آخر تحديث: أغسطس 17, 2026
بروتوكول زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
الجذع الجنيني البشري (hES) ويجب مراقبة الخلايا والعناية بها من أجل الحفاظ على صحتها, ثقافات غير متمايزة.
على الأقل, يجب تغذية الثقافات كل يوم عن طريق إجراء تغيير كامل للوسط لتجديد العناصر الغذائية المفقودة والحفاظ على الثقافات خالية من عوامل التمايز غير المرغوب فيها. على الرغم من أن وجود قدر صغير من التمايز أمر طبيعي ومتوقع في مزارع الخلايا الجذعية, يجب تنظيف الثقافة بشكل روتيني عن طريق الإزالة يدويًا, أو “اختيار” مجالات متباينة. يعد تحديد وإزالة التمايز الزائد من ثقافات الخلايا HES من التقنيات الأساسية في الحفاظ على مجموعة صحية من الخلايا.
بروتوكول
1. صيانة: مراقبة الثقافات تحت المجهر
إزالة لوحة واحدة من خلايا HES من الحاضنة 37 درجة مئوية وتقديمهم إلى المجهر.
مراقبة المستعمرات في طاقة منخفضة, باستخدام التكبير 2X أو 5X, لتقييم جودة الثقافة الشاملة. لاحظ ما يلي: لون متوسط عادي, عدم وجود أي تلوث واضح, الحجم الكلي للمستعمرة, الجودة والكثافة, وأية ملاحظات أخرى.
لاحظ تغيرات اللون المتوسطة.
بسبب التغير في الرقم الهيدروجيني واستنفاد العناصر الغذائية في الوسط بعد حضانة بين عشية وضحاها مع خلايا HES, سيتغير الوسط من اللون الأحمر إلى اللون أ “قَشَّة” لون. إذا ظهر الوسط باللون الأرجواني, حدث تحول أساسي في الرقم الهيدروجيني. إذا ظهر الوسط باللون الأصفر للغاية, تحمض الوسط. قد يكون الوسط الأصفر للغاية نتيجة للمستعمرات المكتظة للغاية في البئر أو التلوث.
يجب أن يظهر الوسط واضحًا في جميع الأوقات. على الرغم من أن وجود مستوى معين من حطام الخلايا في الوسط أمر طبيعي, لا ينبغي أن يبدو غائما أبدا. إذا لوحظ مستوى عال من حطام الخلية, الثقافة ليست صحية وقد تكون ملوثة.
إذا كانت الثقافات لا تتطلب الصيانة أو المرور, يمكن نقلهم إلى خزانة السلامة البيولوجية لإطعامهم
إذا كانت الثقافات تحتوي على أكثر من تقريبا 10% تمييز المستعمرات, ينبغي أن تكون الخلايا “تنظيفها” عن طريق إزالة المناطق المتمايزة يدويًا
إذا كانت الثقافات تحتوي على مستعمرات كبيرة أو كثيفة, أو طبقة التغذية MEF أكثر من 12 أيام من العمر, يجب أن يتم مرور الخلايا
2. تغذية خلايا HES
في خزانة السلامة البيولوجية المعقمة, إزالة غطاء طبق الثقافة ونضح المتوسطة المستهلكة. لا تسمح لطرف الماصة بلمس أي جزء من اللوحة بخلاف داخل الآبار مباشرة. إذا كان هناك أي قلق من التلوث, تغيير إلى جديد, ماصة معقمة.
باستخدام ماصة زجاجية معقمة, أضف الكمية المناسبة من مستنبت الخلايا HES الدافئ إلى كل بئر. للثقافات في لوحة 6-جيدا, يضيف 2.5 مل المتوسطة لكل بئر.
أعد اللوحة إلى الحاضنة لتبقى عند درجة حرارة 37 درجة مئوية 5% ثاني أكسيد الكربون.
3. إزالة التمايز من ثقافات الخلايا HES
تحويل 9 ماصات باستور الزجاجية بوصة في أدوات الالتقاط عن طريق تشكيل الأطراف فوق اللهب المتحكم فيه لموقد الكحول. تأكد من أن طرف الماصة مغلق لمنع التلوث وتقريبه لتجنب خدش البلاستيك في طبق الثقافة. قم بتعقيم أدوات الانتقاء قبل الاستخدام باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية الموجود في خزانة السلامة البيولوجية أو حاوية الانتقاء.
إزالة المناطق المتمايزة. غالبًا ما يحدث التمايز في جزء فقط من مستعمرة خلايا HES, عادة على طول الحواف أو على شكل بقع معزولة في المركز. إذا تم التفريق فقط بين قسم من المستعمرة, فقط المنطقة المتمايزة تحتاج إلى إزالتها. غالبًا ما يمكن للتمايز أن يرفع اللوحة في أ “لزجة” ملزمة, ومن المفيد أولاً فصل الخلايا المتمايزة عن بقية المستعمرة عن طريق رسم خط عبر المستعمرة بنهاية أداة الانتقاء.
