Makrofaj-Türetilmiş Ekstrasellüler Süksinat Kronik Nöroenflamasyon bastırır için Nöral Kök Hücreler Lisansları

 

Önemli
• Somatik dokulardan ya da doğrudan yeniden programlama ile ilgili NSC'lerde eşit nöroenflamasyon baskılamak
• Hücre dışı süksinat NSC'lerde üzerinde SUCNR1 / GPR91 aktive
• Aktive NSC'lerde PGE2 salgılayan ve süksinat temizlemek, Bu şekilde yeniden programlama türü 1 milletvekilleri
transplantasyon sonrası • Sucnr1 mutant NSC'lerde düşük anti-enflamatuar aktivitesi,
özet
Nöral kök hücresi (MGK) transplantasyon bağışıklık karşılıklarına etki ve CNS enflamasyonu baskılayabilir. Metabolitler, örneğin süksinat olarak, immün hücrelerin fenotip ve işlevini modüle, ancak NSC'lerde da immünoreaktivitesi ve enflamatuar yanıtları kontrol etmek için, örneğin immunometabolites ile aktive edilir ve nasıl belirsizdir. İşte, Biz nakledilen somatik doğrudan neden olduğu NSC'lerde beyin-omurilik sıvısında süksinat seviyelerini düşürerek kronik CNS enflamasyonu iyileştirmeyi göstermektedir, bu şekilde, mononükleer fagosit azalan (MP) infiltrasyonu ve ikinci merkezi sinir sistemi hasarı. Enflamatuar MP'ler süksinat serbest, ki süksinat reseptörünü aktive 1 (SUCNR1)/NSC'lerde üzerinde GPR91, yönlendirildiğinde, prostaglandin E2 salgılar ve sonuç olarak anti-inflamatuar etkilere sahip hücre dışı süksinat temizlemek için. Böylece, Çalışmalarımız süksinat-SUCNR1 somatik eksene doğrudan neden olduğu NSC'lerde için beklenmedik bir rol ortaya, bu tip tarafından yayımlanan enflamatuar metabolik sinyallere kök hücrelerinin tepkisini kontrol eder 1 kronik iltihaplı beyinde MP'ler.

Giriş
Kök hücre biyolojisi gelişmeler CNS hastalıkları olmayan hematopoetik kök hücre ilaçlar ile ortadan kaldırılabileceğini ümit uyandırmış (Martino ve PLUCHINO, 2006). Biz somatik sinir kök hücrelerinin nakli olduğunu ikna edici bir kanıt sağladı (NSC'lerde) iltihaplı CNS hastalıklarının hayvan modellerinin klinikopatolojik özellikler geliştirilmiştir. yaralı MSS hücrelerinin yapısal değişimi Ötesi, çalışmalarımız nakledilen NSC'lerde kompleks kök hücre greft-to-host haberleşme programlarına angaje olduğunu göstermiştir, Genel tropik destek ve uyarlamalı modülasyonu ve doğal bağışıklık tepkilerinin giden (Bacigaluppi ve diğ., 2009, Bacigaluppi ve diğ., 2016, PLUCHINO ve Cossetti, 2013, PLUCHINO ve diğ., 2005, PLUCHINO ve diğ., 2009b). özellikle, MGK nakli yaralanma yerinde enflamasyon yükünü azaltmak (PLUCHINO ve diğ., 2005, PLUCHINO ve diğ., 2009bir), Çeşidi sayısını azaltmak 1 inflammatuvar mononükleer fagositler (milletvekilleri) (Cusimano ve diğ., 2012), ve henüz kötü karakterize mekanizmalar üzerinden yaralı CNS iyileşmesini teşvik.

ancak, Deneysel MGK tedavilerinin klinik için hala kaynakları tarafından sınırlı olan insan NSC'lerde (hNSCs) türetilir (Anderson ve diğ., 2017), allojenik hNSC hatlarının iç bağışıklık (Ramos-Zuniga ve diğ., 2012, Rice ve diğ., 2013), ve sözde “amaçlanan klinik hücre lot” stabilitesi (Anderson ve diğ., 2017, Wright ve ark., 2006). Otolog ve stabil bir şekilde genişletilebilir doğrudan uyarılmış NSC'lerde (iNSCs) Hastaların dermal fibroblastlardan MGK terapiler için geçerli bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır (Lu ve ark., 2013, Meyer ve diğ., 2015, Thier ve diğ., 2012). iNSCs doğrudan yeniden programlama uyarılmış bir pluripotent kök hücre için tarif edilen istenen soylarına pluripotent durumuna ve daha sonra farklılaşma ile zahmetli ilerlemesini önler (IPSC) teknoloji (Meyer ve diğ., 2015, Thier ve diğ., 2012). bu nedenle, somatik hücrelerden kararlı biçimde genleşebilen iNSCs verme alt klinik uygulamalar için otolog beyin kök hücre elde etme en uygun yolu temsil eder (Wörsdörfer ve diğ., 2013). ancak, iltihaplı CNS bozukluklarının tedavisinde, doğrudan yeniden programlanması iNSCs etkinliği henüz test edilmemiştir.

