Pesquisa com células-tronco pluripotentes induzidas na era da medicina de precisão

Takashi Hamazaki Nihal El Rouby Natalie C. Fredette Katherine E.. Santostefano Naohiro Terada
Publicado pela primeira vez: 18 Janeiro 2017 https://doi.org/10.1002/stem.2570

Avanços recentes nas tecnologias de sequenciamento de DNA estão revelando como as variações genéticas humanas se associam a riscos diferenciais para a saúde, suscetibilidades a doenças, e respostas a medicamentos. Espera-se agora que essas informações ajudem a avaliar os riscos individuais para a saúde, crie planos de saúde personalizados e trate os pacientes com precisão. Ainda é um desafio, no entanto, entender como tais variações genéticas causam as alterações fenotípicas nas patobiologias e na resposta ao tratamento. Célula-tronco pluripotente induzida por humanos (IPSC) tecnologias estão emergindo como uma estratégia promissora para preencher as lacunas de conhecimento entre os estudos de associação genética e os mecanismos moleculares subjacentes. Avanços nas tecnologias de edição de genoma e melhoria contínua nas técnicas de diferenciação de iPSC estão particularmente tornando esta direção de pesquisa mais realista e prática. Estudos pioneiros demonstraram que iPSCs derivadas de uma variedade de doenças monogênicas podem recapitular fielmente os fenótipos da doença in vitro quando diferenciadas em tipos de células relevantes para a doença. Foi demonstrado que é possível recapitular parcialmente os fenótipos da doença, mesmo com doenças de início tardio e poligênicas. Mais recentemente, Demonstrou-se que as iPSCs validam os efeitos de polimorfismos de nucleotídeo único relacionados a doenças e tratamentos, identificados por meio de análise de associação genômica ampla. Nesta revisão, discutiremos como a pesquisa iPSC contribuirá ainda mais para a saúde humana na próxima era da medicina de precisão. Células-tronco 2017;35:545–550

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Declaração de Significância
Cada pessoa tem um conjunto único de variações genéticas que afetam a suscetibilidade e a proteção contra doenças comuns e raras.. Embora as associações entre a saúde humana e as variabilidades individuais precisem ser validadas em princípio, ainda é um desafio validar os efeitos nos processos biológicos reais. As células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem oferecem uma oportunidade única para dissecar os papéis das variantes genéticas na patogênese. Esta revisão analisa os desenvolvimentos recentes sobre como a pesquisa com células-tronco pluripotentes induzidas contribuirá ainda mais para a saúde humana na próxima era da medicina de precisão.

Avanços recentes na pesquisa do genoma humano levando a uma era de medicina de precisão
O primeiro genoma humano de referência foi elaborado em 2001 após um esforço colaborativo internacional entre instituições acadêmicas, com o objetivo de caracterizar variações genéticas em todo o genoma humano 1, 2. Após a conclusão do projeto genoma humano, esforços prolongados para catalogar essas variantes genéticas foram feitos, o primeiro deles foi o projeto internacional HapMap, que teve como objetivo construir blocos de haplótipos das variações genéticas mais comuns, nomeadamente, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em populações humanas 3, 4. O 1000 projeto genomas (http://www.1000genomes.org/) caracterizou variações genéticas comuns e raras em 2,504 indivíduos de 26 diferentes populações usando métodos baseados em sequenciamento de próxima geração e matrizes densas de genotipagem 5. Com o fluxo de informações e a disponibilidade de plataformas de genotipagem, tornou-se possível interrogar milhões de SNPs simultaneamente, de centenas a milhares de indivíduos, por meio de análise de associação genômica ampla (GWAS). Esta abordagem revolucionou o campo da genética, permitindo que muitas associações genéticas sejam feitas através de um agnóstico, abordagem sem hipóteses. Desde as primeiras ondas de publicações do GWAS em 2005, 23,058 As associações de características SNP foram publicadas no National Human Genome Research Institute - European (NHGRI-EBI) totalização do catálogo 2,502 Estudos GWAS 6

