慢性肝病患者的干细胞治疗

1. 介绍
   成体干细胞是一群不成熟的细胞，具有自我更新的能力，为人体提供持续的细胞来源，以维持健康的组织或替代受损的组织. 我们当今的科学发展和临床经验共同巩固了我们对介导干细胞谱系定型和分化的信号的理解. 从这里, 使用成体干细胞来重新填充慢性患病器官的概念现在是再生医学的一个可行选择.

虽然人类胚胎干细胞在临床环境中的使用因其致癌潜力和伦理问题而受到极大损害, 了解成体干细胞复杂的发育可塑性的进展速度, 特别是来自骨髓的那些, 已成功允许将其用于具有独立伦理问题的转化研究. 20 世纪 60 年代开创性地使用骨髓干细胞作为白血病的可行治疗选择, 从那时起，骨髓瘤和淋巴瘤已经取得了长足的进步. 今天，我们能够利用这些干细胞来产生骨骼和软骨 [1] 并修复心脏和肝脏功能 [2, 3]. 由于本章对这些令人兴奋的发展的详细回顾过于宽泛, 我们将主要关注利用骨髓干细胞治疗慢性肝病.

2. 慢性肝病
   肝硬化是慢性肝病的终末期，与肝功能衰竭和门静脉高压引起的许多严重的全身并发症有关. 这种情况预后较差，治疗难度大. 仅在英国就有十分之一的人患有某种形式的肝脏疾病，许多人因此过早死亡 [4]. 目前，肝病是英国男性和女性第五大最常见的死亡原因，而冠心病的死亡率则居高不下。, 癌症, 呼吸系统、脑血管疾病发病率呈下降趋势, 过去英格兰和威尔士所有类型肝病的死亡率 25 岁月已过去 150% 男性的增加和 100% 在女性中 [5]. 这一显着的上升趋势清楚地表明需要提前规划卫生服务. 全世界, 肝纤维化和肝硬化的常见原因包括乙型肝炎, 丙型肝炎和饮酒. 其他原因包括免疫介导的损伤, 遗传异常, 和非酒精性脂肪性肝炎，主要与糖尿病和代谢综合征有关 [6-8].

3. 肝硬化
   肝硬化或纤维化是慢性肝病常见的进行性病理病变，是由于各种肝损伤因素而发生的. 肝硬化被定义为被纤维带包围的再生结节的组织学发展，导致门静脉高压; 肝细胞癌和终末期肝病的发展. 在过去的二十年中，肝硬化发生和进展的主要细胞和分子机制已被明确定义. 肝炎病毒感染等多种致病因素; 缺血; 寄生虫感染; 铜或铁负载异常, 所有这些都会导致慢性炎症，最初导致细胞外基质的过度合成 (细胞外基质). 活化的肝星状细胞; 受损或再生的肝细胞; 枯否细胞; 正弦细胞和自然杀伤细胞 (NK细胞) 细胞都会产生细胞因子和免疫反应因子，以自分泌和旁分泌的方式发挥各种生物效应，引发纤维化生长 [9-12].

对肝硬化自然史和病理生理学的详细了解有助于更好地管理其并发症，从而提高患者的生活质量. 虽然药物治疗可以阻止失代偿性肝硬化的进展, 原位肝移植 (光端机) 仍然是末期肝硬化唯一高度成功和治愈的选择. 来自器官共享联合网络的生存数据 (一些) 学习于 2004 表明存活率仅为 61% 在 8 移植后一年 [13]. OLT 不能作为晚期肝衰竭的唯一选择. 除了兼容性和合并症因素的问题之外，对于不断增加的需要移植的患者名单而言，器官的可用性有限，这意味着并非每个人都有资格进行移植. 因此，寻找合适的替代品的需求尚未得到满足.