multipl skleroz aşamalı biçimlerinde (MS), kronik CNS enflamasyonu, CNS yerleşik mikroglia ve her ikisi de dahil MP'lerin yaygın aktivasyonu ile sürdürülen makrofajları infiltre monosit türevli (Mallucci ve diğ., 2015). Milletvekilleri gri madde lezyonları bulunan, yozlaşan Neurites ve nöronal hücre gövdeleri yakın (Peterson ve ark., 2001), ve beyaz cevher lezyonlarda, burada aktif mikroglia dış kenar kronik doku hasarı ile bağlantılı olan (Bramow ve diğ., 2010, Prineas ve diğ., 2001). beyaz maddeyi görünen normal alanları da MP birikimi ile karakterizedir, olmasına bakılmaksızın birlikte T-hücresi aktivasyonunun hastalık patolojisi sürücü mikroglial nodüllerin oluşmasına yol açar (Moll et al., 2011). progresif MS kronik MP odaklı inflamasyonun zararlı rolü de hayvan hastalık modellerinde kanıtlar tarafından desteklenmektedir, genel yükü bozulmuş nöronal fonksiyonu ile ilişkilidir burada (Plank ve diğ., 2017), beyin atrofi (Tambalo ve diğ., 2015), ve rejeneratif yanıtları azaltılmış (Jiang ve ark., 2014).

pro-inflamatuar stimuli ile MP'lerin aktivasyonu glikoliz doğru metabolik anahtarı ve düşük oksidatif fosforilasyon neden olur (Oksidatif fosforilizasyonu etkileyen mutasyonlar) (Kelly ve O'Neill, 2015). Son kanıtlar ortaya koymaktadır, Bu metabolik uyumlanma içinde, tip 1 enflamatuar MP'ler süksinat birikir, Önemli patofizyolojik etkileri ile (Tannahill ve diğ., 2013). prolil enzimleri hidroksilazları hücre içi süksinat aktivitesini inhibe (PhDs), böylece hipoksi duyarlı elemanı stabilize (HIF)-1a ve interlökin transkripsiyonunu indükleyici (IL)-1b (Tannahill ve diğ., 2013). ayrıca, sukinat dehidrogenaz süksinat oksidasyonu (SDH) Reaktif oksijen türleri ATP sentezi ile ilgili mitokondri repurposes (ROS) Üretim ek pro-enflamatuvar sinyali (Mills ve ark., 2016). tip 1 enflamatuar MP'ler ayrıca hücre dışı süksinat serbest ve aynı kökenli süksinat reseptörü yukarı regüle 1 (SUCNR1), G-proteinine bağlı reseptör (Ayrıca GPR91 olarak da bilinir), otokrin ve parakrin sensör olarak işlev gören, IL-1β üretimini artırmak için (Littlewood-Evans ve ark., 2016).

Gibi, metabolizma hem makrofaj aktivasyonunu modüle için önemli bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır (Kelly ve O'Neill, 2015) ve mikroglia (Orihuela ve diğ., 2016), ve süksinat bağlantılı yollar akut ve kronik iltihaplı hastalıklar için önemli bir bağışıklık modülatör işlevleri (Ryu ve diğ., 2003, Tannahill ve diğ., 2015).

NSC'lerde kurulan immün modülatör özellikleri göz önüne alındığında (PLUCHINO ve Cossetti, 2013), Biz NSC'lerde ikinci merkezi sinir sistemi hasarının azaltılması doğru MP metabolizmasını modüle kronik nöro kendi terapötik etkilerini ileriye sürülmüştür.

Bu işte, olanlar tip metabolik değişiklikleri ortadan kaldırmak için somatik ve doğrudan uyarılmış NSC'lerde kapasitesi destekleyen moleküler mekanizmaları araştırılmıştır 1 in vivo ve in vitro olarak hem enflamatuar MP'ler. Biz nakledilen iNSCs ve NSC'lerde deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerde kronik nöroenflamasyon iyileştirilmesinde fonksiyonel olarak eşdeğer olduğunu göstermektedir (EAE). Nakledilen iNSCs / NSC'lerde bir anti-iltihabik bir fenotipe doğru makrofajları infiltre edilen monosit-MSS yerleşik mikroglia ve aktivasyonu profilinde geçiş, aynı zamanda beyin omurilik sıvısında immunometabolite süksinat düzeylerini düşürmek (BOS). iNSCs / NSC'lerde da türüne göre serbest hücre dışı süksinat azaltmak 1 enflamatuar MP'ler in vitro Oksidatif fosforilizasyonu etkileyen mutasyonlar doğru metabolizmalarını yeniden programlamak için. Mekanik olarak, Biz türü tarafından salgılanan bu süksinat göstermek 1 MP'ler iNSCs / NSC'lerde bir sinyal kaskadı alt SUCNR1 içinde ortaya çıkarır, burada anti-enflamatuar aktivitesi sağlar. iNSCs / NSC'lerde Bu süksinat lisanslı anti-enflamatuar fonksiyonu prostaglandin salgılanması aracılık (PG) E2, aynı zamanda hücre dışı süksinat ölçüde temizlemesi. NSC'lerde Sucnr1 fonksiyon kaybı önemli EAE nakli sonrası in vitro ve in vivo anti-enflamatuar etkinliklerini azalttığı yol açar.

Çalışmamız NSC'lerde tip aktivasyonunu inhibe etmek üzere enflamatuar metabolik sinyallere yanıt netleştiren bir süksinat-SUCNR1 ekseni ortaya çıkarır 1 Kronik nöro içinde MP'ler.

