人胚胎干细胞培养协议

 

人类胚胎干 (他是) 细胞必须以保持健康进行监控和照顾, 未分化的文化.

在最低限度, 文化必须每天通过执行培养基完全改变,以补充失去的养分和保持文化自由的不必要的分化因子被输送. 虽然分化少量是正常的,预计将在干细胞培养, 文化应该通过手动删除常规清理, 要么 “选择” 差异化的领域. 在维持细胞的健康人群的识别和从hES细胞培养物中去除过量的分化是必不可少的技术.

协议

1. 保养: 文化观察显微镜下

从37℃培养箱中取出的hES细胞的一个板和带至显微镜.
观察在低功率的殖民地, 使用2X或5X放大率, 以评估整体文化素质. 请注意以下几点: 一般介质颜色, 不存在任何可见的污染物的, 总菌落大小, 质量和密度, 和任何其他意见.
媒体观察颜色变化.

由于pH的变化,并在培养基中的营养物质与所述的hES细胞的过夜培养后的耗尽, 介质将从红色色调的变化 “稻草” 颜色. 如果媒体上出现紫红色, 碱性pH转变已经发生. 如果媒体出现极其黄色, 媒体已经酸化. 很黄介质可以是在井或污染非常拥挤的集落的结果.

介质应该出现在任何时候都清楚. 虽然细胞碎片的介质中的一定水平是正常的, 它不应该出现混浊. 如果细胞碎片的高水平观察, 文化是不健康和可能被污染.
如果文化不要求维护或传, 他们可以采取的生物安全柜要供给

如果文化包含超过大约 10% 区分菌落, 细胞应该是 “清理” 通过手动除去分化的区域

如果文化含有大量或密集的殖民地, 或MEF饲养层超过 12 日龄, 细胞应传

2. 饲喂hES细胞

在无菌生物安全柜, 除去培养皿的盖子,吸用过的培养基. 不要让移液管的尖端接触以外的板的任何部分不是直接的孔内. 如果有污染的关注, 更改为新, 无菌吸管.
使用无菌玻璃吸管, 添加温热的hES细胞培养基中的适当量向每个孔. 对于在6孔板培养物, 加 2.5 每孔毫升介质.
返回板的孵化器保持在37℃和 5% CO2.

3. 由hES细胞培养除去分化

转变 9 英寸的玻璃巴斯德吸液管进入采摘工具,通过在酒精灯的火焰控制成型技巧. 可以肯定的移液管的尖端被密封以防止污染,并舍入,以避免刮伤培养皿的塑料. 使用UV光源在生物安全柜或采摘机箱使用前消毒采摘工具.
取出分化领域. 分化经常发生在hES细胞集落的仅一部分, 通常沿着边缘或在中心分离点. 如果只有一个集落的部分分化, 只需要删除的区域差异. 分化往往可以升空的板 “黏” 片, 并且是有帮助的第一通过画线通过菌落与所述拾取工具的端部从所述菌落的其余部分分化的细胞中分离.
一旦菌落的片被分离, 沿板轻轻滑过采摘工具卸下不需要的细胞. 注意不要刮掉过多的殖民地之间的MEF饲养层在此过程中.
当所有的分化细胞从板中除去 (和浮在介质), 返回文化的生物安全柜. 吸出介质含有分化的细胞,并用新鲜hES细胞培养基替换.

4. 传代hES细胞

孵化酶
在无菌生物安全柜, 除去6孔培养皿的盖子,吸用过的培养基从传代的孔. 不要让移液管的尖端接触以外的板的任何部分不是直接的孔内.
使用无菌玻璃吸管, 加 1 温热胶原酶IV向每个孔中的溶液,以进行传代.
返回板到37℃的培养箱中 5 分钟.
刮痧和统筹hES细胞

温育用胶原酶细胞后, 观察显微镜下的殖民地. 所述酶应该引起在菌落边缘的细微但可观察到的变化.
在生物安全柜, 轻轻抽吸从每个井酶,并用替换 2.0 毫升hES细胞培养基.
稍尖培养板朝向你,占用 2.0 毫升介质中与所述第一阱 5 毫升玻璃移液管.

