Son güncelleme: Ağustos 17, 2026
Makrofajdan Türetilmiş Hücre Dışı Süksinat, Nöral Kök Hücrelerin Kronik Nöroinflamasyonu Bastırmasına İzin Veriyor
Öne Çıkanlar
• Somatik dokulardan gelen NSC'ler veya doğrudan yeniden programlama, nöroinflamasyonu eşit derecede baskılar
• Hücre dışı süksinat, NSC'lerde SUCNR1/GPR91'i aktive eder
• Aktive edilmiş NSC'ler PGE2 salgılar ve süksinatı temizler, böylece türü yeniden programlama 1 milletvekilleri
•Sucnr1 mutant NSC'ler, transplantasyondan sonra anti-inflamatuar aktiviteyi azalttı
Özet
Sinir kök hücresi (MGK) Transplantasyon bağışıklık tepkilerini etkileyebilir ve CNS'deki inflamasyonu baskılayabilir. Metabolitler, süksinat gibi, bağışıklık hücrelerinin fenotipini ve fonksiyonunu modüle eder, ancak NSC'lerin immünoreaktiviteyi ve inflamatuar yanıtları kontrol etmek için bu tür immünometabolitler tarafından da etkinleştirilip etkinleştirilmediği ve nasıl etkinleştirildiği belirsizdir.. Burada, nakledilen somatik ve doğrudan indüklenen NSC'lerin, beyin omurilik sıvısındaki süksinat seviyelerini azaltarak kronik CNS inflamasyonunu iyileştirdiğini gösterdik, böylece mononükleer fagosit azalır (Milletvekili) sızma ve ikincil CNS hasarı. Enflamatuar milletvekilleri süksinat salgılar, süksinat reseptörünü aktive eden 1 (SUCNR1)/NSC'lerde GPR91, prostaglandin E2 salgılamalarına ve hücre dışı süksinatı temizlemelerine ve bunun sonucunda anti-inflamatuar etkilere yol açmasına yol açar. Böylece, Çalışmamız somatik ve doğrudan indüklenen NSC'lerde süksinat-SUCNR1 ekseninin beklenmedik bir rolünü ortaya koyuyor, Kök hücrelerin türe göre salınan inflamatuar metabolik sinyallere tepkisini kontrol eden 1 Kronik iltihaplı beyindeki milletvekilleri.
giriiş
Kök hücre biyolojisindeki ilerlemeler, CNS hastalıklarının hematopoietik olmayan kök hücre ilaçları ile iyileştirilebileceğine dair umutları artırdı (Martino ve Pluchino, 2006). Somatik nöral kök hücrelerin naklinin mümkün olduğuna dair ikna edici kanıtlar sağladık. (MGK'lar) inflamatuar CNS bozukluklarının hayvan modellerinin klinik-patolojik özelliklerini iyileştirir. Yaralı CNS hücrelerinin yapısal olarak değiştirilmesinin ötesinde, Çalışmamız, nakledilen NSC'lerin karmaşık kök hücre aşısından konakçıya iletişim programlarına dahil olduğunu gösterdi, genel olarak uyarlanabilir ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin trofik desteğine ve modülasyonuna yol açar (Bacigaluppi ve ark., 2009, Bacigaluppi ve ark., 2016, Pluchino ve Cossetti, 2013, Pluchino ve ark., 2005, Pluchino ve ark., 2009B). özellikle, NSC nakilleri yaralanma bölgesindeki iltihaplanma yükünü azaltır (Pluchino ve ark., 2005, Pluchino ve ark., 2009A), tür sayısını azalt 1 inflamatuar mononükleer fagositler (milletvekilleri) (Cusimano ve ark., 2012), ve henüz yeterince tanımlanmamış mekanizmalar yoluyla yaralı CNS'nin iyileşmesini teşvik eder.
Fakat, Deneysel NSC tedavilerinin klinik çevirisi hala insan NSC'lerinin alındığı kaynaklarla sınırlıdır. (hNSC'ler) türetilmiştir (Anderson ve ark., 2017), allojenik hNSC hatlarının içsel immünojenitesi (Ramos-Zúñiga ve diğerleri., 2012, Rice ve ark., 2013), ve sözde "amaçlanan klinik hücre partisinin" stabilitesi (Anderson ve ark., 2017, Wright ve diğerleri., 2006). Otolog ve istikrarlı bir şekilde genişletilebilir doğrudan indüklenen NSC'ler (iNSC'ler) Hastaların dermal fibroblastları, NSC tedavilerine geçerli bir alternatif olarak ortaya çıkıyor (Lu ve ark., 2013, Meyer ve ark., 2015, Thier ve ark., 2012). İNSC'lere doğrudan yeniden programlama, pluripotent bir durum boyunca zahmetli ilerlemeyi ve ardından indüklenmiş pluripotent kök hücre için açıklanan istenen soylara farklılaşmayı önler (iPSC) teknoloji (Meyer ve ark., 2015, Thier ve ark., 2012). Öyleyse, Somatik hücrelerden stabil bir şekilde genişletilebilir iNSC'ler yapmak, aşağı yönlü klinik uygulamalar için otolog beyin kök hücreleri elde etmenin en uygun yolunu temsil eder (Wörsdörfer ve ark., 2013). Fakat, doğrudan yeniden programlanan iNSC'lerin inflamatuar CNS bozukluklarının tedavisinde etkinliği henüz test edilmemiştir.
