İnsan Embriyonik Kök Hücreler Yetiştirme Protokolü

 

İnsan embriyonik kök (iEK) Hücreler sağlıklı korumak için izlenir ve bakımını yapmalıdırlar, farklılaşmamış kültürler.

En düşükte, Kültürler tam orta değişikliği kayıp besinleri doldurmak için ve istenmeyen farklılaşma faktörleri serbest kültürleri tutmaya gerçekleştirerek her gün beslenmelidir. farklılaşma az miktarda kök hücre kültürlerinde normal ve beklenen rağmen, kültür rutin elle kaldırarak Temizlenmesi gereken, veya “toplama” farklılaşmış alanlar. hücre sağlıklı popülasyon muhafaza edilmesinde önemli bir teknik vardır belirlenmesi ve embriyonik kök hücre kültürlerinden fazla farklılaşmasını kaldırma.

Protokol

1. Bakım: Mikroskop altında Kültürleri Gözlem

37 ° C inkübatör embriyonik kök hücrelerin bir plaka çıkarın ve mikroskop getirmek.
Düşük güçte koloniler gözlemleyin, 2X veya 5X büyütme kullanılarak, genel kültür kalitesini değerlendirmek için. Aşağıdakilere dikkat et: normal ortam rengi, görünür bir kontaminasyon olmaması, Genel koloni büyüklüğü, kalite ve yoğunluk, ve diğer gözlemler.
orta renk değişiklikleri gözlemleyin.

Nedeniyle, pH değişikliği ve embriyonik kök hücreleri ile bir gece boyunca inkübe edildikten sonra ortam içinde besin tükenmesine, orta bir bir kırmızı tonu değişecektir “Saman” renk. orta mor belirirse, bazik bir pH kayması oluştu. orta derece sarı görünüyorsa, Orta asidifiye etti. Çok sarı orta iyi veya kirlenme son derece kalabalık koloniler sonucu olabilir.

orta her zaman açık görünmelidir. ortam içinde, hücre kalıntılarının belirli bir düzeyde bir durum olmamakla birlikte, hava bulutlu asla görünmemelidir. Hücre enkaz yüksek düzeyde gözlenirse, kültür sağlıklı değildir ve kirlenmiş olabilir.
Kültürler bakım veya pasajlanmasını gerek duymuyorsanız, biyolojik güvenlik kabini alınabilir beslenecek

Kültürler yaklaşık fazla içeriyorsa 10% farklılaştırarak koloniler, Hücreler olmalıdır “temizledik” El ile farklılaşmış alanları kaldırarak

Kültürler büyük veya yoğun koloniler içeriyorsa, veya MEF besleyici tabaka daha fazladır 12 eski günler, Hücreler geçirildi edilmelidir

2. iEK Hücreleri Besleme

Steril bir biyolojik güvenlik kabininde, kültür çanak kapağı çıkarın ve harcanan orta aspire. doğrudan kuyulara içeride dışındaki plakanın herhangi bir bölümünü dokunmak pipet ucu izin vermeyin. kirlenme herhangi bir endişe varsa, Yeni geçmek, steril bir pipet.
steril bir cam pipet kullanılarak, Her bir oyuğa ısıtıldı embriyonik kök hücre kültür ortamında uygun miktarda. 6 gözlü bir plakada kültürler için, eklemek 2.5 oyuk başına mL ortam.
37 ° C 'de kalmaya inkübatöre plaka dönün ve 5% CO2.

3. iEK Hücre Kültürleri gelen Farklılaşma Çıkarma

dönüştürmek 9 bir alkol brülör kontrollü alev üzerinde ipuçlarını kalıplanması ile toplama araçlarına inç cam Pasteur pipetler. pipet ucu kirlenmesini önlemek için mühürlü ve kültür çanak plastik çizilmesini önlemek için yuvarlanır emin olun. biyolojik güvenlik kabini UV ışık kaynağı kullanılarak ya da odayı toplama kullanımdan önce toplama araçları sterilize.
farklılaşmış alanlar kaldır. Farklılaşma, genellikle bir embriyonik kök hücre koloni sadece bir bölümü ortaya çıkar, genellikle kenarları boyunca ya da merkez izole noktalar olarak. Sadece bir koloninin bir bölümü ayırt edilirse, Sadece farklı bölge kaldırılması gerekir. Farklılaşma genellikle de plakayı kaldırarak yapabilirsiniz “yapışkan” tabaka, ve ilk çekme aletinin ucu ile koloni boyunca bir çizgi çizerek koloni geri kalanından farklılaşmış hücreleri ayırmak için yararlıdır.
koloninin parçalar ayrıldığında, hafifçe istenmeyen hücreleri ayırmak için levha boyunca çekme aracı kayma. Bu süreçte uzak koloniler arasında MEF besleyici tabakanın çok fazla kazımak vermemeye özen.
farklılaşmış hücrelerin tüm plaka çıkarıldığında (ve ortamda yüzen), biyolojik güvenlik kabini için kültür dönmek. farklılaşmış hücreleri ihtiva eden ortam aspire ve taze embriyonik kök hücre kültürü ortamı ile değiştirin.