بمجرد فصل قطع المستعمرة, قم بتحريك أداة الالتقاط بلطف على طول اللوحة لفصل الخلايا غير المرغوب فيها. احرص على عدم التخلص من الكثير من طبقة تغذية MEF بين المستعمرات في هذه العملية.
عندما تتم إزالة كافة الخلايا المتمايزة من اللوحة (وتطفو في الوسط), إعادة الثقافة إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح المتوسطة التي تحتوي على الخلايا المتمايزة واستبدالها مع مستنبت الخلية HES الطازجة.
4. تمرير خلايا HES
حضانة الانزيم
في خزانة السلامة البيولوجية المعقمة, إزالة غطاء طبق الثقافة 6-جيدا ونضح المتوسطة المستهلكة من الآبار ليتم باساجيد. لا تسمح لطرف الماصة بلمس أي جزء من اللوحة بخلاف داخل الآبار مباشرة.
باستخدام ماصة زجاجية معقمة, يضيف 1 مل من كولاجيناز الرابع تحسنت إلى كل بئر ليتم باساجيد.
أعد اللوحة إلى الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية 5 دقائق.
تجريف وتجميع خلايا HES
بعد احتضان الخلايا بالكولاجيناز, مراقبة المستعمرات تحت المجهر. يجب أن يسبب الإنزيم تغييرًا طفيفًا ولكن ملحوظًا في حواف المستعمرة.
في خزانة السلامة البيولوجية, قم بسحب الإنزيم بلطف من كل بئر واستبدله بـ 2.0 مل HES مستنبت الخلية.
قم بإمالة لوحة الثقافة نحوك قليلاً والتقطها 2.0 مل المتوسطة في البئر الأول مع 5 مل ماصة زجاجية.
عقد الماصة عمودي على الجزء السفلي من اللوحة, قم بتحريك طرف الماصة بلطف عبر البئر مع إطلاق الوسيط ببطء.
كرر حركة القشط والماصة 3-4 مرات حتى تتم إزالة كافة المستعمرات من البئر. الماصة بلطف لتجنب تفتيت المستعمرات إلى قطع صغيرة جدا. عندما تتم إزالة الخلايا من البئر الأول, اترك المحتويات في البئر وابدأ في كشط الخلايا من البئر التالي.
عندما يتم كشط جميع الآبار التي سيتم تمريرها, تجمع المتوسطة التي تحتوي على قطع مستعمرة من كل بئر في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي.
شطف الآبار كشط عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت الخلية HES لكل بئر. جمع هذا الشطف ونقله إلى الأنبوب المخروطي.
بيبيت الخلايا بلطف في الأنبوب لتفتيت قطع المستعمرة حتى الحجم المطلوب.
الطرد المركزي للخلايا 5 دقائق في 200 س ز.
طلاء خلايا الخلية HES
بينما تكون خلايا HES في أجهزة الطرد المركزي, إعداد لوحة تغذية MEF جديدة 6-جيدا. قم بتسمية اللوحة بمعلومات الخلية HES المناسبة: خط الخلية, رقم مرور جديد, وتاريخ المرور. نضح المتوسطة MEF من الآبار وإضافة 1.0 مل برنامج تلفزيوني لكل بئر. دوامة بلطف المخزن المؤقت حول الآبار ونضح غسل برنامج تلفزيوني. يضيف 1.5 مل HES مستنبت الخلية إلى كل بئر ووضع اللوحة جانبا.
عند الانتهاء من الطرد المركزي لخلايا HES, أعد الأنبوب إلى خزانة السلامة البيولوجية. نضح طاف, الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية معبأة بشكل فضفاض.
Resuspend الخلايا في بيليه مع ما يكفي من المتوسط 1 مل HES مستنبت الخلية لكل بئر ليكون مطلي. عند الانقسام إلى 6 آبار جديدة, إعادة تعليق بيليه في 6 مل وسط.
إضافة بلطف وبشكل متساو 1 مل من تعليق الخلية لكل بئر معد من لوحة التغذية MEF.
وضع اللوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية وحرك اللوحة بعناية إلى الأمام إلى الخلف, وجنبا إلى جنب لتوزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
السماح للخلايا لنعلق عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. النتائج التمثيلية:
خلايا HES غير المتمايزة صغيرة, معبأة بإحكام, وعادة ما تتكون من أكبر, المزيد من الخلايا المنتشرة.
يمكن رؤية أشكال مختلفة تحت التكبير المنخفض تحت المجهر. مورفولوجيا الخلية الجيدة تحتوي على خلايا صغيرة, خلايا معبأة بإحكام تنمو في طبقة أحادية. يجب أن تكون الخلايا نظيفة, حواف محددة, مع القليل من التمييز.