Multipl sklerozun ilerleyici formlarında (MS), Kronik CNS inflamasyonu, hem CNS'de yerleşik mikroglia hem de monosit türevi infiltre makrofajları içeren MP'lerin yaygın aktivasyonu ile sürdürülür (Mallucci ve ark., 2015). MP'ler gri madde lezyonlarında bulunur, dejenere nöritlere ve nöronal hücre gövdelerine yakın (Peterson ve ark., 2001), ve beyaz cevher lezyonlarında, aktifleştirilmiş mikroglia'nın dış kenarının kronik doku hasarı ile ilişkili olduğu yer (Bramow ve diğerleri., 2010, Prineas ve ark., 2001). Normal görünen beyaz cevher alanları da MP birikimi ile karakterize edilir, bu da eşlik eden T hücresi aktivasyonundan bağımsız olarak hastalık patolojisini yönlendiren mikroglial nodüllerin oluşumuna yol açar (Moll ve ark., 2011). İlerleyen MS'de kronik MP kaynaklı inflamasyonun zararlı rolü, hayvan hastalığı modellerindeki kanıtlarla da desteklenmektedir., genel yükünün bozulmuş nöron fonksiyonuyla ilişkili olduğu yer (Planche ve ark., 2017), beyin atrofisi (Ağaç ve ark., 2015), ve rejeneratif tepkilerin azalması (Jiang ve diğerleri., 2014).
MP'lerin proinflamatuar uyaranlarla aktivasyonu, glikolize doğru metabolik bir geçişe ve oksidatif fosforilasyonun azalmasına neden olur (OKSFOS) (Kelly ve O'Neill, 2015). Son kanıtlar şunu gösteriyor, bu metabolik yeniden bağlantı içinde, tip 1 inflamatuar MP'ler süksinat biriktirir, önemli patofizyolojik sonuçları olan (Tannahill ve ark., 2013). Hücre içi süksinat, prolil hidroksilaz enzimlerinin aktivitesini inhibe eder (Doktoralar), böylece hipoksiye duyarlı elemanı stabilize eder (HIF)-1α ve interlökin transkripsiyonunu indüklemek (IL)-1B (Tannahill ve ark., 2013). Üstelik, süksinatın süksinat dehidrojenaz tarafından oksidasyonu (SDH) Mitokondriyi ATP sentezinden reaktif oksijen türlerine dönüştürür (ROS) ek proinflamatuar sinyal olarak üretim (Mills ve ark., 2016). Tip 1 inflamatuar MP'ler ayrıca hücre dışı olarak süksinat salgılar ve aynı kökenli süksinat reseptörünü yukarı doğru düzenler 1 (SUCNR1), G proteinine bağlı bir reseptör (GPR91 olarak da bilinir), IL-1β üretimini arttırmak için otokrin ve parakrin sensörü olarak işlev gören (Littlewood-Evans ve ark., 2016).
Gibi, metabolizma her iki makrofajın aktivasyonunu modüle etmek için önemli bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. (Kelly ve O'Neill, 2015) ve mikroglia (Orihuela ve ark., 2016), ve süksinatla ilişkili yollar, akut ve kronik inflamatuar hastalıklar için önemli immün modülatör fonksiyonlara sahiptir (Ryu ve ark., 2003, Tannahill ve ark., 2015).
NSC'lerin yerleşik bağışıklık modülatör özellikleri göz önüne alındığında (Pluchino ve Cossetti, 2013), NSC'lerin MP metabolizmasını sekonder CNS hasarının azaltılmasına doğru modüle ederek kronik nöroinflamasyonda terapötik etkilerini gösterebileceklerini varsaydık..
Bu çalışmada, somatik ve doğrudan indüklenen NSC'lerin tipteki metabolik değişikliklere karşı koyma kapasitesini destekleyen moleküler mekanizmaları araştırdık. 1 hem in vivo hem de in vitro inflamatuar MP'ler. Nakledilen iNSC'lerin ve NSC'lerin, deneysel otoimmün ensefalomiyelitli farelerde kronik nöroinflamasyonun iyileştirilmesinde işlevsel olarak eşdeğer olduğunu gösterdik. (EAE). Nakledilen iNSC'ler/NSC'ler, CNS'de yerleşik mikroglia ve monosit türevi infiltre edici makrofajların aktivasyon profilinde anti-inflamatuar bir fenotipe doğru geçiş yapar, beyin omurilik sıvısındaki immünometabolit süksinat seviyelerini azaltmanın yanı sıra (BOS). iNSC'ler/NSC'ler ayrıca türe göre salınan hücre dışı süksinatı da azaltır 1 inflamatuar MP'ler metabolizmalarını in vitro OXPHOS'a doğru yeniden programlayacak. Mekanik olarak, süksinatın türe göre salgılandığını gösteriyoruz 1 Milletvekilleri, iNSC'lerde/NSC'lerde SUCNR1 yönünde bir sinyalleşme kademesini ortaya çıkarır, anti-inflamatuar aktivitelerini mümkün kılan. iNSC'lerin/NSC'lerin bu süksinat lisanslı anti-inflamatuar fonksiyonuna prostaglandin salgılanması aracılık eder (PG) E2, ve ayrıca hücre dışı süksinatın önemli ölçüde temizlenmesiyle. NSC'lerde Sucnr1 fonksiyonunun kaybı, EAE'de transplantasyondan sonra in vitro ve in vivo anti-inflamatuar aktivitelerin önemli ölçüde azalmasına yol açar.
Çalışmamız, NSC'lerin tip aktivasyonunu engellemek için inflamatuar metabolik sinyallere nasıl tepki verdiğini açıklayan bir süksinat-SUCNR1 eksenini ortaya çıkarır. 1 Kronik nöroinflamasyondaki milletvekilleri.