4. iEK Hücreleri Pasajlanması

Enzim Kuluçka
Steril bir biyolojik güvenlik kabininde, 6 oyuklu kültür çanağı kapağını çıkarın ve çukurlar pasajlanabılir için kullanılmış ortamı aspire. doğrudan kuyulara içeride dışındaki plakanın herhangi bir bölümünü dokunmak pipet ucu izin vermeyin.
steril bir cam pipet kullanılarak, eklemek 1 her çukuruna ısıtıldı kolajenaz IV ml geçişli edilmesi.
için 37 ° C inkübatör Levha yeniden 5 dakika.
iEK Hücreleri Kazıma ve Havuzlanması

kollajenaz ile inkübe edilmesinin ardından, Mikroskop altında, kolonilerin. Enzim koloni kenarları ince ama gözlemlenebilir değişiklik neden.
biyolojik güvenlik kabini, yavaşça her bir enzimi aspire ile yerine 2.0 ml embriyonik kök hücre kültürü ortamı.
kendinize doğru hafifçe kültür plakasını İpucu ve kaplar 2.0 bir birinci oyuk mL orta 5 mL cam pipet.

plakanın alt kısmına dik pipet tutarak, yavaş yavaş ortam serbest hafifçe oyuk boyunca pipet ucu kayma.
kazıma ve pipetleme hareketi tekrarlayın 3-4 Kolonilerin her dek kez kuyudan çıkarıldı. Pipet hafifçe adet çok küçük içine koloniler bölmekten kaçınmaya. Hücreler ilk olarak oyuk kaldırılmış zaman, kuyuda içeriğini bırakın ve bir sonraki kuyunun kapalı hücreler kazıma başlar.

kuyuların hepsi kazınmıstır pasajlanabılir ne zaman, steril olarak her bir koloni parçaları içeren ortam havuz 15 ml konik tüp.
ilave edilerek kazındı kuyu durulayın 1 her çukuruna embriyonik kök hücre kültürü ortamı mL. Bu durulama toplayın ve konik tüp transfer.

hafifçe tüpün içinde pipetleyin hücreler, arzu edilen büyüklüğe kadar koloni parçalarını kırmak için.
için hücreleri Santrifüj 5 dakikalarda 200 x g'de.

iEK Hücre Hücreler Kaplama

iEK hücreleri santrifüjde iken, Yeni 6-çukurlu MEF besleyici plaka hazırlamak. Uygun embriyonik kök hücre bilgilerle plaka etiketleyin: hücre çizgisi, Yeni geçit sayısı, ve geçit tarih. kuyulardan MEF ortamı aspire ekleyin 1.0 Her bir oyuğa ml PBS. Yavaşça, bölmelerinde çevresindeki tampon girdap ve PBS ile yıkama aspire. Eklemek 1.5 ml embriyonik kök hücre kültürü, her oyuk, orta ve bir kenara plaka ayarlamak.

iEK hücreleri santrifüjleme bittiğinde, biyolojik güvenlik kabini geri tüp getirmek. süpernatan aspire, dikkatli olmak gevşek dolu hücre pelet rahatsız etmemek için.
için yeterli ortam ile pelet hücrelerin yeniden süspanse 1 oyuk başına ml embriyonik kök hücre kültürü ortamı kaplanacak. ayrılacağız zaman 6 yeni kuyular, pelet tekrar süspansiyon 6 mL ortam.

Yavaşça ve eşit eklemek 1 MEF besleyici plakasının her hazırlanmış oyuğuna ml hücre süspansiyonu.
37 ° C inkübatör içine plaka koyun ve dikkatli bir şekilde geri ileri plaka slayt, ve yan eşit oyuk boyunca hücrelerin dağılmasını sağlamak için.
Hücreler gece boyunca 37 ° C'de takmak için izin ver.

