الجنينية الخلايا الجذعية بروتوكول زراعة البشري

 

الجذعية الجنينية البشرية ([هس]) يجب مراقبة الخلايا ورعايتهم من أجل الحفاظ على صحة جيدة, الثقافات غير متمايزة.

على الأقل, يجب أن يكون الطعام ثقافات كل يوم عن طريق إجراء تغيير المتوسطة كاملة لتجديد المغذيات المفقودة والحفاظ على الثقافات خالية من عوامل التمايز غير المرغوب فيها. على الرغم من أن كمية صغيرة من التمايز هو طبيعي ومتوقع في مزارع الخلايا الجذعية, يجب تنظيف الثقافة بشكل روتيني من قبل إزالة يدويا, أو “اختيار” مناطق متباينة. تحديد وإزالة التمايز الزائدة من مزارع الخلايا حس والتقنيات الأساسية في الحفاظ على صحة السكان من الخلايا.

بروتوكول

1. اعمال صيانة: مراقبة الثقافات تحت المجهر

إزالة لوحة واحدة من خلايا حس من 37 درجة مئوية الحاضنة وتقديمهم إلى المجهر.
مراقبة المستعمرات في الطاقة المنخفضة, باستخدام 2X أو 5X التكبير, لتقييم نوعية الثقافة العامة. لاحظ ما يلي: واللون المتوسط ​​العادي, عدم وجود أي تلوث مرئية, حجم مستعمرة العام, الجودة والكثافة, وأي ملاحظات أخرى.
مراقبة التغيرات اللون متوسطة.

ويرجع ذلك إلى تغير في درجة الحموضة واستنزاف المواد الغذائية في المتوسط ​​بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الخلايا [هس], سوف المتوسطة تتغير من هوى الأحمر ل “قش” اللون. إذا ظهر المتوسطة الأرجواني, وقد حدث تحول الرقم الهيدروجيني الأساسي. إذا ظهر متوسطة الأصفر للغاية, ويحمض المتوسطة. جدا المتوسطة الأصفر قد يكون نتيجة للمستعمرات مكتظة للغاية في البئر أو التلوث.

يجب أن تظهر على المديين المتوسط ​​واضحا في جميع الأوقات. على الرغم من مستوى معين من حطام خلية في المتوسط ​​أمر طبيعي, لا ينبغي أبدا تظهر غائم. إذا لوحظ على مستوى عال من حطام خلية, الثقافة ليست صحية وقد تكون ملوثة.
إذا كان الثقافات لا تحتاج إلى الصيانة أو الركض, أنها يمكن اتخاذها لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية أن يكون الطعام

إذا كان الثقافات تحتوي على أكثر من حوالي 10% المستعمرات التفريق, يجب أن تكون الخلايا “نظيف” عن طريق إزالة المناطق المتباينة يدويا

إذا كان الثقافات تحتوي على مستعمرات كبيرة أو كثيفة, أو طبقة المغذية MEF هي أكثر من 12 الأيام الخوالي, وينبغي passaged الخلايا

2. تغذية الخلايا هس]

في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة, إزالة غطاء الطبق الثقافة ونضح المتوسط ​​أمضى. لا تسمح غيض من ماصة للمس أي جزء من لوحة غير مباشرة داخل الآبار. إذا كان هناك أي قلق من التلوث, تغيير جديد, ماصة معقمة.
باستخدام الماصة زجاجية معقمة, إضافة كمية مناسبة من حرارة [هس] خلية ثقافة المتوسط ​​إلى كل بئر. للثقافات في لوحة 6 جيدا, إضافة 2.5 متوسطة مل لكل بئر.
العودة إلى لوحة الحاضنة لتبقى عند 37 درجة مئوية و 5% CO2.