A farmacogenômica é um campo dedicado à identificação de determinantes genéticos da resposta ou efeitos adversos de medicamentos e é fundamental para o conceito de medicina de precisão., o que envolve a utilização do genótipo para orientar a seleção do medicamento. Apesar de uma era frutífera de descobertas do GWAS em farmacogenômica, muitas dessas variantes ainda não chegaram à utilização clínica. Um grande obstáculo à implementação da farmacogenómica é a ligação mecanicista subjacente desconhecida(é) entre fenótipo de resposta a medicamentos e genótipo. Embora alguns SNPs estejam localizados em genes biologicamente relevantes para o fenótipo em estudo, a maioria das variantes reside em áreas não codificantes do genoma, onde uma conexão direta com o fenótipo é desconhecida e um papel na regulação genética é presumido. Decifrar o papel dos sinais genéticos associados para revelar como estas variantes funcionam a nível molecular e celular é crucial para uma compreensão clara do processo da doença e implementação da medicina personalizada.

Em 2015, a administração Obama anunciou o lançamento de uma iniciativa de medicina de precisão pelos Institutos Nacionais de Saúde 7, 8 (https://www.nih.gov/precision-medicine-initiative-cohort-program) Nesta iniciativa, estudos de coorte em larga escala serão conduzidos para integrar o estilo de vida individual, ambiente, e informações genômicas, construir uma base de conhecimento abrangente que possa prever o risco individual de doenças e a resposta aos tratamentos. O sequenciamento do genoma e a caracterização da variabilidade genética foram avanços iniciais em direção aos objetivos da medicina de precisão de utilizar dados individuais para diagnosticar, tratar, e prever a resposta a tratamentos médicos. Com o advento de tecnologias de sequenciamento de última geração de alto rendimento e custos em rápido declínio, é viável realizar genoma inteiro, exoma inteiro (codificação de proteínas), e transcriptoma (Transcrição de RNA) sequenciamento para sondar as associações com características fenotípicas/condições de doença. Adicionalmente, integrando dados ômicos multidimensionais (POR EXEMPLO, genômica, transcriptômica, epigenômica, proteômica, e metabolômica) promete elucidar interações biológicas envolvidas em doenças complexas e lançar luz sobre variantes genéticas importantes que podem passar despercebidas nas abordagens genéticas devido à falta de significância estatística estrita.

Embora as associações entre a saúde humana e as variabilidades individuais precisem ser validadas em princípio, ainda é um desafio validar os efeitos nos processos biológicos reais. O uso de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) é um sistema atraente para modelar variantes genéticas para estudar consequências moleculares em um tipo de célula relevante. A tecnologia iPSC reprograma uma célula somática totalmente madura em uma célula-tronco pluripotente que retém todas as características genéticas de um paciente individual. Essas iPSCs podem então ser diferenciadas em vários tipos de tecidos diferentes (para obter uma lista crescente de marcos validados de diferenciação de tecidos, veja Célula-tronco celular 18, Marchar 2016) 9, 10. Sistemas de edição genética como CRISPR-CAS9 ou TALEN ampliarão os estudos que visam desvendar os mecanismos e consequências funcionais das variações genéticas 11, 12. Isso pode ser feito através da edição de nucleotídeos únicos, introdução ou reversão de mutações em iPSCs e observação das alterações fenotípicas em células terminalmente diferenciadas.

iPSCs para encontrar curas para doenças monogênicas
As doenças podem ter etiologias monogênicas ou poligênicas. Doenças monogênicas, causadas pela herança de um único gene defeituoso são consideradas raras porque a prevalência de cada doença é bastante baixa, geralmente menos de 1/10,000 ao nascer. O número de doenças com loci genéticos causais conhecidos duplicou nos últimos 10 anos, como visto em Online Mendelian Inheritance in Man (OH MEU DEUS) estatísticas de entrada. Melhoria do diagnóstico genético e implementação de programas de rastreio (POR EXEMPLO, triagem neonatal e exames de alto risco) tornar possível identificar pessoas com doenças tão raras. Como resultado, doenças genéticas raras afetam 350 milhões de pessoas em todo o mundo e a prevalência global de todas as doenças de um único gene no nascimento é de aproximadamente 1/100. Desde o estabelecimento de iPSCs humanas em 2007 13, 14, tem havido uma expectativa extraordinária de utilizar as células para modelar “doenças em um prato” humanas 15, 16. Estudos pioneiros demonstraram que iPSCs derivadas de uma variedade de doenças monogênicas podem recapitular fielmente os fenótipos da doença in vitro quando diferenciadas em tipos de células relevantes para a doença 17, 18. A geração de linhagens de iPSC a partir de pacientes com essas doenças monogênicas é uma abordagem útil para estabelecer um modelo humano in vitro duradouro e foi demonstrada em numerosos estudos publicados 19-22. Os esforços colaborativos entre as comunidades de pesquisa produziram uma variedade de linhas de iPSC específicas para doenças, prontamente disponíveis através de bancos de iPSC 23 e os pesquisadores poderão encontrar linhas de células-tronco de interesse para conduzir estudos mecanísticos adicionais ou aplicar diretamente as células para triagem de drogas.