4. 肝细胞移植
   肝细胞移植已被确定为 OLT 的一种有前景的替代方案，用于治疗某些肝脏代谢紊乱和急性肝衰竭. 具有保留原生肝脏的优点, 肝细胞移植侵入性较小，可以重复进行，从而提高急性肝衰竭患者康复的机会 [14-16]. 门静脉内注射的供体肝细胞植入宿主肝实质的机制涉及肝窦内的细胞迁移 [17]. 这些细胞被困住，导致门静脉高压和缺血再灌注 [18, 19]. 因此，这会启动先天免疫系统的清除，其中细胞因子的相关释放诱导血管通透性，从而允许存活的肝细胞通过肝窦开窗移位并整合到肝实质中 [20]. 尽管移植后肝细胞的初始植入成功率较低, 动物模型中的重复肝细胞移植显示移植细胞数量有足够的增加，可以从某些代谢缺陷中恢复 [21]. 从未使用或不适合整个器官移植的供体肝脏中分离肝细胞. 从单个供体采集的细胞除了可以冷冻保存用于急性肝衰竭的紧急治疗或肝脏代谢紊乱的重复治疗外，还具有可用于多个受体的优点 [22-24]. 迄今为止，肝细胞移植仅用于解决单基因缺陷和一些代谢性疾病，其中与 OLT 相关的风险不合理，或者旨在避免或推迟肝移植. OLT 最成功的临床结果是患有代谢紊乱的患者，包括尿素循环缺陷的患者 [23, 24]; 克里格勒-纳贾尔综合征类型 1 (CN1) [25, 26]; 糖原累积病类型 1 [27] 和因子VII缺乏症 [28]. 尽管最初认为肝细胞移植的免疫原性低于整个器官移植, 来自动物模型的数据表明，无论使用同基因细胞还是同种异体细胞，先天免疫系统都会清除大量肝细胞 [18]. 因此，大多数移植机构使用与肝移植相同的免疫抑制治疗 [29]. 由于多种因素导致肝细胞移植后的临床结果仍然存在很大差异，包括肝脏纤维化损伤，限制了细胞的正确植入; 每位患者重复输注时提供足够肝功能所需的细胞的可用性, 从供体肝脏中分离出的细胞质量通常非常低, 必须确定新的且容易获得的细胞来源. 这种强劲的需求激发了人们对造血干细胞治疗急性肝衰竭的兴趣.

5. 成体干细胞的发育可塑性
   此前人们认为成体干细胞受到谱系限制, 然而，过去十年的研究成果现已充分证实人类成体干细胞具有显着的发育可塑性. 成人骨髓来源的肌原祖细胞参与受损骨骼肌再生的能力 [30]; 缺血性心肌 [31-33]; 神经发生 [34, 35] 以及将成体神经干细胞转化回造血细胞 [36], 重新定义了发育生物学. 现在人们普遍认为，最初的三个胚层对于转分化的发生并不一定至关重要 [37]. 这意味着成体干细胞可以表现出与胚胎干细胞相似的多能性.

6. 造血干细胞生成肝细胞
   大约十年前就证明了成人骨髓干细胞可以分化为肝谱系. 两个独立的研究小组表明，成年大鼠骨髓中含有细胞亚群 (关于 3%) 共表达造血干细胞标志物 (CD34+, c-套件, Thy-1); 甲胎蛋白 (法新社) 和c-met. 当他们用肝细胞生长因子培养这种骨髓粗提物时 (肝细胞生长因子) 和表皮生长因子 (表皮生长因子), 他们能够检测白蛋白的表达, 完全分化肝细胞的标志物 [38, 39]. 多年来，体外培养条件的进一步完善导致造血细胞分化，表达更成熟的肝脏特异性转录因子，包括人肝细胞核因子-1α (HNF-1α); 细胞角蛋白 (CK8); CK19 和法新社 [40, 41]. 对成人骨髓的研究同样证实了它们分化为肝样细胞的能力 [42, 43] 其中许多细胞因子和生长因子被证明对于在体外条件下驱动这种分化很重要 [44-46]. 更有趣的是，发现将大鼠造血干细胞暴露于受损的肝组织中会诱导功能性肝细胞因子的表达 (CK18, 白蛋白和转铁蛋白) [47]. 这表明仅肝脏微环境就足以提供诱导干细胞向肝谱系转化的适当线索. 几项人体尸检研究证实了这一观察结果，即在肝脏中发现了骨髓来源的细胞. 泰斯等人。, (2000) 研究了性别不匹配治疗性骨髓移植和 OLT 受者的档案尸检和活检肝脏标本 [48]. 通过免疫组织化学染色检测 CK8, CK18 和 CK19, 他们鉴定了骨髓来源的肝细胞和胆管细胞，并通过荧光原位杂交检测了 Y 染色体 (鱼). 使用双染色分析, 他们发现大量移植的肝细胞 (4%-43%) 和胆管细胞 (4%-38%) – 是骨髓来源的- 补充肝实质. 尽管平行研究中这一观察结果存在普遍差异 [49, 50], 最终的结论是，骨髓来源的造血干细胞能够成功移植到肝脏中，并逐渐采取与肝谱系非常相似的表型.