3. إزالة التمايز من الثقافات خلية [هس]

تحول 9 بوصة الماصات الزجاج باستور إلى أدوات قطف بواسطة صب النصائح على الشعلة رقابة من الموقد الكحول. مما لا شك فيه أن غيض من ماصة ومختومة لمنع التلوث وتقريبه لتجنب خدش البلاستيك من الطبق الثقافة. تعقيم الأدوات قبل استخدامها اختيار باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو اختيار الضميمة.
إزالة مناطق متباينة. غالبا ما يحدث التمايز في جزء فقط من مستعمرة خلية [هس], عادة على طول الحواف أو على شكل بقع معزولة في وسط. إذا كان هناك قسم من مستعمرة فقط هو التفريق, فقط في منطقة متباينة تحتاج إلى إزالتها. يمكن التفريق في كثير من الأحيان رفع قبالة لوحة في “لزج” ورقة, وأنه من المفيد لأول فصل الخلايا المتمايزة عن بقية المستعمرة عن طريق رسم خط من خلال المستعمرة مع نهاية أداة قطف.
مرة واحدة يتم فصل قطعة من مستعمرة, تنزلق برفق أداة قطف جنبا إلى جنب لوحة لفصل الخلايا غير المرغوب فيها. والحرص على عدم كشط عن الكثير من الطبقة المغذية MEF بين المستعمرات في هذه العملية.
عندما تتم إزالة كافة الخلايا متباينة من لوحة (وعائمة في المتوسط), العودة الثقافة لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح في المتوسط ​​تحتوي على خلايا متباينة، واستبدال جديدة [هس] خلية ثقافة المتوسط.

4. الركض الخلايا [هس]

انزيم الحضانة
في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة, إزالة غطاء الطبق ثقافة 6 جيدا ونضح المتوسط ​​أمضى من الآبار لتكون passaged. لا تسمح غيض من ماصة للمس أي جزء من لوحة غير مباشرة داخل الآبار.
باستخدام الماصة زجاجية معقمة, إضافة 1 مل من درجة حرارة كولاجيناز الرابع من كل بئر إلى أن passaged.
العودة إلى لوحة 37 ° C حاضنة لل 5 الدقائق.
كشط وتجمع خلايا [هس]

بعد احتضان الخلايا مع كولاجيناز, مراقبة مستعمرات تحت المجهر. الانزيم يجب أن تحدث تغييرا خفية ولكن يمكن ملاحظتها في حواف مستعمرة.
في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية, نضح بلطف الانزيم من كل بئر واستبدالها مع 2.0 مل [هس] خلية ثقافة المتوسط.
تلميح لوحة الثقافة قليلا نحوك وتولي 2.0 متوسطة مل في البئر الأول مع 5 مل الماصة الزجاج.

عقد الماصة عمودي على الجزء السفلي من لوحة, تنزلق برفق طرف الماصة عبر بشكل جيد في حين الإفراج عن ببطء المتوسطة.
كرر تجريف وpipetting لحركة 3-4 تم إزالة مرات حتى كل من المستعمرات من البئر. الماصة بلطف لتجنب تقسيم المستعمرات إلى قطع صغيرة جدا من. عندما تم إزالة الخلايا من أول بئر, ترك محتويات البئر وتبدأ كشط الخلايا الخروج من البئر المقبل.

عندما تم كشط كل من الآبار لتكون passaged, تجميع المتوسط ​​تحتوي على قطع مستعمرة من كل بئر في عقيمة 15 أنبوب مل المخروطية.
شطف الآبار كشط بإضافة 1 مل من حس خلية ثقافة المتوسط ​​إلى كل بئر. جمع هذا شطف ونقل إلى أنبوب مخروطي.

الماصة الخلايا برفق في أنبوب لتفريق القطع مستعمرة تصل إلى الحجم المطلوب.
الطرد المركزي الخلايا ل 5 دقيقة في 200 ز س.

تصفيح خلايا خلية [هس]

في حين أن الخلايا هس هي في أجهزة الطرد المركزي, إعداد 6 جيدا جديدة لوحة المغذية MEF. تسمية لوحة بالمعلومات خلية [هس المناسبة: خط الخلية, عدد مرور جديدة, وتاريخ مرور. نضح في المتوسط ​​MEF من الآبار وإضافة 1.0 مل PBS إلى كل بئر. دوامة بلطف عازلة حول الآبار ونضح غسل برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل حس مستنبت الخلية إلى كل جيدا وتوضع لوحة جانبا.

عندما يتم الانتهاء من خلايا حس الطرد المركزي, جعل أنبوب إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح طاف, والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية معبأة فضفاضة.
إعادة تعليق الخلايا في بيليه مع متوسط ​​يكفي ل 1 مل حس مستنبت خلايا لكل بئر إلى أن مطلي. عند تقسيم إلى 6 آبار جديدة, إعادة تعليق بيليه في 6 مل المتوسطة.