Embora muitas descobertas importantes tenham sido feitas para doenças monogênicas através da pesquisa iPSC, um dos estudos mais interessantes é um relatório recente sobre acondroplasia de Yamashita et al. 24. Importante, os autores estabeleceram cuidadosamente um método para diferenciar iPSCs em condrócitos para formar tecido cartilaginoso. Este foi um passo crítico para Yamashita et al., porque o desenvolvimento de protocolos de diferenciação apropriados para tipos de células relevantes para doenças ainda pode ser um fator limitante para a pesquisa de iPSC. Eles foram capazes de recapitular com sucesso a formação anormal de cartilagem durante a diferenciação in vitro de iPSCs derivadas de pacientes com acondroplasia quando comparadas com aquelas de controles saudáveis. Além disso, mediante triagem composta, eles mostraram que as estatinas, medicamentos para redução de lipídios amplamente utilizados, corrigiu inesperadamente a cartilagem degradada no modelo iPSC. Este trabalho exemplar recapitula claramente os processos de doenças em uma placa e demonstra a utilidade e a promessa dos modelos iPSC para descobrir novos tratamentos para doenças monogênicas raras.

Além da diferenciação bidimensional em monocamada ou da diferenciação tridimensional básica (3D) diferenciação agregada, vários grupos desenvolveram protocolos sofisticados de diferenciação 3D, frequentemente denominada “cultura organoide” devido à sua capacidade de formar estruturas organizadas que lembram órgãos em desenvolvimento. Notavelmente, para cultura organoide do sistema nervoso central, Lancaster e outros. demonstraram que as iPSCs derivadas de um paciente microcefálico de fato formaram um organoide cerebral menor do que as iPSCs de um controle saudável 25. De forma similar, várias técnicas de cultura organoide para iPSCs evoluíram para gerar outros tipos de tecidos e órgãos (copo óptico, glândula pituitária) 26, 27. Sem dúvida, essas descobertas inovadoras fornecerão a complexidade necessária para modelar distúrbios com mais precisão e permitirão maiores oportunidades para testes pré-clínicos de opções de tratamento para células humanas in vitro.

iPSCs para definir outras variações fenotípicas em doenças monogênicas
Em distúrbios monogênicos humanos, uma única mutação genética é predominantemente responsável pelo fenótipo da doença. Em muitos casos, podemos prever como uma mutação específica em um único gene afeta a função da proteína (POR EXEMPLO, atividade enzimática residual), que se correlaciona com a gravidade e apresentação de uma doença. Isso é, no entanto, ainda é um desafio prever com precisão os sintomas clínicos, gravidade e início da doença a partir do tipo de mutação. Um exemplo desse desafio é a doença de Gaucher (GD), uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene GBA que codifica a glicocerebrosidase (GCase) 28. GCase é uma enzima lisossomal que catalisa a hidrólise do glicolipídeo glicocerebrosídeo em ceramida e glicose.. Pacientes com DG apresentam um amplo espectro de sintomas clínicos, incluindo hepatoesplenomegalia, deformidade óssea, anormalidade hematológica, e sintomas neurológicos. A mutação N370S no GBA é frequentemente encontrada no tipo 1 GD, que se apresenta com sintomas não neuronais. Por outro lado, a mutação L444P é frequentemente encontrada no tipo 2 ou 3 GD, que apresenta sintomas neurológicos. Eventos de recombinação do locus GBA com um pseudogene vizinho também foram associados a algumas apresentações clínicas incomuns 29. Variabilidades fenotípicas, no entanto, foram observados entre pacientes com mutações idênticas de GBA, como entre pares de irmãos afetados, e até mesmo entre gêmeos idênticos. Em um caso de gêmeos monozigóticos, um foi afetado pela DG, mas o outro não apresentou sintomas clínicos, mesmo com baixa atividade da GCase 30. Em GD, a deficiência de GCase leva ao acúmulo do metabólito intermediário glicoesfingolipídeos glucosilceramida, que é posteriormente metabolizado em esfingosina por uma GCase extra lisossomal, GB2. interessantemente, deleção de GBA2 em um modelo de camundongo GD resgatou sintomas viscerais e ósseos, sugerindo que o GBA2 poderia potencialmente ser direcionado para melhorar certas manifestações debilitantes da DG 31.