Sonuçlar
NSC Transplantasyonu Kronik Nöroinflamasyonu İyileştirir ve Beyin Omurilik Sıvısındaki İmmünometabolit Süksinatın Azaltılmasıyla Birleşir
İlk olarak intraserebroventriküler etkinin etkilerini değerlendirdik. (icv) hastalığın zirvesinde transplantasyon (PD) MOG35-55 ile indüklenen kronik EAE'li farelerde iNSC'lerin veya NSC'lerin analizi ve bunu PBS ile tedavi edilen kontrol EAE fareleriyle karşılaştırdı. Transplantasyon öncesinde, iNSC'ler ve NSC'ler genişletildi, karakterize edilmiş (Şekil S1), ve farnesillenmiş ile etiketlenmiş (F)İn vitro GFP. Şu tarihte: 30 nakil sonrası günler (dpt), iNSC ve NSC nakilleri hayatta kaldı, dağıtılmış, ve EAE beyni ve omuriliğine entegre edilmiştir (Şekil S2). Alınan fGFP+ hücrelerinin yalnızca azınlığı (iNSC'ler: 2.1% ± 0.9%; MGK'lar: 1.7% ± 0.1%) çoğalıyordu (Şekil 1A) veya nöronal ifade etme (Şekil 1B), astroglial (Şekil 1C), veya oligodendroglial (Şekil 1D) soy belirteçleri (Şekil S2). Çoğunluk (∼75%) Transplantasyona kadar hayatta kalan iNSC'lerin, test edilen sinirsel soy işaretleyicilerinden herhangi birini ifade etmediği ve F4/80+ endojen MP'lere yakın meningeal perivasküler niş benzeri alanlar etrafında lokalize olduğu bulundu. (Şekil 1E), somatik NSC greftlerinde gözlemlendiği gibi (Cusimano ve ark., 2012, Pluchino ve ark., 2003). İNSC'lerin nakli önemli ve uzun süreli bir etki yarattı (kadar 90 dpt) EAE puanlarının iyileştirilmesi, hangisinden başladı 15 ile 20 dpt'den ileriye (Şekil 1F ve S2). Fonksiyonel iyileşme bilgisayar destekli otomatik yürüyüş analiziyle de doğrulandı. (Şekil S2). Etraflı, icv ile nakledilen iNSC'ler güvenliydi ve davranışsal ve patolojik iyileşmeye yol açtı.
Daha sonra iNSC'de ex vivo akış sitometrisi yoluyla CNS inflamatuar sızıntılarının bileşimini analiz ettik.- ve NSC ile nakledilen ve PBS ile tedavi edilen kontrol EAE farelerine karşı. iNSC'lerin veya NSC'lerin transplantasyonunun, CNS'ye sızan T hücrelerinin fraksiyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı, B hücreleri, ve toplam milletvekili, CD3+/CD4+ T hücresi alt gruplarında olduğu gibi (Th1 dahil, Pazartesi, Treg, ThGM-CSF, ve Th17 altkümeleri) en 30 dpt (Şekil S3). Yerine, iNSC- veya NSC ile nakledilen EAE fareleri, CD80+ tipinde ~1,5 kat azalmayla CX3CR1+ hücrelerinin aktivasyon profilinde önemli bir değişiklik gösterdi 1 inflamatuar mikroglia ve MRC1+ anti-inflamatuar mikroglianın paralel artışı (Şekil 1G). Aynı şekilde, CNS'ye sızan (monosit türevi) iNSC'den CCR2+ makrofajları- veya NSC ile nakledilen EAE farelerine, CD80+ tipinde ~1,3 kat azalma ile önemli fenotip değişimi uygulandı 1 inflamatuar makrofajlar ve MRC1+ anti-inflamatuar makrofajlarda paralel olarak ∼1,8 kat artış (Şekil 1H). Bu etkiye, türün ifadesinde önemli bir azalma eşlik etti. 1 inflamatuar MP işaretleyici ile indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) F4/80+ milletvekilleri tarafından in vivo (Şekil 1I ve S3).
Daha sonra ana profesyonelin ifade seviyelerini analiz ettik.- ve tüm CNS'deki anti-inflamatuar genler. iNSC- ve NSC ile nakledilen EAE farelerinin her ikisi de önemli ölçüde azalmış interlökin-1 beta seviyeleri sergiledi (II1b) beyinde ve omurilikte mannoz reseptörü C tipinde artış 1 (Mrc1) omurilikte, her ikisi de 10 dpt (Şekil 1J).
Kan-beyin bariyerinde anlamlı bir fark bulamadık (BBB) geçirgenlik 30 iNSC-/NSC nakledilmiş ile PBS ile tedavi edilen kontrol EAE fareleri karşılaştırıldığında dpt (Şekil S3).
Nihayet, iNSC- ve NSC ile nakledilen EAE fareleri birikerek aksonal kaybı önemli ölçüde azalttı (Şekil 1K) ve demiyelinizasyon (Şekil 1L) omurilikte.
MP'lerin fenotipi ve fonksiyonunun düzenlenmesinde metabolizmanın belirlenmiş önemi göz önüne alındığında, NSC nakillerinin nöroinflamatuar metabolik mikroçevreyi etkileyip etkilemediğini araştırdık. Bu amaçla, kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile polar metabolitlerin hedeflenmemiş bir metabolik profilini çıkardık (LC-MS) eşleşen BOS ve plazma örneklerinin sayısı (Tablo S1). PBS ile tedavi edilen kontrol EAE fareleri, birkaç CSF'de önemli bir artış gösterdi (ama plazma değil) metabolitler, bunların arasında süksinatın yalnızca zirveye ulaştığı 45 aşılamadan sonraki günler (dpi) (karşılık gelen 30 dpt; Şekil 1M). Ameliyata tabi tutulmayan EAE fareleri aynı zamanda sadece CSF'de önemli bir süksinat artışı gösterdi. 45 dpi (sağlıklı kontrol farelerine karşı), bu, CSF PBS ile tedavi edilen kontrol EAE farelerindeki süksinat seviyelerinden farklı değildi (Şekil S3).
iNSC/NSC nakledilen ve PBS ile tedavi edilen kontrol EAE fareleri arasında plazma metabolit seviyelerinde herhangi bir anlamlı değişiklik tespit etmedik (Tablo S1), iNSC'lerin veya NSC'lerin transplantasyonunun, CSF süksinatında önemli bir düşüşe yol açtığını bulduk. 30 dpt (Şekil 1M; Tablo S1).