بلطف وإضافة بالتساوي 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر على استعداد لوحة المغذية MEF.
وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية، وحرك بعناية لوحة الأمام إلى الخلف, وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر.
السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية خلال الليل.

5. ممثل النتائج:

خلايا غير متمايزة حس صغيرة, معبأة بإحكام, وتتكون عادة من أكبر, المزيد تنتشر الخلايا.

ويمكن رؤية morhopologies مختلفة في ظل تضخم منخفض تحت المجهر. A good cell morphology contains small, الخلايا معبأة بإحكام التي تنمو في أحادي الطبقة. يجب أن يكون خلايا نظيفة, حواف محددة, مع قليل من دون تمييز.

يجب الحفاظ على عقم في جميع الأوقات عند التعامل مع خلايا [هس]. نظيفة وتعقيم مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع المعدات قبل استخدامها.

يجب أن تتم تصفيته جميع الكواشف باستخدام 0.22 قبل حجم ميكرون المسام مرشح لاستخدام. استخدام antiboiotics في زراعة الخلايا هس] ليس من الضروري ويجب تجنبها.

 

يجب تعيين بيئة منفصلة على خط النار في محطة قطف المعينة. العلبة معقمة للمحطة يمكن أن تكون الضميمة ثابتة (مثل محطة عمل PCR) مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية, غطاء تدفق الصفحي, أو خزانة السلامة البيولوجية.

وهناك حاجة إلى مجهر تشريح داخل محطة قطف لمراقبة مستعمرات كما تتم إزالة مناطق متباينة. لوحة من الزجاج الأمامية من العلبة ثابتة أو خزانة السلامة البيولوجية يجب أن يتم تعديل للسماح oculars المجهر لتوسيع من خلال لوحة دون المساس تدفق الهواء الصحيح والعقم.

للحفاظ على صحة مزارع الخلايا [هس], يجب passaged الخلايا في الوقت الأمثل, عادة كل 4-7 أيام. في هذا الوقت قد وصلت إلى الحد الأقصى لحجم المستعمرات، وربما يكون بداية لدمج. يمكن المستعمرات اندمجت زيادة معدل التمايز في الثقافة. تقع نسب انقسام عموما بين 1:3 و 1:5, اعتمادا على عدد من المستعمرات مطلي, معدل التوسع, والظروف والثقافة.

المستعمرات Overplated (نسبة تقسيم منخفض جدا) ومن المرجح أن دمج قبل الأوان، وتحتاج إلى passaged قبل أن تصل إلى أقصى حجمها.

الثقافات على طبقة المغذية MEF التي هي أكثر من 2 أسابيع من العمر يجب أن passaged إلى MEFS جديدة من شأنها أن تدعم نمو غير متمايز وانتشار.

منذ التمايز يحدث بشكل طبيعي في مزارع الخلايا [هس], ومن المتوقع كمية صغيرة. قد يحدث التمايز متكررة أو المفرط إذا كان الثقافات لا يتلقون الرعاية المناسبة. يجب أن يتم تغذية الخلايا كل يوم, وينبغي تجنب فرط بين الممرات. دائما استخدام الكواشف جديدة.

جميع وسائل الإعلام, MEFS والكواشف ينبغي أن تستخدم في 14 أيام لتجنب نمو الخلايا غير متمايزة [هس]. الكثير جديدة من الكواشف, such as Knockout Serum Replacement, FBS and MEFs, should be screened prior to use. Remember that any differentiated cells not removed prior to passaging will be transferred to the new cultures.

أيضا, try to keep the cells at 37°C whenever possible. Minimize the time the cells spend outside of the incubator (منها مثلا. on the microscope stage or in the biological safety cabinet.) A heated microscope stage can be very beneficial if the cells will be of the incubator for extended periods of time.

When observing the hES cell cultures under the microscope, first assess the overall quality and size of the colonies view using a low power (2x or 5x) objective. If potentially differentiated cells are observed at low power, confirm the differentiated morphology using a higher magnification objective (10X).

 


NBScience

منظمة بحثية العقد

العلاج بالخلايا الجذعية