Em outro estudo, Awad e outros. descobriu o envolvimento de disfunções lisossômicas e um bloqueio de autofagia durante o processo neurodegenerativo da DG usando células neuronais derivadas de iPSCs de pacientes com tipo 2 GD (forma neuropática). Após tratamento com rapamicina, a morte neuronal foi induzida preferencialmente em neurônios do tipo 2 GD-iPSCs, mas não tipo 1 GD-iPSCs. Embora a expressão do fator de transcrição EB (TFEB), o regulador mestre dos genes lisossômicos foi regulado negativamente, a superexpressão de TFEB restaurou apenas parcialmente o processo neurodegenerativo em neurônios do tipo 2 GD-iPSCs 32. Essas descobertas representam um caminho promissor para identificar genes e não genéticos. (epigenética e/ou ambiental) moduladores que influenciam mutações causadoras de doenças. Como as iPSCs podem ser geradas a partir de indivíduos com diversas origens genéticas, e loci genômicos podem ser direcionados em iPSCs, tipos de células relevantes para a doença obtidos de tais iPSCs serão uma ferramenta indispensável para validar mecanismos de doença recentemente propostos e para rastrear fatores ambientais/pequenos compostos para modular fenótipos de doenças.

iPSCs para dissecar os papéis dos SNPs em distúrbios poligênicos e respostas diferenciais a medicamentos
Muitas doenças e características humanas comuns são influenciadas por vários fatores genéticos e ambientais. As doenças poligênicas resultam da herança aditiva de múltiplos polimorfismos sutis, culminando em um fenótipo afetado. Em 2016, aproximadamente 5,000 fenótipos de doenças foram catalogados e ligados a loci genéticos causais no OMIM (http://omim.org/statistics/entry). Os GWAS identificaram com sucesso centenas de variantes genéticas associadas a diversas condições e forneceram informações valiosas sobre diagnósticos, prognóstico, e otimização terapêutica para doenças humanas complexas 33. Um exemplo de comum, doença complexa e polifatorial é a hipertensão (hipertensão). A hipertensão é um grande fardo para a saúde nos EUA. que afeta aproximadamente 80 milhões de pessoas 34 e o tratamento direto ao paciente totaliza quase 40 bilhões de dólares por ano 35. Adicionalmente, A hipertensão aumenta o risco de doenças cardiovasculares avançadas, como acidente vascular cerebral e insuficiência cardíaca 34, 36 Numerosos agentes anti-hipertensivos, como diuréticos, Inibidores da ECA, bloqueadores dos receptores da angiotensina, betabloqueadores e inibidores dos canais de cálcio estão atualmente disponíveis, mas sua eficácia na pressão arterial varia entre os indivíduos. GWAS e estudos de caso para genes candidatos identificaram diversas variantes genéticas que podem regular a pressão arterial ou contribuir para a via farmacológica de um medicamento 37. Modelos animais têm sido utilizados intensamente para estudar doenças sistêmicas como a hipertensão, no entanto, podem nem sempre ser adequados para a compreensão do impacto biológico das variantes genéticas humanas. Também é difícil obter um grande número de tecidos apropriados e relevantes para o fenótipo de interesse. (POR EXEMPLO, músculo liso vascular ou endotélio) de uma pessoa com um genótipo específico para testar as consequências biológicas ou funcionais dessas variações genéticas. Para combater tais desafios, Biel et al.. construiu um repositório iPSC a partir de 17 Pacientes com hipertensão, cujas variações de SNP em todo o genoma, bem como respostas clínicas a medicamentos anti-hipertensivos estavam disponíveis 38. As iPSCs foram geradas a partir de uma coleta de sangue de células mononucleares do sangue periférico coletadas de participantes da Avaliação Farmacogenômica da Resposta Anti-hipertensiva (PERA) estudar 39 (https://clinictrials.gov/NCT00246519). Biel et al.. em seguida, diferenciou essas iPSCs em células musculares lisas vasculares e quantificou sua contração em resposta a vários estímulos fisiológicos 38. Além disso, o estudo também demonstrou a capacidade das iPSCs de recapitular uma modificação associada ao SNP da expressão de PRKCA. O SNP rs16960228 foi bem documentado em múltiplas coortes de GWAS para se associar a uma resposta medicamentosa hipertensiva, bem como a níveis de expressão diferencial de PRKCA. Esses dados apoiam a aplicabilidade e o valor translacional das iPSCs na modelagem das descobertas do GWAS.