Daha öte, PBS ile tedavi edilen EAE fareleri ile icv enjekte edilmiş EAE farelerini fare fibroblastlarıyla karşılaştırırken CSF süksinatında anlamlı bir fark bulamadık (MF'ler) kontrol hücreleri olarak (Şekil S3).
Böylece, EAE CNS'ye doğrudan enjekte edilen iNSC'ler ve NSC'ler, MP'lerde spesifik bir fenotip değişimine neden olur, which is associated with reduction of the immunometabolite succinate in the CSF only and amelioration of chronic neuroinflammation.
NSCs Reduce Succinate Levels and Reprogram the Metabolism of Type 1 Inflammatory Mφ In Vitro
We then investigated the molecular mechanisms through which iNSCs/NSCs display anti-inflammatory activities on type 1 milletvekilleri, using an in vitro system that recapitulates the interactions between MPs and iNSCs/NSCs. Naive bone-marrow-derived macrophages (Mφ) were polarized into a type 1 inflammatory phenotype with LPS (MφLPS), as described (Tannahill ve ark., 2013). MφLPS were then co-cultured with iNSCs (MφLPS-iNSCs) or NSCs (MφLPS-NSCs) in a trans-well system that avoids cell-to-cell contacts (Figure 2A). Unpolarized Mφ were used as controls.
Microarray gene expression profiling showed significant transcriptional changes in MφLPS with 7,401 etkilenen genler (Mφ'ye karşı; düzeltilmiş p değeri < 0.1; Şekil 2B; Tablo S2) Ve 51 MφLPS-iNSC'lerde veya MφLPS-NSC'lerde farklı şekilde ifade edilen genler (MφLPS'ye karşı; düzeltilmiş p değeri < 0.1; Şekil 2B ve 2C; Tablo S2). Bu son gen grubu, lökosit aktivasyonunun pozitif regülasyonu ile ilgili biyolojik süreçler açısından zenginleştirilmiştir. (GİTMEK: 0002696), miyeloid lökosit farklılaşması (GİTMEK: 0002761), ve bağışıklık sistemi süreçleri (GİTMEK: 0002376). Seçilen Mφ proinflamatuar genlerin bağımsız qRT-PCR doğrulaması, Il12b'nin ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde aşağı regülasyonunu doğruladı, Il15, Il15ra, ve Cd69, klasik inflamatuar genlerin yanı sıra Nos2, tümör nekroz faktörü (Tnf), ve MφLPS-iNSC'lerde ve MφLPS-NSC'lerde Il1b (MφLPS'ye karşı; Şekil 2B). Bu etki, bir anti-inflamatuar Mφ fenotipi ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerinin eş zamanlı olarak yukarı regülasyonu ile birleştirildi., uronil-2-sülfotransferaz gibi (Ust) ve kemik iliği stromal hücre antijeni 1 (Bst1) (Al-Shabany ve ark., 2016, Martinez ve ark., 2015), aynı zamanda arginaz 1 (Arg1) ve Mrc1 (MφLPS'ye karşı; Şekil 2E). İNSC'ler/NSC'ler lipopolisakkarit ile birlikte kültürlendiğinde (LPS)-fare BV2 mikroglial hücrelerini daha önce olduğu gibi aktive etti, proinflamatuar genler Nos2 ve Il1b'nin ekspresyon seviyelerinde de önemli azalma gözlendi (Şekil 2F).
Gen ekspresyon profillerini fonksiyonel metabolik durumlarla ilişkilendirmek, bazal oksijen tüketim oranını değerlendirdik (OCR) ve hücre dışı asitlenme oranı (ECAR) trikarboksilik asitlerinin okumaları olarak MφLPS'nin (TCA) Döngü ve glikolitik aktiviteler, sırasıyla. MφLPS'de OCR'de önemli bir azalma ve ECAR'da önemli bir artış bulduk (Mφ'lere karşı). Yerine, MφLPS-iNSC'ler ve MφLPS-NSC'ler, hem OCR hem de ECAR değerlerinde önemli bir restorasyondan geçti (MφLPS'ye karşı; Şekil 2G ve 2H), Mφ'nin antiinflamatuar bir fenotipe geçişinde gözlemlendiği gibi (O'Neill ve Pearce, 2016).
Bu antiinflamatuar etkilerin metabolik belirleyicilerini açıklığa kavuşturmak amacıyla, MφLPS'nin hücre dışı ve hücre içi küçük moleküllü metabolit içeriğinin hedeflenmemiş bir LC-MS analizini gerçekleştirdik. Beklendiği gibi, LPS uyarımı, Mφ'nin hücre dışı ve hücre içi metabolik ortamını derinden değiştirdi (MφLPS) (Mφ'ye karşı; Tablo S3). Ortak kültürlerde, MφLPS-iNSC'ler ve MφLPS-NSC'lerin her ikisi de hücre dışı glutamatta önemli bir azalma gösterdi, GABA, ve süksinat (MφLPS'ye karşı; Şekil 2I; Tablo S3). Üstelik, MφLPS-iNSC'ler ve MφLPS-NSC'ler ayrıca hücre içi süksinat ve itakonatta önemli bir azalma gösterdi (MφLPS'ye karşı; Şekil 2J; Tablo S3).