Sonuçlar
MGK Nakli Kronik Nöroenflamasyon iyileştiren ve Beyin Omurilik Sıvısı Immunometabolite süksinat Azaltma ile birleştiğinde mı
Biz ilk intraserebroventriküler etkileri değerlendirildi (icv) Hastalığın zirvesinde nakli (PD) PBS ile tedavi edilmiş kontrol farelerine EAE için kronik EAE MOG35-55 kaynaklı ve kaynaklı göre olan farelerde iNSCs veya NSC'lerde. Transplantasyon öncesinde, iNSCs ve NSC'lerde genişletildi, özelliği (Şekil S1), ve Farnelize ile etiketlenmiş (f)GFP, in vitro. at 30 gün post-transplantasyon (geri alınabilir), iNSC ve MGK nakli atlattı, dağıtılmış, ve EAE beyin ve omuriliğin içinde entegre (Şekil S2). Alınan fGFP + hücrelerin yalnızca bir azınlık (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSC'lerde: 1.7% ± 0.1%) çoğalan edildi (Şekil 1A) veya nöronal ifade eden (Şekil 1B), astroglial (Şekil 1C), ya oligodendrogliyal (Şekil 1D) soy belirteçleri (Şekil S2). Çoğunluk (-75%) nakli için kalan iNSCs yerine test nöral soy belirteçleri herhangi ifade ve F4 / 80 + endojen MP'lerin yakın meningeal perivasküler niş benzeri alanların etrafında lokalize gereken bulundu (Şekil 1E), somatik MGK greft gözlenen (Cusimano ve diğ., 2012, PLUCHINO ve diğ., 2003). iNSCs nakli önemli ve uzun ömürlü uyarılmış (kadar 90 geri alınabilir) EAE puanları iyileştirilmesi, hangi başladı 15 için 20 dpt ileriye (Şekil 1F ve S2). Fonksiyonel iyileşme ayrıca bilgisayar destekli otomatik yürüme analizi ile doğrulandı (Şekil S2). tüm, icv-Nakledilen iNSCs güvenli ve davranışsal ve patolojik iyileşme sağlamıştır.

Daha sonra, ex vivo iNSC de akış sitometrisi yoluyla merkezi sinir sistemi enflamatuar infiltratlar bileşimini analiz- ve PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE farelere göre NSC nakledilmiş. iNSCs veya NSC'lerde nakli MSS nüfuz eden T hücrelerinin fraksiyonu üzerinde bir etkiye sahip, B hücreleri, ve toplam MP'ler, yanı sıra, CD3 + / CD4 + T hücre alt olmasıyla (Th1 dahil olmak üzere, Th2, Treg, ThGM-CSF, ve Th17 alt kümeleri) en 30 geri alınabilir (Şekil S3). Yerine, MGK- veya EAE farenin CD80 + tip ~ 1.5 kat azalma ile CX3CR1 + hücrelerinin aktivasyonu profilinde önemli bir anahtarı göstermektedir NSC nakledilmiş 1 enflamatuar mikroglia ve MRC1 + anti-enflamatuar mikroglia paralel olarak artmasıdır (Şekil 1G). aynı şekilde, CNS-infiltratif (monosit türevli) iNSC gelen CCR2 + makrofajlar- veya NSC nakledilmiş EAE farenin CD80 + tip ~1.3 kat azalma ile önemli fenotip anahtarı uygulandı 1 enflamatuar makrofajlar ve MRC1 + anti-enflamatuar makrofajların paralel ~1.8 kat artış (Şekil 1H). Bu etki Çeşidi ifade önemli bir azalma eşlik etti 1 enflamatuar MP işaretleyici uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS) in vivo olarak F4 / 80 + MPler tarafından (1i ve S3 Şekil).

Daha sonra ana yanlısı ekspresyon seviyelerini analiz- Bütün CNS'de ve anti-inflamatuar genlerin. MGK- ve interlökin-1 betanın önemli ölçüde düşük düzeyde EAE fareler NSC nakledilmiş sergilemiştir (IL1b) Mannoz reseptörü C tipi beyin ve omurilik ve artan seviyeleri 1 (Mrc1) omurilikte, hem de 10 geri alınabilir (Şekil 1J).

Kan-beyin bariyeri anlamlı farklar bulundu (BBB) en geçirgenlik 30 DPT zaman iNSC- / PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE fareleri ile NSC nakledilmiş karşılaştırılması (Şekil S3).

En sonunda, MGK- ve EAE farelere birikmiş önemli ölçüde azalır aksonal kayıp MGK-Nakledilen (Şekil 1K) ve demiyelinizasyon (Şekil 1 L) omurilikte.

Milletvekillerinin fenotipi ve fonksiyonlarının düzenlenmesinde metabolizmanın kurulan önemi göz önüne alındığında, Biz MGK nakilleri nöroinflamatuvar metabolik mikroçevreyi etkileyebileceğini tartışmışlardır. Bu amaçla, Kitle spektrometresi bağlanmış sıvı kromatografisi ile, polar metabolitlerin bir hedeflenmemiş metabolik profil gerçekleştirilen (LC-MS) eşleşen CSF ve plazma örneklerinin (Tablo S1). PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE fareler çeşitli CSF önemli bir artış gösterdi (ancak plazma) metabolitleri, bunlar arasında, sadece zirve -süksinat 45 gün sonra aşılama (dpi) (tekabül 30 geri alınabilir; Şekil 1 M). cerrahiye tabi EAE fareler de sadece CSF de önemli bir artış gösterdi süksinat 45 dpi (sağlıklı farelere göre), ki CSF PBS ile tedavi edilmiş kontrol farelerinde EAE süksinat düzeyde farklı değildi (Şekil S3).

iNSC / NSC nakledilmiş ve kontrol EAE fareler PBS ile tedavi edilmiş arasında plazma metaboliti düzeylerinde anlamlı bir değişiklik tespit etmedi Oysa (Tablo S1), Biz iNSCs veya NSC'lerde nakli BOS süksinat belirgin bir düşüş de yol açtığını tespit 30 geri alınabilir (Şekil 1 M; Tablo S1).

Daha ileri, Biz EAE fareler, fare fibroblast ICV karşı CSF süksinat arasında önemli bir fark, PBS ile tedavi edilen EAE fareler karşılaştırılırken bulunan (MFS) kontrol hücreleri olarak (Şekil S3).

Böylece, iNSCs ve NSC'lerde direkt olarak MP'lerin belirli bir fenotip anahtarı neden EAE CNS enjekte, Kronik nöro sadece CSF'de immunometabolite süksinat azaltılması ve iyileştirilmesi ilişkili olan.