Outro exemplo de modelagem de doenças cardiovasculares usando iPSCs é apresentado por Ebert et al. 40. Ebert et al.. estudou um SNP no gene que codifica a aldeidronase 2 enzima, que confere perda de efeitos cardioprotetores e aumenta o risco de doença arterial coronariana e doença cardíaca isquêmica. Cardiomiócitos (CM) diferenciado de iPSCs derivados de uma população do leste asiático genotipada para um SNP ALDH2* comum (MAF = 0,08), demonstraram que CMs portadores do genótipo ALDH2* tinham níveis aumentados de estresse oxidativo e acúmulo de subproduto aldeído 4HNE. O acúmulo desses dois subprodutos resultou em ciclo celular desregulado e sinalização de apoptose, que exacerbou o dano e reduziu a recuperação celular ao desafio isquêmico nos CMs dos portadores de ALDH2*, estabelecendo assim os mecanismos celulares para aumentar a suscetibilidade a doenças para um único SNP.

Finalmente, está bem estabelecido que as diferenças na suscetibilidade e na resposta medicamentosa à hipertensão e a múltiplas doenças poligênicas variam de acordo com o grupo étnico (ou seja, Afro-americano vs.. Europa Ocidental Americana), será importante compreender a utilidade de tais bibliotecas de iPSCs com base na origem étnica. Para enfrentar o desafio da diversidade na genética de doenças usando iPSCs, Chang e outros. relatou a construção de um banco iPSC de populações etnicamente diversas 41. Tomados em conjunto, these studies demonstrate that an iPSC library with defined SNPs and phenotypic data will be a useful resource to validate the effects of GWAS‐identified SNPs and to facilitate mechanistic understanding of human physiological and pathological conditions.

It is increasingly important to understand how specific risk variants functionally contribute to underlying pathogenesis. Compared with single gene mutation found in monogenic diseases, the effects of SNP variants can often be minor or subtle. It is important to utilize isogenic cells to decode the significance of such gene variants. Recent advances in genome‐editing technology (POR EXEMPLO, CRISPR/Cas9 systems) have simplified the ability to target specific genetic loci for functional studies. Gene‐editing methods in iPSC’s has been reviewed in detail elsewhere 42, 43. Soldner et al. demonstrated functional connect of GWAS‐identified risk variants of Parkinson’s disease in neurons derived from human iPSCs 44. They focused on Parkinson’s disease associated risk SNPs, which were located in an α‐synuclein (SNCA) regulatory region based on genome‐wide epigenetic information. By establishing TaqMan SNP genotyping assays for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, they were able to monitor subtle changes in allele‐specific transcription of SNCA between two SNPs located in the SCNA enhancer region. As a follow up approach, they knocked‐out the single allele of the SNPs using the CRISPR/Cas9 system to see how the SNPs affect SNCA expression. They found that allele‐specific expression roughly translated to an increase of total SNCA expression of 1.06 times in neurons and 1.18 times in neural precursors. Além disso, sequence‐dependent binding of the brain‐specific transcription factors EMX2 and NKX6‐1 on this locus was revealed.

As part of the Next Generation Genetic Association Studies (Next Gen) Programa, various fields of researchers are now depositing iPSC resources, generated from individuals representing various conditions as well as healthy controls, with the goal of following up findings from functional genomics with mechanistic investigations. The program is aimed at generating iPSC lines from more than 1,500 individuals some of which are available through a public iPSC bank (http://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/collections/collections.cmsx). Each iPSC line is linked with clinical data (POR EXEMPLO, lipid condition, QT interval and ECG cardiac trait, pulmonary HTN) as well as age, gender and ethnic background. SNP genotyping, expressão genética, and ‐omics analysis data will be available for these lines in the future.