Süksinat seviyelerinin azalmasıyla tutarlı, MφLPS-iNSC'lerin ve MφLPS-NSC'lerin önemli ölçüde azalmış HIF-1α seviyeleri sergilediğini bulduk, yukarı akış proteini piruvat kinaz izozim M2'nin (PKM2) (Palsson-McDermott ve ark., 2015; Şekil 2K), IL-1β'nın yanı sıra (MφLPS'ye karşı; Şekil 2L).
Hep birlikte, bu in vitro veriler, iNSC'lerin/NSC'lerin, tip ile ortak kültürlerde hem hücre içi hem de hücre dışı süksinat birikimini azalttığına dair kanıt sağlar. 1 kışkırtıcı milletvekilleri, onları OXPHOS antiinflamatuar fenotipe doğru yeniden programlamak.
Fare ve İnsan NSC'lerinde SUCNR1/GPR91 Yoluyla Süksinat Sinyalleri
İmmünmetabolik sinyal olarak süksinatın önemi göz önüne alındığında, türe göre süksinatın salınıp salınmadığını araştırdık 1 proinflamatuar MP'ler çevredeki hücrelerin aktivitesini yerinde düzenleyebilir, nakledilen iNSC'ler/NSC'ler dahil.
Nakledilen iNSC'lerin/NSC'lerin meningeal perivasküler alanların yakınında tespit edildiğini bulduk (Şekil 3A ve 3B ) ve F4/80+ MP'ler (Şekil 3C) CNS'de in vivo olarak SUCNR1'i eksprese etti. SUCNR1 ayrıca in vitro olarak hem iNSC'lerde hem de NSC'lerde protein seviyesinde eksprese edildi, ama MF'lerde değil (Şekil 3D).
İNSC'lerde/NSC'lerde SUCNR1'in süksinat tarafından fonksiyonel olarak aktive edilip edilmediğini daha fazla değerlendirmek için, aşağı yöndeki sinyalleşme kademesini in vitro olarak araştırdık. Süksinata maruz kaldığında (Şekil 3E; Rubik ve ark., 2008), 34.2% (±%7,4) iNSC'lerin ve 31.7% (±%6,5) NSC'lerin �'ı hücre içi kalsiyum depolarının salındığını gösterdi (Şekiller S4 ve 3F). Bu yanıtı, fosfo-p38 mitojenle aktifleştirilen protein kinazın önemli ölçüde yukarı regülasyonu izledi. (Şekil 3G), aktivasyonunun göstergesi. SUCNR1 ve SUCNR1'in ekspresyonunu insan fetal NSC'lerinde de doğruladık (hNSC'ler) ve insan iNSC'leri (hiNSC'ler) (Şekil 3H ve 3I). Fare iNSC'lerinde olduğu gibi, süksinat bağımlı p38 sinyali hiNSC'lerde uyarıldı, ancak seçici SUCNR1 inhibitörü 4c ile önceden tedavi edilmiş hiNSC'lerde değil (Şekil 3J).
Böylece, mouse and human iNSCs and NSCs express functional SUCNR1, which induces a signaling pathway downstream of its stimulation with the immunometabolite succinate.
SUCNR1 Stimulation Initiates the Secretion of Prostaglandin E2 by NSCs
To clarify the functional consequences of SUCNR1 signaling in NSCs, we generated NSCs from mice lacking Sucnr1 (Sucnr1−/− NSCs) (Rubik ve ark., 2008; Figure S4). Compared to control NSCs, Sucnr1−/− NSCs showed similar growth curves and differentiation in vitro (Figure S4). Fakat, when exposed to succinate at different time points and concentrations, Sucnr1−/− NSCs showed no upregulation of phospho-p38 (Figure S4). Stimulation with glutamate or ATP + thapsigargin induced in Sucnr1−/− NSCs a calcium response similar to that of control NSCs (Figure S4). Aksine, süksinat tedavisi hücre içi depolardan kalsiyum salınmasını sağlamadı (Figure S4), bu, Sucnr1−/− NSC'lerde kusurlu bir SUCNR1 sinyalini gösterdi.
Daha sonra kontrol NSC'lerinde ve Sucnr1 -/− NSC'lerde süksinatla tedavinin ardından bir gen ekspresyonu profili çıkaran mikro dizi gerçekleştirdik (Tablo S4). Prostaglandin-endoperoksit sentazın 2 (Ptgs2), indüklenebilir PTGS2'yi kodlayan PG biyosentezindeki anahtar enzim, süksinatla uyarılan kontrol NSC'lerinde en fazla düzenlenen gendi (log2 kat değişimi 1.05), ancak süksinatla uyarılan Sucnr1−/− NSC'lerde değil (log2 kat değişimi −0,43; Şekil 4A). Bu sonuçları Ptgs2'de qRT-PCR ile doğruladık, ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde yukarı doğru düzenlendiğini doğruluyor (2.1- 2,7 kat değişim) süksinatla uyarılmış iNSC'lerde ve NSC'lerde, whereas they were not in succinate-treated Sucnr1−/− NSCs (Figure 4B).
Given the role of PGE2 as regulator of the immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells (MSC'ler) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), we tested its accumulation in tissue culture media from iNSCs, MGK'lar, and Sucnr1−/− NSCs after stimulation with succinate. iNSCs and NSCs, but not Sucnr1−/− NSCs, showed significant (>2.5-fold) increase of their basal release of PGE2 as early as 30 min after succinate. This succinate-induced effect was abolished by pre-treatment with the irreversible PTGS2 blocker SC-58125 (Figure 4C). Fare iNSC'lerinde olduğu gibi, exposure of hiNSCs to succinate elicited a significant increase of PGE2 concentrations in tissue culture media, whereas again pre-treatment with either SC-58125 or 4c prevented its release (Figure 4D).