NSC'lerde Süksinat Seviyeleri azaltın ve Türü Metabolizma Reprogram 1 Enflamatuar Mφ İn Vitro
Sonra iNSCs / NSC'lerde türüne anti-enflamatuar faaliyet göstermektedirler içinden moleküler mekanizmaları araştırılmıştır 1 milletvekilleri, MP'lerin ve iNSCs / NSC'lerde arasındaki etkileşimleri tekrarlar bir in vitro bir sistem kullanılarak. Naif kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (Mφ) Bir türü içine polarize edilmiş 1 LPS ile iltihabik bir fenotip (MφLPS), tarif edildiği gibi (Tannahill ve diğ., 2013). MφLPS sonra iNSCs ile birlikte kültürlenmiştir (MφLPS-iNSCs) veya NSC'lerde (MφLPS-NSC'lerde) Bir trans-kuyu sisteminde o hücre-hücre temasları önler (Şekil 2A). Polarize olmamış Mφ kontroller olarak kullanıldı.

Mikrodizi gen ekspresyon profili ile MφLPS önemli transkripsiyonel değişiklikler gösterdi 7,401 genler etkilenen (Mφ karşı; Ayarlanan p < 0.1; Şekil 2B; Tablo S2) ve 51 diferansiyel olarak eksprese edilen genler MφLPS-iNSCs veya MφLPS-NSC'lerde (MφLPS karşı; Ayarlanan p < 0.1; Şekiller 2B ve 2C; Tablo S2). Bu genler ikinci resim lökosit aktivasyonu pozitif düzenleme ile ilgili biyolojik proseslerde zenginleştirilmiş (GİTMEK: 0002696), miyeloid lökosit farklılaşma (GİTMEK: 0002761), ve bağışıklık sistemi süreçleri (GİTMEK: 0002376). Seçilen Mφ pro-inflamatuar genlerin bağımsız QRT-PCR, doğrulama Il12b ekspresyon düzeylerinin anlamlı şekilde azalmasına teyit, IL15, Il15ra, ve CD69, ayrıca klasik inflamatuar genlerin NOS2 olarak, tümör nekroz faktörü (TNF), ve IL1b MφLPS-iNSCs ve MφLPS-NSC'lerde (MφLPS karşı; Şekil 2B). Bu etki, bir anti-inflamatuar Mφ fenotipi ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerinin birlikte düzenlenmesi ile birleştirildi, Bu tür uronyl-2-sulfotransferase olarak (paragraf) ve kemik iliği stromal hücre antijeni 1 (Bst1) (El-Shabany ve diğ., 2016, Martinez ve diğ., 2015), yanı Arginazın olarak 1 (Arg1) ve Mrc1 (MφLPS karşı; Şekil 2E). iNSCs / NSC'lerde lipopolisakarid ile birlikte kültürlenmiştir zaman (LPS)-önce olarak aktifleştirilmiş fare BV2 mikroglial hücreler, pro-inflamatuar genlerin NOS2 ve IL1b ekspresyon düzeylerinin önemli bir azalma da gözlemlenmiştir (Şekil 2F).

Fonksiyonel metabolik durumları ile gen ekspresyon profillerini bağlamak için, Biz bazal oksijen tüketimi oranını değerlendirildi (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) bunların trikarboksilik asit çıktılan olarak MφLPS arasında (TCA) döngüsü ve glikolitik faaliyetler, sırasıyla. Biz OCR önemli bir azalma ve MφLPS içinde ECAR önemli bir artış bulundu (Mφs karşı). Yerine, MφLPS-iNSCs ve MφLPS-NSC'lerde hem OCR ve ECAR değerlerinin önemli bir onarımdan geçmiş (MφLPS karşı; 2G ve 2H Şekil), bir anti-enflamatuar fenotipe Mφ anahtarlama gözlenen (O'Neill ve Pearce, 2016).

Bu anti-enflamatuar etkileri ve metabolik belirleyicilerini açıklamak için bir çaba olarak, Biz MφLPS hücre dışı ve hücre içi küçük moleküllü metaboliti içeriğinin hedeflenmemiş LC-MS analizi yapıldı. Beklenildiği gibi, LPS uyarımı derinden Mφ hücre dışı ve hücre içi metabolik ortam değiştirildi (MφLPS) (Mφ karşı; Tablo S3). ko-kültürlerde, MφLPS-iNSCs ve MφLPS-NSC'lerde hem hücre dışı glutamat anlamlı bir azalma gösterdi, GABA, ve süksinat (MφLPS karşı; Şekil 2I; Tablo S3). ayrıca, MφLPS-iNSCs ve MφLPS-NSC'lerde da hücre içi süksinat ve itakonatının, önemli bir azalma görülür (MφLPS karşı; Şekil 2J; Tablo S3).

Süksinat seviyelerinin azaltılması ile tutarlı, Biz MφLPS-iNSCs ve MφLPS-NSC'lerde anlamlı HIF-1 seviyelerini azalma arzeden bulundu, yukarı yönde bir protein piruvat kinaz isozyme M2 (Pkm2) (Palsson-McDermott ve diğ., 2015; Şekil 2K), hem de İL-1 p itibarıyla (MφLPS karşı; Şekil 2L).

tamamen, Bu in vitro veriler iNSCs / NSC'lerde tip ko-kültürlerde hem hücre içi ve hücre dışı süksinat birikimini azaltmak kanıt 1 enflamatuar MP'ler, Bir Oksidatif fosforilizasyonu etkileyen mutasyonlar, anti-iltihabik bir fenotipe doğru yeniden programlanarak.

