akışından ve steriliteden ödün vermeden panel boyunca uzanmasına izin verecek şekilde değiştirilmelidir..
Sağlıklı hES hücre kültürlerini korumak için, Hücreler en uygun zamanda geçirilmelidir, genellikle her 4-7 günler. Şu anda koloniler maksimum boyutlarına ulaşmış durumda ve birleşmeye başlıyor olabilirler.. Birleştirilmiş koloniler kültürdeki farklılaşma oranını artırabilir. Bölünme oranları genellikle 1:3 Ve 1:5, kaplanan koloni sayısına bağlı olarak, genişleme oranı, ve kültür koşulları.
Aşırı kaplanmış koloniler (bölünme oranı çok düşük) büyük olasılıkla zamanından önce birleşecek ve maksimum boyutlarına ulaşmadan önce geçilmeleri gerekecek.
MEF besleyici katmanındaki kültürler 2 haftalar öncesinden, farklılaşmamış büyümeyi ve çoğalmayı destekleyecek yeni MEF'lere geçilmelidir.
Farklılaşma doğal olarak hES hücre kültürlerinde meydana geldiğinden, küçük bir miktar bekleniyor. Kültürlere uygun bakım sağlanmazsa sık veya aşırı farklılaşma meydana gelebilir. Hücreler her gün beslenmelidir, pasajlar arasında aşırı büyümeden kaçınılmalıdır. Daima taze reaktifler kullanın.
Tüm medya, MEF'ler ve reaktifler aşağıdakiler dahilinde kullanılmalıdır: 14 farklılaşmamış hES hücre büyümesini önlemek için günler. Yeni çok sayıda reaktif, Nakavt Serumunun Değiştirilmesi gibi, FBS ve MEF'ler, kullanılmadan önce taranmalıdır. Geçişten önce çıkarılmayan farklılaşmış hücrelerin yeni kültürlere aktarılacağını unutmayın..
Ayrıca, mümkün olduğunca hücreleri 37°C'de tutmaya çalışın. Hücrelerin kuluçka makinesinin dışında geçirdiği süreyi en aza indirin (örneğin. mikroskop sahnesinde veya biyolojik güvenlik kabininde.) Hücreler uzun süre inkübatörde kalacaksa ısıtmalı bir mikroskop aşaması çok faydalı olabilir..
hES hücre kültürlerini mikroskop altında incelerken, öncelikle düşük güç kullanarak koloni görünümünün genel kalitesini ve boyutunu değerlendirin (2x veya 5x) amaç. Düşük güçte potansiyel olarak farklılaşmış hücreler gözlenirse, Daha yüksek bir büyütme hedefi kullanarak farklılaşmış morfolojiyi doğrulayın (10X).
Bilimsel Vaka İncelemesi
Mevcut klinik programların olup olmadığını anlamak ister misiniz?, son araştırma gelişmeleri, veya ortaya çıkan yaklaşımlar olabilir kişisel durumunuzla alakalı?
Sorunuzu bilimsel ekibimize gönderin. Birleşik Krallık'taki NBScience merkez ofisi, uluslararası tıp merkezleri ağı genelindeki araştırmaları koordine etmektedir., bilim adamları, ve uzman danışmanlar.
- Sağladığınız bilgilerin gözden geçirilmesi
- İlgili araştırma ve klinik program bilgileri
- Durumunuza odaklanmış net bir yanıt
Hiçbir yükümlülük yok. Sorunuz gizli olarak incelenecektir.
Yalnızca eğitim ve araştırma bilgileri. Bu hizmet tıbbi tavsiye teşkil eder, teşhis, reçete, veya kişiselleştirilmiş tedavi önerisi.