Bu bulguların NSC'ler ve MφLPS arasındaki ortak kültürlerle ilişkisini daha da genişletmek, doku kültürü ortamındaki PGE2 seviyelerini analiz ettik. MφLPS-NSC'lerin, MφLPS'ye kıyasla daha yüksek seviyelerde PGE2 biriktirdiğini bulduk., birlikte kültürlenmiş NSC'lerin SC-58125 ile ön tedavisi PGE2 seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 4E). NSC'lerin SC-58125 ön tedavisi aynı zamanda MφLPS'de Il1b ekspresyonunda önemli bir artışla birleştirildi (Şekil 4F) ve proinflamatuar bir fenotipin göstergesi olan OCR değerlerinde azalma ile birlikte (Şekil 4G). Fakat, SC-58125 ile önceden tedavi edilen NSC'lerin, Sucnr1−/− NSC'lere kıyasla MφLPS üzerinde bazı anti-inflamatuar etkileri koruduğunu fark ettik. (Şekil 4F). Aksine, NSC'lerde Sucnr1 fonksiyon kaybı, MφLPS üzerindeki anti-inflamatuar etkilerini tamamen ortadan kaldırdı (Şekil 4F ve 4G). We also show that the observed PGE2-dependent anti-inflammatory ability of NSCs is conserved and relevant for human NSCs.
Gibi, hiNSCs induced a significant reduction of Il1b expression in MφLPS in co-cultures (Figure 4H), which was coupled with a restoration of OCR values (Figure 4I) and increased PGE2 levels in tissue culture media (Figure 4J). These effects were completely suppressed by pre-treatment of hiNSCs with the selective SUCNR1 inhibitor 4c (Figures 4H–4J).
Böylece, the activation of SUCNR1 signaling pathway in mouse and human NSCs triggers the release of PGE2 leading to anti-inflammatory effects on type 1 milletvekilleri.
Fakat, inhibition experiments targeting either PTGS2 or SUCNR1 anticipate that additional SUCNR1-dependent—PGE2-independent—mechanisms are likely to play a key role in the anti-inflammatory effects of NSCs.
SUCNR1 Stimulation Triggers the Uptake of Succinate by NSCs
Gene expression arrays of succinate-stimulated NSCs revealed that, besides Ptgs2, NaCT/Slc13a5 was among the most upregulated genes in wild-type (WT) MGK'lar (log2 fold change = 0.49), but not in Sucnr1−/− NSCs (log2 fold change = −0.12). SLC13A5 is a dicarboxylate co-transporter known to be involved in succinate transport (Srisawang et al., 2007). Given the consistent depletion of succinate found both in vivo in the CSF of iNSC- or NSC-transplanted EAE mice and in vitro in co-cultures with MφLPS, we hypothesized that iNSCs/NSCs would activate SLC13A5 to scavenge succinate.
We found that the expression of SLC13A5, as well as of the high-affinity dicarboxylate co-transporter SLC13A3, were significantly increased in iNSCs and NSCs, but not in Sucnr1−/− NSCs, upon succinate stimulation (Figure 5A). Benzer şekilde, hiNSCs exposed to succinate upregulated the protein expression levels of both these SLC13 co-transporters in vitro (Figure 5B).
We next investigated the role of these co-transporters by measuring succinate uptake in iNSCs and NSCs. We found that both iNSCs and NSCs significantly accumulated [14C]-succinate (Figure 5C) while reducing the amount of extracellular [14C]-succinate in tissue culture media (Figure 5D). Sucnr1−/− NSCs neither accumulated [14C]-succinate intracellularly nor did they deplete it extracellularly (Figures 5C and 5D). ilginç bir şekilde, Sucnr1−/− NSCs, which we have shown to have no effects on Il1b expression in MφLPS (Şekil 4F), failed to reduce the extracellular succinate levels in co-cultures with MφLPS (Figure 5E). As further proof of the importance of succinate depletion in modulating the phenotype of type 1 pro-inflammatory MPs, we show that treatment with active recombinant (R)SDH complex subunit A is able to significantly reduce the expression of Il1b in MφLPS (Figure S5).
Böylece, SUCNR1 signaling in NSCs prompts the uptake of the immunometabolite succinate, thereby depleting the available extracellular pool sustaining the autocrine and paracrine activation of type 1 milletvekilleri.
Transplantation of Sucnr1 Loss-of-Function NSCs Shows Impaired Ability to Ameliorate Chronic Neuroinflammation In Vivo
To confirm the role of the succinate-SUCNR1 axis in mediating the response of NSC grafts to succinate in vivo, we assessed the effects of the icv transplantation of Sucnr1−/− NSCs in mice with chronic EAE.
Şu tarihte: 30 dpt, Sucnr1−/− NSCs survived, dağıtılmış, ve kontrol NSC'lerle karşılaştırıldığında önemli bir fark olmaksızın EAE beyni ve omuriliğine entegre edilmiştir (Şekil S6). Fakat, Sucnr1 -/− NSC'lerin nakli, PBS ile tedavi edilen kontrol EAE farelerine kıyasla EAE davranışsal eksikliklerinde yalnızca hafif bir iyileşmeye neden oldu (EAE puanı—Sucnr1−/− NSC'ler: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), önemli ölçüde daha az belirgin olan (50% etkinin) kontrol NSC'leri nakledilen EAE farelerinde gözlemlenenden daha fazla (EAE puanı — NSC'ler: 2.1 ± 0.3; Şekil 6A).