Fare ve İnsan NSC'lerde SUCNR1 / GPR91 aracılığıyla Süksinat Sinyalleri
immunometabolic sinyali olarak süksinat önemi göz önüne alındığında, Biz süksinat türü tarafından yayımlanan araştırdık 1 pro-inflamatuar MP'ler yerinde çevreleyen hücreler aktivitesini düzenleyebildiği, nakledilen iNSCs / NSC'lerde de dahil olmak üzere.

Biz yakınlık tespit Nakledilen iNSCs / NSC'lerde perivasküler alanlarda meningeal için bulundu (Şekil 3A ve 3B, ) ve F4 / 80 + MP'ler (Şekil 3C) CNS'de vivo SUCNR1 ifade. SUCNR1 da in vitro olarak, her iki iNSCs ve NSC'lerde protein düzeyinde ifade edildi, ancak MFS'de (Şekil 3D).

ayrıca iNSCs / NSC'lerde SUCNR1 fonksiyonel süksinat ile aktive edilmiş olup olmadığını değerlendirmek için, Biz, in vitro olarak alt akış sinyalleme kaskadını incelenmiştir. süksinat maruz kaldığında (Şekil 3E; Rubic ve diğ., 2008), 34.2% (7.4 ±%) iNSCs ve 31.7% (6.5 ±%) NSC'lerde Hücre içi kalsiyum depolarının serbest bırakılmasını gösterdi (S4 ve 3F Şekil). Bu yanıt, fosfo-p38 mitojen ile aktive edilmiş protein kinazın önemli upregülasyonu izledi (Şekil 3G), Bunu aktivasyonuna işaret. Biz insan fetal NSC'lerde da SUCNR1 ve SUCNR1 ifadesini doğruladı (hNSCs) ve insan iNSCs (hiNSCs) (3H ve 3I Şekil). Fare iNSCs olduğu gibi, süksinat bağımlı p38 sinyal hiNSCs uyarılmış edildi, ancak hiNSCs seçici SUCNR1 inhibitörü 4c ile önceden tedavi edilen (Şekil 3J).

Böylece, fare ve insan iNSCs ve NSC'lerde işlevsel SUCNR1 ifade, ki immunometabolite süksinat ile stimülasyon aşağı bir sinyal yolu indükleyen.

SUCNR1 Uyarım NSC'lerde tarafından Prostaglandin E2 salgısını başlatır
NSC'lerde sinyalizasyon SUCNR1 fonksiyonel sonuçlarını netleştirmek için, Biz Sucnr1 taşımayan farelerde yapılan NSCs oluşturulan (Sucnr1 - / - NSC'lerde) (Rubic ve diğ., 2008; Şekil S4). NSCs kontrol ile karşılaştırıldığında, Sucnr1 - / - NSC'lerde in vitro koşullarında büyüme eğrileri ve farklılaşma benzer gösterdi (Şekil S4). ancak, Farklı zaman noktalarında ve konsantrasyonlarda süksinat maruz kaldığında, Sucnr1 - / - NSC'lerde fosfo-p38'in bir yukarı regülasyon sergilemiştir (Şekil S4). glutamat veya ATP ile uyarılması + - / - NSC'lerde kontrol NSC'lerde edilene benzer bir kalsiyum tepki Sucnr1 indüklenen thapsigargin (Şekil S4). Aksine, süksinat tedavi Hücreler arası depolardan kalsiyum serbest bırakılmasını temin yoktu (Şekil S4), - / - NSCs olan Sucnr1 sinyallemesinin kusurlu SUCNR1 belirtilmedikçe.

Daha sonra kontrol NSC'lerde ve Sucnr1 sukinat ile tedaviyi takiben mikrodizisi profil bir gen ekspresyonunu gerçekleştirilen - / - NSC'lerde (Tablo S4). O prostaglandin-endoperoksit sentaz bulundu 2 (Ptgs2), indüklenebilir PTGS2 kodlayan PG biyosentezindeki anahtar enzim, süksinat ile uyarılmış kontrol NSC'lerde en yukarı regüle geni (log 2 kat değişim 1.05), fakat sukinat uyarılan Sucnr1 olarak - / - NSC'lerde (log 2 kat değişim -0.43; Şekil 4A). Biz QRT-PCR ile Ptgs2 üzerinde bu sonuçları valide, ifade seviyesinin önemli ölçüde yukarı-regüle edildiğini teyit (2.1- 2.7-kat değişime) süksinat uyarılan iNSCs ve NSC'lerde, bunlar süksinat ile muamele Sucnr1 değildi, oysa - / - NSC'lerde (Şekil 4B,).

mezenkimal kök hücrelerin bağışıklık etkilerinin regülatör olarak PGE2 rolünü göz önüne alındığında (MSC'ler) (Vasandan ve diğ., 2016, Yañez ve diğ., 2010), Biz iNSCs gelen doku kültürü ortamında birikimini test, NSC'lerde, ve Sucnr1 - / - süksinat ile uyarma sonrasında NSC'lerde. iNSCs ve NSC'lerde, ancak Sucnr1 - / - NSC'lerde, anlamlı gösterdi (>2.5-kat) olduğu kadar erken PGE2 onların bazal salımının artması 30 dk süksinat sonra. Bu süksinat kaynaklı etki tersinmez PTGS2 engelleyici SC-58125 ile ön tedavisi ile durdurulmuştur (Şekil 4C). Fare iNSCs olduğu gibi, hiNSCs maruz kalma, doku kültür ortamı içinde PGE2 konsantrasyonları belirgin bir artış ortaya çıkardı Süksinata, SC-58125 veya 4c, serbest bırakma önleyen bir yeniden tedavi öncesi oysa (Şekil 4D).