垂直握住吸管到板的底部, 轻轻滑过整个油井的吸管尖而缓慢释放介质.
重复刮移液运动 3-4 次,直到所有的殖民地都被从井中取出. 吸管轻轻地避免分手殖民地变成太小件. 当细胞已经从第一井中取出, 离开内容中井并开始刮细胞断下井.

当所有的井传代被擦, 凝聚介质包含在无菌从每个孔中的细胞集落片 15 mL锥形管.
通过增加冲洗刮井 1 hES细胞ml培养基到每个孔中. 收集此漂洗并转移到锥形管中.

吸管将细胞轻轻地在管中,打破了殖民地件至所需的大小.
离心细胞 5 在分钟 200 ×g的.

电镀hES细胞的细胞

虽然胚胎干细胞是在离心机, 准备一个新的6孔MEF饲养板. 与适当的hES细胞信息标记板: 细胞系, 新的通道数, 和通道日期. 吸出从孔MEF培养基,并添加 1.0 毫升PBS中,以每个孔. 轻轻旋转孔周围的缓冲液和吸出PBS洗涤. 加 1.5 毫升hES细胞培养基到每个孔中,并设置在板搁置.

当hES细胞完成离心, 把管回到生物安全柜. 吸出上清液, 小心不要去打扰松散包装的细胞沉淀.
重悬细胞与足够介质颗粒 1 待镀每孔毫升hES细胞培养基. 当分裂成 6 新井, 重悬在粒料 6 毫升介质.

轻轻地,均匀地添加 1 将细胞悬浮液于MEF饲养平板的每个孔制备的溶液.
放置板进入37℃培养箱并小心地将板向前滑动到后, 和侧方整个很好地均匀地分布在细胞.
允许细胞在37℃下附着过夜.

5. 代表性的成果:

未分化的胚胎干细胞是小, 紧密封装, 和通常由较大的, 更分散的细胞.

不同morhopologies可以低倍率下的显微镜下可见. 一个良好的细胞形态含有少量, 细胞排列紧密,在单层增长. 细胞应该有干净, 定义边缘, 几乎没有区别.

不育必须hES细胞工作时,始终保持. 清洁和消毒生物安全柜,所有设备在使用前.

所有试剂必须使用过滤 0.22 使用微米孔径的过滤器之前. 在胚胎干细胞培养使用antiboiotics是没有必要的,应该尽量避免.

 

一个单独的环境,应设置为指定的配货站. 无菌外壳用于站可以是静态外壳 (诸如PCR工作站) 用UV光源, 在层流罩, 或生物安全柜.

分拣站内部的解剖显微镜需要观察菌落该分化区域被除去. 静态外壳或生物安全柜的前玻璃面板必须进行修改,以允许显微镜通过面板延伸的目镜而不损害适当的气流和无菌.

为了保持健康的胚胎干细胞培养物, 细胞必须在最佳时间进行传代, 通常每 4-7 天. 这时的殖民地已经达到它们的最大尺寸,并且可以开始合并. 合并菌落提高分化率的培养. 分流比通常落入之间 1:3 和 1:5, 根据镀菌落数, 膨胀率, 和培养条件.

上镀覆菌落 (分流比过低) 可能会合并过早,需要代他们达到其最大尺寸之前.

是超过一个MEF饲养层上培养 2 周龄必须传代新的MEF将支持未分化的生长和增殖.

由于分化自然发生在hES细胞培养物中, 少量预计. 如果文化不接受适当治疗,可能会出现频繁或过度分化. 细胞必须每天喂, 应避免通道之间的过度生长. 使用新鲜试剂.

所有的媒体, MEF中和试剂应内使用 14 天,以避免未分化的胚胎干细胞生长. 新批次试剂, 如敲除血清替代, FBS和MEF中, 应进行筛选使用前. 记住,不是除去任何分化的细胞之前传代将被转移到新的培养.

也, 尽量使细胞在37℃下尽可能. 最小化细胞度过孵化器之外的时间 (e.g. 在显微镜舞台上或在生物安全柜。) 加热的显微镜载物台可以是非常有益的,如果细胞将培养箱的延长的时间段.

当观察在显微镜下的hES细胞培养物, 第一评估集落的总体质量和尺寸视使用低功率 (2x或5倍) 目的. 如果潜在的分化将细胞以低功率观察, 确认使用较高放大倍数的物镜的分化形态 (10X).

 


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