5. temsilcisi Sonuçlar:

Farklılaşmamış iEK hücreleri küçük, sıkıca paketlenmiş, ve genellikle daha büyük oluşmaktadır, daha yayılmış hücreler.

Farklı morhopologies mikroskop altında düşük büyütme altında görülebilir. İyi bir hücre morfolojisi küçük içeriyor, Bir tek tabaka büyümek sıkıca paketlenmiş hücreler. Hücreler temiz olmalıdır, tanımlanan kenarları, ile herhangi bir farklılaşma az.

iEK hücreler çalışırken Kısırlık her zaman korunmalıdır. Temiz ve biyolojik güvenlik kabini sterilize ve tüm ekipman kullanmadan önce.

Tüm reaktifler, kullanılarak filtre edilmelidir 0.22 kullanımı um gözenek boyutlu filtre önce. embriyonik kök hücre kültüründe antiboiotics kullanılması gerekli değildir ve kaçınılmalıdır.

 

Ayrı bir ortam belirlenen toplama istasyonu olarak kurulması gerektiğini. istasyon için steril muhafaza statik muhafaza olabilir (Bu tür bir PCR iş istasyonu olarak) UV ışık kaynağı ile, Laminer akış kapağı, veya biyolojik güvenlik kabini.

farklı alanlar kaldırılır olarak çekme istasyonu içinde bir diseksiyon mikroskobu kolonilerin için gereklidir. Statik kasası veya bir biyolojik güvenlik kabininin ön cam panel doğru hava akışı ve kısırlık ödün vermeden panel boyunca uzanan için mikroskop oküler izin vermek için değiştirilmesi gerekir.

Sağlıklı embriyonik kök hücre kültürleri korumak için, Hücreler optimum zamanda pasajlanabılir gerekir, Normal olarak her 4-7 günler. Şu anda koloniler maksimum boyutuna ulaştı ve birleştirme başlıyor olabilir. Birleştirilmiş koloni, kültürde farklılaşma oranını artırabilir. Bölünmüş oranları genellikle arasında kalan 1:3 ve 1:5, kaplama koloni sayısına bağlı olarak, genişleme oranı, ve kültür koşulları.

Overplated koloniler (bölünme oranı çok düşük) onların maksimum boyutu ulaşmadan olasılıkla erken birleştirme ve edecektir pasajlanabılir gerekir.

daha fazla bir MEF besleyici tabaka üzerinde Kültürleri 2 Eski hafta farklılaşmamış büyüme ve çoğalmasını destekleyecek yeni MEFS üzerine pasajlanabılir gerekir.

farklılaşma, doğal olarak embriyonik kök hücre kültürlerinde ortaya yana, az miktarda bekleniyor. Kültürler, uygun bakım almazsanız sık veya aşırı farklılaşma meydana gelebilir. Hücreler her gün beslenmelidir, geçitler arasındaki büyümesi kaçınılmalıdır. Her zaman taze reaktif kullanınız.

medyanın tamamı, MEF'ler ve reaktifler içinde kullanılmalıdır 14 gün farklılaşmamış embriyonik kök hücre büyümesini önlemek için. reaktiflerin Yeni sürü, Böyle Nakavt serum Değiştirilmesi olarak, FBS ve MEF, kullanmak için taranmalıdır önce. herhangi farklılaşmış hücreler geçişe öncesinde yeni kültürler aktarılacaktır kaldırılmaz unutmayın.

Ayrıca, Mümkün 37 ° C'de hücreleri tutmaya çalışır. Hücreler kuluçka dışında harcadığınız zamanı en aza indirin (ör. mikroskop sahnede veya biyolojik güvenlik kabini.) Hücreler, uzun zaman süreleri için kuluçka olması durumunda ısıtılmış bir mikroskop aşamasında çok faydalı olabilir,.

Mikroskop altında embriyonik kök hücre kültürleri incelenirken, ilk önce bir düşük güç kullanarak görünümünde kolonilerin genel kalite ve boyutunu değerlendirmek (2x ve 5x) amaç. Potansiyel olarak farklılaşmış hücreler düşük güçte gözlenirse, Daha yüksek büyütmeli objektif kullanarak farklılaşmış morfolojiyi onaylamak (10X).

 


NBScience

Kontrat Araştırma Organizasyonu

Kök hücre tedavisi