ayrıca bu bulgular alaka uzatmak için NSC'lerde ve MφLPS arası kültürleri co, Biz doku kültürü ortamında PGE2 düzeyleri analiz. Biz MφLPS-NSC'lerde MφLPS kıyasla PGE2 yüksek seviyede birikmiş bulundu, SC-58125 önemli ölçüde azalır PGE2 seviyeleri ile birlikte kültürlenmiş NSC'lerde ön işlem ise (Şekil 4E,). NSC'lerde SC-58125 ön işlem de MφLPS içinde IL1b ekspresyonunun önemli bir artış ile birleştirildi (Şekil 4F) ve OCR bir azalma ile bir pro-enflamatuar fenotipin göstergesi değerlerinin (Şekil 4G). ancak, Biz NSC'lerde ön işlemden SC-58125 ile Sucnr1 göre MφLPS bazı kalıntı, anti-inflamatuar etkilere sahip olduğunu fark - / - NSC'lerde (Şekil 4F). Aksine, NSC'lerde fonksiyon Sucnr1 kayıp tamamen MφLPS üzerindeki anti-enflamatuar etkileri ortadan kaldırmıştır (Şekil 4F ve 4G). Ayrıca NSC'lerde gözlenen PGE2-bağımlı antienflamatuvar yeteneği korunmuş ve insan NSC'lerde için ilgili olduğunu gösteriyor.

Gibi, hiNSCs ko-kültürlerde MφLPS içinde IL1b ekspresyonunun önemli bir azalmaya neden (Şekil 4H), OCR değerleri giderilmesi ile birlikte, hangi (Şekil 4I) Doku kültür ortamı ve artan PGE2 seviyeleri (Şekil 4J). Bu etkiler tamamen selektif SUCNR1 inhibitörü 4c ile hiNSCs ön muamele ile bastırılmıştır (Şekiller 4H-4J).

Böylece, SUCNR1 fare ve insan NSC'lerde sinyal yolu aktivasyon tipine anti-inflamatuar etkilere yol açan PGE2 salınmasını tetikler 1 milletvekilleri.

ancak, PTGS2 veya SUCNR1 tarafından ek SUCNR1 bağımlı-PGE2 bağımsız mekanizmalar NSC'lerde anti-enflamatuar etkiler de önemli bir rol oynaması olasıdır tahmin hedefleme inhibisyon deneyleri.

SUCNR1 Uyarım NSC'lerde tarafından süksinat Alımı tetikler
süksinat uyarılan NSC'lerde gen ekspresyon dizileri ortaya çıkarmıştır, Ptgs2 yanında, NACT / Slc13a5 vahşi tip en yukarı regüle genler arasında olduğu (WT) NSC'lerde (log 2 kat değişim = 0.49), ancak Sucnr1 içinde - / - NSC'lerde (log 2 kat değişim = -0.12). SLC13A5 süksinat taşıma ile ilgili olduğu bilinen bir dikarboksilat ko-transporter olduğu (Srisawang ve diğ., 2007). Verilen süksinat tutarlı tükenmesi iNSC CSF hem de in vivo bulunan- veya EAE fareler NSC nakledilmiş ve MφLPS ile ko-kültürlerde vitro, Biz iNSCs / NSC'lerde süksinat temizlemek için SLC13A5 aktive olacağı varsayımında.

Biz bulduğu SLC13A5 ifadesi, hem de yüksek afinite dikarboksilat ko-transporter SLC13A3 itibarıyla, önemli ölçüde iNSCs ve NSC'lerde artmıştır, ancak Sucnr1 içinde - / - NSC'lerde, süksinat stimülasyon üzerine (Şekil 5A,). benzer şekilde, süksinat maruz hiNSCs Bu in vitro SLC13 eş taşıyıcıların her iki protein ekspresyon seviyelerini yukarı regüle (Şekil 5B,).

Bir sonraki iNSCs ve NSC'lerde süksinat alışı ölçülmesiyle bu ko-taşıyıcıların rolü araştırılmıştır. Biz iNSCs ve NSC'lerde hem anlamlı birikmiş bulundu [14C]-süksinat (Şekil 5C) hücre dışı miktarının azaltılması [14C]-Doku kültür ortamı içinde süksinat (Şekil 5D). Sucnr1 - / - NSC'lerde ne birikmiş [14C]-hücre suksınata ne de hücre dışından tüketmek vermedi (Şekiller 5C ve 5D). ilginç biçimde, Sucnr1 - / - NSC'lerde, Biz MφLPS içinde IL1b ifadesi üzerinde hiçbir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir hangi (Şekil 4F), MφLPS ile ko-kültürlerde hücre dışı süksinat düzeylerini düşürmek için başarısız (Şekil 5E). Çeşidi fenotipinin modüle süksinat tükenmesi öneminin kanıtı olarak 1 pro-inflamatuar MP'ler, Biz aktif rekombinant ile tedavinin göstermektedir (r)SDH kompleks alt-birim A belirgin MφLPS içinde IL1b ekspresyonunu azaltmak mümkün olduğu (Şekil S5).

Böylece, NSC'lerde SUCNR1 sinyal immunometabolite süksinat alımını ister, böylece tip otokrin ve parakrin aktivasyonu sürdürülmesi mevcut hücre dışı birikintisini tüketme 1 milletvekilleri.

Sucnr1 Kaybı-of-Fonksiyonu NSC'lerde Nakli In Vivo Kronik Nöroenflamasyon düzeltmek için Engelli yeteneği gösterir
in vivo suksınata MGK greft tepkiye aracılık edilmesinde süksinat-SUCNR1 ekseni rolünü teyit etmek üzere, Kronik EAE'de farelerde NSC'lerde - / - biz Sucnr1 icv nakli etkileri değerlendirildi.

at 30 geri alınabilir, Sucnr1 - / - NSC'lerde atlattı, dağıtılmış, ve anlamlı farklar ile EAE beyin ve omurilikte entegre NSCs kontrol ile karşılaştırıldığında (Şekil S6). ancak, - / - Sucnr1 nakli NSC'lerde PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE farelere göre EAE davranışsal bozuklukların, sadece hafif bir iyileşme indüklenen (EAE puanı-Sucnr1 - / - NSC'lerde: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), burada önemli ölçüde daha az belirgindi (50% etkinin) bu EAE farelerde gözlenen daha kontrol NSC'lerde transplante (EAE puanı-NSC'lerde: 2.1 ± 0.3; Şekil 6A,).