7. 人类研究
   今天, 研究最广泛的成体干细胞来自造血谱系. 造血干细胞 (造血干细胞) 形成骨髓室的一部分，骨髓室构成异质间充质干细胞群; 定型祖细胞和非循环基质细胞. 骨髓室中 HSC 的鉴定很大程度上基于细胞表面标志物的表达. 检测分化簇, CD34 通常在人类研究中用作祖干细胞的替代标记，尽管也存在不表达 CD34 的更原始 HSC 亚群 [51, 52]. 尽管大量研究表明骨髓干细胞可以产生肝细胞, 它们作为治疗剂的应用仍处于起步阶段. 许多研究仍处于试点阶段，需要随机化和对照, 然而，那些报告显示了需要构象的有趣结果. 第一项临床研究是由德国小组进行的, 在埃施等人。, (2005), 其中三名患者在右肝段门静脉栓塞后被注入自体 CD133+ 细胞 [3]. 计算机断层扫描 (CT) 左侧节段体积分析扫描显示 2.5 与未给予骨髓干细胞的对照组相比，三名患者的生长速度增加了数倍. 尽管患者数量较少且缺乏足够规模的随机对照组, 该数据展示了骨髓干细胞在增强肝脏再生方面的巨大潜力. 一年后, Gordon 等人报告了一项平行研究。, (2006) 其中包括对五名肝功能不全患者进行的 I 期临床试验 [53]. 这些患者接受了粒细胞集落刺激因子治疗 (粒细胞集落刺激因子) 通过白细胞分离术动员干细胞进行收集，然后纯化表达 CD34+ 的细胞，然后将其注射到门静脉或肝动脉中. 五名患者中的三名血清胆红素有所改善，而五名患者中的四名血清白蛋白显着增加. 临床上, 该手术耐受性良好，没有观察到与手术相关的并发症，并且数据得出结论，干细胞对受损肝脏的再生有显着贡献 [53]. 在另一项独立研究中, 特莱等人。, (2006) 招募了 9 名肝硬化患者，他们被注射了富含 CD34+ 表达的自体骨髓干细胞, CD45+ 和 c-kit+. 对这些患者进行了随访 24 几周内，除了 Child-Pugh 评分显着改善外，他们的血清白蛋白水平也显着改善 [54]. 一年后, 拉吉库马尔等人。, (2007) 报道了另一项小规模试验 22 慢性肝病患者 (Child-Pugh 评分 B-C) 已被录取 [55]. 200对ml至300ml骨髓抽吸物进行密度梯度分级以分离CD34+细胞. 然后通过肘正中静脉静脉注射. 肝功能检查; 之前进行了超声和 CT 扫描, 4 几周和 8 细胞输注后几周. 32% 患者的胆红素水平下降; 67% 患者的血清白蛋白水平升高 73% 腹水减少. 本研究中没有患者在输血后出现严重不良反应，大多数患者的总体生活质量指数显着改善 (82%) [55]. 在 2007, 穆罕默德内贾德等人。, [56, 57] 对失代偿性肝硬化患者进行了两项临床研究. 在第一项研究中，他们分别治疗了四名患者 31.73 x 106 培养的自体间充质干细胞, 通过外周静脉输注. I 期研究表明没有副作用，并且在随访结束时所有四名患者的生活质量均得到改善. 此外, 两名患者的终末期肝病评分模型 (病人 1 & 病人 4) 随访结束时，他们的 Child Pugh 评分显示出显着改善. 在第二项研究中, 他们用从骨髓中分离出的自体 CD34+ 细胞治疗了四名患者, 通过患者的肝动脉缓慢注入. 他们在两名患者中观察到白蛋白轻度改善, 然而, 两名患者的健康状况进一步恶化，其中一名患者在移植后几天因肝衰竭死亡. 由于副作用严重，该试验提前停止，得出的结论是，通过肝动脉输注 CD34+ 干细胞对于失代偿性肝硬化并不安全, 但建议使用替代途径移植 CD34+ 细胞可能是有益的. 证实了骨髓干细胞作为再生疗法的用途，并证明了其对肝功能不全患者的安全性, 派等人。,(2008) 对 9 名酒精性肝硬化患者进行了扩增的成人 CD34+ 干细胞输注至肝动脉的前瞻性临床疗效研究 (ALC) 以确定是否具有临床益处 [58]. 主要终点是评估将自体干细胞输注到这些患者的肝动脉中的安全性; 次要终点是通过血清学和生化分析评估肝功能的改善情况; 并确定是否有任何症状改善. CD34+干细胞输注后, CT扫描显示肝实质正常强化, 无局灶性肝脏病变证据; 此外, 多普勒超声扫描显示门静脉和肝动脉血流正常. 证实改善肝硬化患者肝功能的安全性和有效性, 莱维卡等人。, (2008) 然后报告了长期随访的结果 (12-18 月) 注射富含 CD34+ 的干细胞的慢性肝病患者 [59]. 在此期间，监测患者的副作用, 毒性和临床变化, 血液学和生化参数. 所有患者都能耐受治疗方案，没有任何与手术相关的并发症或副作用. 四名患者的血清胆红素水平初步改善, 其维护时间长达 6 月; 而在 3 名患者中仅观察到血清胆红素略有增加 12 月. 只有一名患者在稍长的一段时间内表现出血清胆红素升高 18 输注后几个月. CT扫描和血清AFP监测未显示患者有任何病变或肿瘤形成. 这项成功的研究为后续试验奠定了基础，最近李楠等人。, (2010) 报道了自体 CD34+ 输注治疗肝炎引起的肝衰竭患者的临床结果 [60]. 二十七名儿童患者- Pugh C 型肝硬化患者入组，其中 22 乙型肝炎呈阳性并且 5 丙型肝炎呈阳性. 50ml至120ml骨髓抽吸物进行Percoll梯度以分离骨髓干细胞. 20 的患者通过肝门静脉接受细胞输注，同时 7 使用 Seldinger 经皮技术通过肝动脉对患者进行输注. 对患者进行密切监测 3 移植后几个月，最初注意到肝功能测试下降了 3 天. 作者将此归因于用于进行动脉造影的造影剂. 由于所有患者都有孩子- Pugh C型肝硬化, 造影剂可能会加重肝损伤. 尽管如此, 患者随后确实表现出肝功能的改善 1 移植周. 最显着的复苏出现在 3 术后几个月，总胆红素和白蛋白水平最高. 全面的, 大多数患者的临床结果得到改善，黄疸得到缓解，腹水得到改善 3 治疗后几个月. 从这组患者中, 两人死亡, 一种是由于腹腔感染和肝功能衰竭, 第二个是上消化道大出血. Nikeghbalian等人报道了针对终末期肝病患者的最新临床研究。, (2011). 6 例患者门静脉内注射自体骨髓来源的 CD133+ 细胞. 这组患者与接受短期输注的患者进行了比较 (6月) 以及长期输液 (12 月) 单核细胞的. 肝功能检查呈阳性 24 对参与本试验的所有患者进行了数月的随访. 由于接受 MNC 或 CD133+ 细胞的组之间没有差异, 这项最近的研究强调了骨髓来源的祖单核干细胞的多功能性，无论其分化标记簇的亚群如何. 此外，这项研究还证实了它们的安全用途，可以避免终末期肝病患者进行肝移植的需要.