يجب الحفاظ على العقم في جميع الأوقات عند العمل مع خلايا HES. تنظيف وتعقيم خزانة السلامة البيولوجية وجميع المعدات قبل الاستخدام.
يجب تصفية جميع الكواشف باستخدام 0.22 ميكرومتر مرشح حجم المسام قبل الاستخدام. إن استخدام المضادات الحيوية في زراعة الخلايا HES ليس ضروريًا ويجب تجنبه.
وينبغي إنشاء بيئة منفصلة كمحطة اختيار محددة. يمكن أن يكون العلبة المعقمة للمحطة عبارة عن حاوية ثابتة (مثل محطة عمل PCR) مع مصدر ضوء للأشعة فوق البنفسجية, غطاء التدفق الصفحي, أو خزانة السلامة البيولوجية.
هناك حاجة إلى مجهر تشريح داخل محطة الانتقاء لمراقبة المستعمرات عند إزالة المناطق المتمايزة. يجب تعديل اللوحة الزجاجية الأمامية للحاوية الثابتة أو خزانة السلامة البيولوجية للسماح لعين المجهر بالتمدد عبر اللوحة دون المساس بتدفق الهواء المناسب والعقم.
للحفاظ على ثقافات الخلايا HES صحية, يجب أن يتم مرور الخلايا في الوقت الأمثل, عادة كل 4-7 أيام. في هذا الوقت وصلت المستعمرات إلى الحد الأقصى لحجمها وربما بدأت في الاندماج. يمكن للمستعمرات المدمجة زيادة معدل التمايز في الثقافة. تقع نسب الانقسام بشكل عام بين 1:3 و 1:5, اعتمادا على عدد المستعمرات مطلي, معدل التوسع, وظروف الثقافة.
المستعمرات المتضخمة (نسبة الانقسام منخفضة للغاية) من المحتمل أن تندمج قبل الأوان وتحتاج إلى المرور قبل أن تصل إلى الحد الأقصى لحجمها.
الثقافات الموجودة على طبقة تغذية MEF أكبر من 2 يجب تمرير الأسابيع القديمة إلى MEFs الجديدة التي ستدعم النمو والانتشار غير المتمايز.
منذ التمايز يحدث بشكل طبيعي في ثقافات الخلايا HES, ومن المتوقع كمية صغيرة. قد يحدث تمايز متكرر أو مفرط إذا لم تتلق الثقافات الرعاية المناسبة. يجب تغذية الخلايا كل يوم, وينبغي تجنب النمو الزائد بين الممرات. استخدم دائمًا الكواشف الطازجة.
كافة وسائل الإعلام, ينبغي استخدام MEFs والكواشف داخل 14 أيام لتجنب نمو الخلايا غير المتمايزة. الكثير من الكواشف الجديدة, مثل استبدال المصل بالضربة القاضية, FBS وMEFs, يجب فحصها قبل الاستخدام. تذكر أن أي خلايا متمايزة لم تتم إزالتها قبل المرور سيتم نقلها إلى الثقافات الجديدة.
أيضًا, حاول إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية كلما أمكن ذلك. تقليل الوقت الذي تقضيه الخلايا خارج الحاضنة (على سبيل المثال. على مسرح المجهر أو في خزانة السلامة البيولوجية.) يمكن أن تكون مرحلة المجهر الساخن مفيدة جدًا إذا كانت الخلايا ستبقى في الحاضنة لفترات طويلة من الزمن.
عند مراقبة ثقافات الخلايا HES تحت المجهر, قم أولاً بتقييم الجودة الشاملة وحجم عرض المستعمرات باستخدام طاقة منخفضة (2س أو 5x) موضوعي. إذا لوحظت خلايا محتملة التمايز عند طاقة منخفضة, تأكيد التشكل المتمايز باستخدام هدف التكبير العالي (10X).
مراجعة الحالة العلمية
هل ترغب في فهم ما إذا كانت البرامج السريرية الحالية, التطورات البحثية الأخيرة, أو قد تكون النهج الناشئة ذات الصلة بحالتك الفردية?
أرسل سؤالك إلى فريقنا العلمي. يقوم المكتب الرئيسي لـ NBScience في المملكة المتحدة بتنسيق الاستفسارات عبر الشبكة الدولية للمراكز الطبية, العلماء, و استشاريين متخصصين.
- مراجعة المعلومات التي تقدمها
- البحوث ذات الصلة ومعلومات البرنامج السريري
- استجابة واضحة تركز على حالتك
لا التزام. سيتم مراجعة سؤالك بسرية.
المعلومات التعليمية والبحثية فقط. هذه الخدمة لا تشكل نصيحة طبية, تشخبص, روشتة, أو شخصية توصية العلاج.