- / - NSC'lerde tip oranlarını kaydırmaya başarısız MSS enflamatuar infiltratlar bileşimin ex vivo akış sitometri bazlı analiz ile EAE farelerde transplantasyon Sucnr1 gösterdi 1 enflamatuar ve anti-enflamatuar MP'ler dahil CX3CR1 + mikroglia ve CCR2 + monosit türevli kontrol NSC'lerde etkileri ile makrofajlar-kontrast infiltre (Şekiller 6B ve 6C,). / - - MGK greftler Otopsi doku patolojisi daha da Sucnr1 azalan doku koruyucu etkileri doğruladı (Şekiller 6D ve 6E).

Daha sonra NSC nakledilmiş ve PBS ile tedavi edilmiş kontrol farelerinden alınan EAE eşleşen CSF ve plazma örneklerindeki PGE2 seviyeleri ve süksinat incelenmiştir. / - - NSC'lerde ve kontrol NSC'lerde BOS'ta PGE2 seviyelerinde önemli değişikliklere neden başarısız İkimiz de Sucnr1 bulundu. Plazma PGE2 anlamlı EAE farelerde sadece artmış (sağlıklı kontrollere karşı), gözlenen herhangi bir tedavi etkisi ile (Şekil 6F). Önemli, Kontrol NSC'lerde nakli düşük BOS süksinat, oysa (HC: 5.524 x 107 A.Ü. ± 0.19; PBS: 9.35 x 107 A.Ü. ± 0.14; NSC'lerde: 5.64 x 107 A.Ü. ± 0.44), Sucnr1 - / - MGK greftler hiçbir etki göstermedi (Sucnr1 - / - NSC'lerde: 10.40 x 107 A.Ü. ± 2.59; Şekil 6G).

Bu veriler in vivo olarak MGK nakli anti-enflamatuar ve nöro-koruyucu etkiler düzenlenmesinde fonksiyonel SUCNR1 sinyal yolunun gereksinimi teyit ve NSC'lerde bir etki baskın anti-enflamatuar bir mekanizma olarak süksinat atma öneminin altını.

Tartışma
MS progresif formlarını içerir kronik nöroenflamatuar durumların patofizyolojisinde çekirdek sürücüleri hedef hücre ve moleküler yaklaşımların geliştirilmesi için karşılanmamış bir klinik bir ihtiyaç vardır (Volpe ve diğ., 2016). Prensip olarak, kök hücreler, küçük moleküller ve biyolojik bu şekilde farklı bir terapötik potansiyele sahip olan ve klasik rejeneratif tıp arena ötesine uzanır. Parça ilaç ve yarı cihazı, kök hücreler olarak biyolojik hastalığı modifiye ajanları işe yarayabilir (TPA'lar) Bu anlamda çeşitli sinyaller, Vücutta belirli bölgelerine göç, kararlar girdileri entegre, ve belirli bir doku çevresinde bağlamında kompleks cevap hareketini yürütmek (Fischbach'daki ve diğ., 2013). Bütün bu nitelikler çok hastalık sürecine tedavi koşulmuş olabilir, progresif MS meydana kalıcı MP odaklı enflamasyon ve doku dejenerasyonu dahil olmak üzere.

İşte, Biz erişilebilir kullanılan, otolog, ve stabil bir şekilde genişletilebilir iNSCs (Thier ve diğ., 2012), ve somatik NSC'lerde, Kronik nöro bir fare modelinde, beyin kök hücre transplantasyonu etkilerini araştırmak, ki progresif MS gözlemlenen iltihabik kaskad taklit.

Biz EAE farelerin BOS dolaşıma iNSCs nakli somatik NSC'lerde transplante daha önce farelerde gözlenen eşdeğer sonuçlar teşvik ettiği bulundu (PLUCHINO ve diğ., 2003). Nakledilen iNSCs veya NSC'lerde önemli klinik iyileşme indüklenen, ayrıca düşük akson ve miyelin hasarı gibi, BBB geçirgenliği anlamlı azalma at ile 30 geri alınabilir. Daha ileri çalışmalar BBB geçirgenlik ya da merkezi sinir sistemine enflamatuar monositlerin değişiklikleri hemen iNSCs / NSC'lerde nakli takiben ortaya çıkar olup olmadığını tespit yardımcı olur. Bu tür bir etki, iltihaplı hücreler tarafından CNS infiltrasyonu prevelasının hastalıklarının ana klinik sonuçlar değişme olasılığı olsun, Böyle EAE / MS, tahmin etmek zordur.

Yerine, Biz transplantasyon eden paradigma CD80 + tipi bir azalma ile CX3CR1 + mikroglial hücreler ve CCR2 + monosit türevi, süzücü makrofajlann, hem aktivasyon profilinde belirli bir anahtar ile ilişkili olduğu bulunmuştur 1 enflamatuar MP'ler ve MRC1 + anti-enflamatuar MP'lerin paralel olarak artmasıdır. Nakledilen iNSCs / NSC'lerde dağıtılmış ve EAE farelerin MSS atlattı, tercihli endojen milletvekillerine yan yana olan meningeal perivasküler alanların düzeyinde biriken ederken. tamamen, Bu bulgular aşılanmış kök hücreler ve iltihaplı MP'lerin intersellüler bağlama bazı henüz bilinmeyen mekanizmalarının varlığını ima. in vivo olarak bu iNSC / MGK-MP iletişimi sadece perivasküler nişler içinde veya ayrıca koroid pleksusu bulunur beynin diğer gelişmekte olan bağışıklık sensör benzeri yapıların düzeyinde gerçekleşir olsun ele alınması kalır (Ge ve diğerleri., 2017).