It is critically important that high quality iPSC lines are also paired with high quality genetic and clinical data. This can be facilitated through large collaborations that generate harmonized phenotypes through established criteria for diagnosis and accurate phenotype definition, with an ultimate goal of reducing phenotype variability. The more accurately a phenotype is defined, the higher the likelihood of identifying the culprit gene and genetic variants 45. With such standardized phenotypes, advancement of genetic discoveries and their replication can be made, which can be carried forward to iPSC studies using the tissues of relevance. A study by Akawi et al. shows that the value of deep sequencing information is decreased if it is not coupled with high quality phenotype data from patients 46. An analogy can be made here as we think of the diminished value of iPSC if we do not have an accurately defined clinical phenotype that will be ultimately translated into a cellular phenotype in a dish. Portanto, it is increasingly important for the collaborative genetic consortia to establish procedures for phenotype ascertainment to reap the maximum benefit of iPSC modeling.

iPSCs to Understand Genetic and Phenotypic Variations Beyond GWAS
It has been recently shown that especially rare genetic variants, como defeitos variantes homozigotos resultando em patologias raras, também pode se associar para aumentar o risco de doenças mais comuns. Por exemplo, ter uma mutação patogênica do GBA para a doença de Gaucher (GD) 28 (POR EXEMPLO, N370S, L444P) em um alelo (operadora) geralmente não manifestará todos os sintomas da DG, mas aumenta o risco de doença de Parkinson 47, 48. A razão de chances para a mutação GBA na DP foi maior do que 5, que é incomumente alto em comparação com os loci de risco encontrados no GWAS 49. Por outro lado, há um exemplo em que uma variante genética rara tem um efeito protetor sobre uma doença complexa. SLC30A8 codifica um transportador de ilhotas de zinco (ZnT8) e o ZnT8 é conhecido como um regulador chave da secreção de insulina nas células beta pancreáticas. 50. Além disso, GWAS em grande escala identificou uma variante comum (p.Trp325Arg) no SLC30A8 que resulta em um risco aumentado para o tipo 2 diabetes (DM2) 51-53. Animal studies with this variant, no entanto, showed conflicting results for pathogenesis of T2D. Breakthrough have been made through international collaborative studies, which aimed to find loss‐of‐function variants protective against T2D. Sequencing data from more than 150,000 people identified heterozygous individuals for a nonsense variant (p. Arg 138*) in a Finnish cohort exhibited a 60% reduced risk of type 2 diabetes 54. Recentemente, Chen et al. proposed the reverse approach to find healthy individuals resilient to highly penetrant forms of genetic childhood disorders. They sequenced 874 genes in 589,306 genomes and found 13 adults carried mutations for 8 severe Mendelian conditions with no reported clinical manifestation of the indicated disease 55. This could be a first step toward uncovering protective genetic variants, and further mechanistic studies are anticipated. As discussed above, iPSCs will serve as a powerful tool here as well to dissect molecular mechanisms of the genetic associations, hopefully leading to novel therapeutic discoveries.

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Conclusão
Gathering our knowledge of human disease genetics, we start to realize that each person has a unique set of variants that contribute to susceptibility and protection for a variety to disorders. Phenotypes vary even within rare monogenic diseases based on their mutation types, genetic background and environmental factors. To further advance precision medicine, it will become increasingly important to dissect molecular mechanisms underlying these genotype‐phenotype associations. Human iPSCs provide a unique opportunity to fill these knowledge gaps, and their anticipated increase in utilization by researchers via cellular repositories position them as a crucial reagent for the next generation of disease genomics studies (Fig. 1).

Figura 1
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Stem cell tactic to advance precision medicine. Each person has a unique set of gene variations that affect susceptibility to and protection from both common & rare disorders. Human iPSCs provide a unique opportunity to dissect the roles of genetic variants for pathogenesis. Abbreviation: iPSCs, células-tronco pluripotentes induzidas.

Acknowledgments
This work was supported in part by Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, Practical Research Project for Rare/Intractable Diseases, National Institutes of Health (GM119977 and DK104194), American Heart Association (16GRNT30980002), and the University of Florida Clinical and Translational Science Institute (UL1TR001427). NCF is a recipient of postdoctoral fellowship T32 DK074367.