CNS inflamatuar sızıntılarının bileşiminin ex vivo akış sitometrisine dayalı analizi, EAE farelerinin Sucnr1 -/− NSC'lerle transplantasyonunun tip oranlarını değiştirmede başarısız olduğunu gösterdi 1 inflammatory and anti-inflammatory MPs—including CX3CR1+ microglia and CCR2+ monocyte-derived infiltrating macrophages—in contrast with the effects of control NSCs (Figures 6B and 6C). Post mortem tissue pathology further confirmed the reduced tissue-protective effects of Sucnr1−/− NSC grafts (Figures 6D and 6E).
We then investigated the levels of PGE2 and succinate in matched CSF and plasma samples from NSC-transplanted and PBS-treated control EAE mice. We found that both Sucnr1−/− NSCs and control NSCs failed to induce significant changes of the levels of PGE2 in the CSF. Plasma PGE2 significantly increased in EAE mice only (versus healthy controls), with no treatment effect observed (Figure 6F). Önemli olan, whereas transplantation of control NSCs reduced CSF succinate (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; MGK'lar: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1−/− NSC grafts showed no effects (Sucnr1−/− NSCs: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Figure 6G).
These data confirm the requirement of a functional SUCNR1 signaling pathway in the regulation of the anti-inflammatory and neuroprotective effects of NSC transplants in vivo and underline the importance of succinate scavenging as a predominant anti-inflammatory mechanism of action of NSCs.
Tartışma
There is an unmet clinical need to develop cellular and molecular approaches to target core drivers of the pathophysiology of chronic neuroinflammatory conditions that include progressive forms of MS (Volpe et al., 2016). In principle, stem cells possess a therapeutic potential that is distinct from that of small molecules and biologics and extend far beyond the classical regenerative medicine arena. Part drug and part device, Kök hücreler biyolojik hastalık değiştirici ajanlar olarak çalışabilir (DMA'lar) farklı sinyalleri algılayan, vücudun belirli bölgelerine göç, Karar vermek için girdileri entegre edin, ve belirli bir doku mikro ortamı bağlamında karmaşık yanıt davranışlarını yürütme (Fischbach ve ark., 2013). Tüm bu özellikler çeşitli hastalık süreçlerini tedavi etmek için kullanılabilir., ilerleyici MS'te meydana gelen kalıcı MP kaynaklı inflamasyon ve doku dejenerasyonu dahil.
Burada, erişilebilir olanı kullandık, otolog, ve istikrarlı bir şekilde genişletilebilir iNSC'ler (Thier ve ark., 2012), somatik NSC'lerin yanı sıra, Kronik nöroenflamasyonun fare modelinde beyin kök hücre naklinin etkilerini araştırmak, İlerleyen MS'de gözlenen inflamatuar kaskadı taklit eden.
iNSC'lerin EAE farelerinin BOS dolaşımına transplantasyonunun, daha önce somatik NSC'ler nakledilen farelerde gözlemlenenlere eşdeğer sonuçları desteklediğini bulduk. (Pluchino ve ark., 2003). Nakledilen iNSC'ler veya NSC'ler önemli klinik iyileşmeye neden oldu, aksonal ve miyelin hasarının azalmasının yanı sıra, BBB geçirgenliğinde önemli bir azalma olmadan 30 dpt. Daha ileri çalışmalar, iNSC'lerin/NSC'lerin transplantasyonunun hemen ardından BBB geçirgenliğindeki değişikliklerin veya CNS'ye inflamatuar monositlerin alımının gerçekleşip gerçekleşmediğini açıklığa kavuşturmaya yardımcı olacaktır.. Böyle bir etkinin, inflamatuar hücrelerin CNS infiltrasyonunun yüksek prevalansına sahip hastalıkların ana klinik sonuçlarını değiştirme ihtimalinin olup olmadığı, EAE/MS gibi, tahmin etmek zor.
Yerine, we found that our paradigm of transplantation was associated with a specific switch in the activation profile of both CX3CR1+ microglial cells and CCR2+ monocyte-derived infiltrating macrophages with a decrease of the CD80+ type 1 inflammatory MPs and parallel increase of the MRC1+ anti-inflammatory MPs. Transplanted iNSCs/NSCs distributed and survived in the CNS of EAE mice, while preferentially accumulating at the level of meningeal perivascular areas in juxtaposition to endogenous MPs. Hep birlikte, these findings would imply the presence of some yet unknown mechanisms of intercellular coupling between grafted stem cells and inflammatory MPs. Whether this iNSC/NSC-MP communication in vivo takes place only in perivascular niches or also at the level of other emerging immune sensor-like structures of the brain that include the choroid plexus remains to be addressed (Ge et al., 2017).
We then investigated the underlying immunological mechanisms driving the beneficial effects of NSCs on MPs during chronic neuroinflammation. Untargeted small molecule analysis of matched CSF and plasma samples revealed profound metabolic changes in the CSF of EAE mice, with differences between the early and the delayed phases of disease.
Karnitin, leucine + isoleucine, citrulline, allantoin, ornithine, and uric acid were all significantly increased in the PBS-treated control EAE mice at the peak of disease. Our findings are consistent with published evidence showing that leucine, as well as uric acid and its by-product allantoin, are all increased in the CSF of subjects with MS (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Whereas increased CSF carnitine has not been reported in MS, important increases have been described in non-MS inflammatory conditions of the CNS, such as encephalitis (Wikoff et al., 2008) and meningitis (Shinawi et al., 1998).
tersine, only succinate showed a delayed (yani., 45 dpi) increase in the CSF of PBS-treated control EAE mice. Succinate is becoming a valuable in vivo biomarker of metabolic distress and inflammatory activity (Littlewood-Evans ve ark., 2016, Mills and O’Neill, 2014). Önemli olan, we found that succinate was significantly decreased in the CSF of iNSC-/NSC-transplanted mice. iNSC veya NSC transplantasyonunu takiben BOS süksinatının azaltılması ilgi çekiciydi ve kronik nöroinflamasyona müdahalede belirgin bir role sahip olabilir.