迄今为止提到的临床试验的高潮显示了血清纤维化标志物减少和胆红素改善的趋势, 干细胞输注后的白蛋白和 Child-Pugh 评分. 过去十年标志着肝脏再生治疗取得了重要进展; 然而积累的数据仍处于起步阶段. 目前尚不清楚输注途径是否重要，或者用 G-CSF 动员骨髓祖干细胞而不进行白细胞分离术是否足够. 直到更多地了解 HSC 促进肝细胞再生的机制, 以及接受患者的临床获益机制; 争议将不可避免地影响这种治疗方式. 一些作者提出，观察到的输注干细胞向肝细胞的转化只是细胞融合的副产品，并没有真正诱导转分化 [59, 60]. 其他人建议不要采用新的血统, 干细胞通过刺激组织特异性干细胞的激活和诱导血管内皮生长因子的释放来间接发挥再生能力 (血管内皮生长因子) 从而增加细胞的血液供应并帮助修复受损组织 [61, 62]. 有报道还表明，HSC 可能仅通过诱导 B 细胞白血病/淋巴瘤-2 基因的表达来发挥再生能力 (Bcl-2) 和白细胞介素6 (白细胞介素6) 以旁分泌方式抑制周围组织的细胞凋亡和炎症 [62-64]. 除了这些不确定因素, 将成体干细胞输注至肝脏的归巢机制仍不清楚. 有建议认为趋化因子与基质衍生因子相似 1 可能涉及, 然而, 这还有待验证 [65]. Although the application of stem cell therapy will not be prevented despite an incomplete understanding of the mechanisms involved, a clearer picture will ultimately enable better tailoring of stem cell therapy to the disease in question.