Tipten salınan süksinat 1 inflamatuar MP'ler, spesifik G-proteinine bağlı reseptör SUCNR1 ile etkileşime giren önemli bir inflamatuar sinyaldir.. SUCNR1, çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda metabolik stresin erken dedektörü olarak görev yapar, renin kaynaklı hipertansiyon dahil, iskemi/reperfüzyon hasarı, iltihap, trombosit toplanması, ve retinal anjiyogenez (de Castro Fonseca ve diğerleri., 2016, Gilissen ve ark., 2016). Özellikle, nakledilen NSC'lerin in vivo terapötik etkileri için SUCNR1 ifadesinin gerekli olduğunu bulduk.
Kemirgen ve insan iNSC'leri ve NSC'leri üzerinde SUCNR1'in süksinat aracılı aktivasyonu, kalsiyum sinyalini ve mitojenle aktifleşen protein kinazı aktive eder (MAPK) in vitro fosforilasyon, böylece NSC'lerde uyumlu bir anti-inflamatuar fenotipin edinilmesini ortaya çıkarır. Bir taraftan, SUCNR1, PGE2 salgılanmasını aktive etti, köklü bir pleiotropik bağışıklık modülatörü, işlevi iltihaplı mikro ortamdaki birden fazla hücre tipini hedef alan, milletvekilleri dahil (Kota ve ark., 2017, Vasandan et al., 2016). Diğer taraftan, iNSC'lerde ve NSC'lerde süksinat-SUCNR1 sinyali, SLC13 ortak taşıyıcı ailesinin iki üyesinin yukarı regülasyonuna yol açtı (yani., SLC13A3 ve SLC13A5) ve hücre dışı süksinatın alımı.
in vivo, EAE farelerine CSF dolaşımı yoluyla enjekte edilen NSC'ler tarafından hücre dışı lokal süksinatın etkili bir şekilde temizlendiğini gösterdik, hangisi baskın, PGE2 salgılanmasıyla karşılaştırıldığında. Nakledilen NSC'lerde SUCNR1'e bağlı sinyallemenin kaybı, bunların anti-inflamatuar ve nöroprotektif etkilerinde önemli bir azalmaya yol açtı, Sucnr1−/− NSC greftleri hayatta kalma açısından hiçbir fark göstermedi, dağıtım, ve kontrol NSC'lerine karşı farklılaşma.
Daha sonra hücre dışı süksinatın türe göre salgılandığını varsayıyoruz. 1 inflamatuar MP'ler, nakledilen NSC'lerin artan substrat mevcudiyetine yanıt olarak ayarladığı bir temizleme davranışı başlatır (Srisawang et al., 2007). Bu yeni hücreler arası metabolik eşleşme, mevcut literatürle iyi uyum göstermektedir., belirli mikro ortamlarda, Hücreler mevcut besinler için rekabet eder, birbirlerinin işlevini ve kaderini etkilemek (Pearce ve Pearce, 2013).
SUCNR1'i eksprese eden iNSC'ler ve NSC'ler tarafından süksinat tükenmesinin, nakledilen kök hücreler ile konakçı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin tamamlayıcı hale geldiği inflamatuar bağlamlarda önemli bir metabolik sinyalin kullanılabilirliğini azaltmada önemli bir rol oynayabileceğini tahmin ediyoruz. (Pluchino ve Cossetti, 2013). Daha genel olarak, bulgularımız provokatif bulgularla uyumlu, henüz ortaya çıkıyor, NSC'lerin, çeşitli tamamlayıcı immün modülatör ve doku trofik etkileri uygulayabilen beynin atalarının koruyucuları olduğu kavramı (Martino ve Pluchino, 2007).
Süksinat-SUCNR1 ekseninin nöro-immün etkileşimlerdeki fonksiyonunu daha da karakterize etmek için ek çalışmalara ihtiyaç vardır., nöral kök/progenitör hücreler için hücresel metabolizmanın kritik rolü hakkında ek bilgiler sağlamak (Knobloch ve Jessberger, 2017), ve kronik olarak iltihaplı beyinde bu yolu hedef alan tamamlayıcı farmakolojik müdahaleler geliştirin.
Sonuç olarak, burada NSC'lerin, süksinat-SUCNR1'e bağlı mekanizmalar yoluyla nöroinflamasyonu iyileştirmek için kronik iltihaplı CNS'de biriken hücre dışı süksinatı algıladığını gösteriyoruz. Çalışmamız somatik ve doğrudan indüklenen NSC'lerin rejeneratif potansiyelini destekleyen yeni bir anti-inflamatuar mekanizmayı tanımlamaktadır., böylece kronik inflamatuar ve dejeneratif nörolojik hastalıklar için kişiselleştirilmiş kök hücre ilaçlarında yeni bir çağın yolunu açıyor.
Bilimsel Vaka İncelemesi
Mevcut klinik programların olup olmadığını anlamak ister misiniz?, son araştırma gelişmeleri, veya ortaya çıkan yaklaşımlar olabilir kişisel durumunuzla alakalı?
Sorunuzu bilimsel ekibimize gönderin. Birleşik Krallık'taki NBScience merkez ofisi, uluslararası tıp merkezleri ağı genelindeki araştırmaları koordine etmektedir., bilim adamları, ve uzman danışmanlar.
- Sağladığınız bilgilerin gözden geçirilmesi
- İlgili araştırma ve klinik program bilgileri
- Durumunuza odaklanmış net bir yanıt
Hiçbir yükümlülük yok. Sorunuz gizli olarak incelenecektir.
Yalnızca eğitim ve araştırma bilgileri. Bu hizmet tıbbi tavsiye teşkil eder, teşhis, reçete, veya kişiselleştirilmiş tedavi önerisi.