Daha sonra, kronik nöro sırasında MP'ler üzerinde NSC'lerde yararlı etkileri tahrik altta yatan immünolojik mekanizmaları araştırılmıştır. eşleşen CSF ve plazma örneklerinin hedeflenmemiş küçük molekül analizi EAE farelerin CSF derin metabolik değişiklikler ortaya, erken ve hastalığın gecikmeli fazları arasındaki farklarla.

Karnitin, lösin + izolösin, sitrülindir, allantoin, ornitin, ve ürik asit, tüm önemli ölçüde hastalık zirvesinde PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE farelerinde artmıştır. Bulgularımız lösin gösteren yayınlanmış kanıtlarla tutarlıdır, ayrıca ürik asit ve yan ürün alantoin gibi, Tüm MS deneklerin CSF artmıştır (Amorini ve diğ., 2009, Hooper ve diğ., 1998, Monako ve diğ., 1979). yüksek BOS karnitin MS'de bildirilmemiştir Oysa, önemli artışlar CNS'nin MS olmayan enflamatuar durumlar tarif edilmiştir, ensefalit olarak (Wikoff ve diğ., 2008) ve menenjit (Shinawi ve diğ., 1998).

tersine, Sadece süksinat geciktirilmiş gösterdi (diğer bir deyişle, 45 dpi) PBS ile tedavi edilmiş kontrol EAE farelerinin CSF artış. Süksinat metabolik stres ve enflamatuar aktivitenin in vivo belirteç değerli hale gelmektedir (Littlewood-Evans ve ark., 2016, Mills ve O'Neill, 2014). Önemli, Biz süksinat anlamlı iNSC- / MGK-Nakledilen farelerin CSF azaldığını bulduk. iNSC veya MGK transplantasyonu izleyen BOS süksinat azaltılması ilgi ve kronik nöro müdahale önemli bir role sahip olabilir.

türünden serbest süksinat 1 enflamatuar MP'ler spesifik G-proteinine bağlı reseptör SUCNR1 ile birlikte çalışan bir ana iltihabik sinyalidir. SUCNR1 çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda metabolik stres erken detektörü gibi davranır, Renin-kaynaklı, hipertansiyon da dahil olmak üzere, iskemi / reperfüzyon zedelenmesi, iltihap, platelet agregasyon, ve retinal anjiyogenez (Castro Fonseca ve ark., 2016, Gilissen ve diğ., 2016). Özellikle, Biz SUCNR1 ifadesi in vivo olarak nakledilen NSC'lerde terapötik etkileri için gerekli olduğu anlaşılmıştır.

kemirgen ve insan iNSCs üzerinde SUCNR1 aktivasyonunu Süksinat aracılı ve NSC'lerde kalsiyum sinyal ve mitojen ile aktive edilmiş protein kinazın aktive (Nafk) in vitro fosforilasyon, Bu şekilde NSC'lerde uyumlu bir anti-inflamatuar bir fenotip elde edilmesini ortaya çıkarmak. Bir taraftan, SUCNR1 PGE2 salgılanmasını aktive, köklü bir pleiotropik bağışıklık modülatör, kimin fonksiyonu iltihaplı mikroçevresinin içinde birden fazla hücre tiplerini hedefleyen, milletvekillerinin de bulunduğu (Kota ve diğ., 2017, Vasandan ve diğ., 2016). Diğer yandan, iNSCs ve NSC'lerde sinyalizasyon süksinat-SUCNR1 eş taşıyıcıların SLC13 ailesinin iki üyesinin bu hususta açtı (diğer bir deyişle, SLC13A3 ve SLC13A5) hücre dışı süksinat ve alımı.

İn vivo, Biz NSC'lerde hücre dışı yerel süksinat etkili temizleme BOS dolaşımı sayesinde EAE farelere enjekte göstermek, bu baskın olduğu, PGE2 salgısının karşılaştırıldığında. Nakledilen NSC'lerde SUCNR1 bağımlı sinyal kaybı anti-inflamatuar ve nöroprotektif etkileri anlamlı azalmaya neden olmuştur, Sucnr1 ise - / - MGK greft sağkalım fark göstermemiştir, dağıtım, Kontrol NSC'lerde versus ve farklılaşma.

Daha sonra hücre dışı süksinat türü tarafından salgılanan varsayımında 1 enflamatuar MP'ler NSC'lerde nakledilen bir kirleticilerin alınmasına yönelik özelliği artan Alt-tabaka temin tepki olarak ayarlamak başlatır (Srisawang ve diğ., 2007). Bu yeni arası metabolik birleştirme mevcut literatür gösteren iyi uyan, Belirli mikroçevrelerde içinde, Hücreler mevcut besin için rekabet, birbirlerinin fonksiyon ve kaderini etkileyen (Pearce ve Pearce, 2013).

Biz Nakledilen kök hücrelerin ve barındırmak bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler tamamlayıcı hale nereye inflamatuar bağlamlarda kilit metabolik sinyalinin kullanılabilirliği azaltmada önemli bir rol oynayabilir SUCNR1-ifade eden iNSCs ve NSC'lerde tarafından o süksinat tükenmesine tahmin (PLUCHINO ve Cossetti, 2013). Daha genel olarak, Bizim bulgular kışkırtıcı ile uyumludur, henüz hala gelişmekte olan, birçok tamamlayıcı immün modülatör ve doku trofik etki edebilmektedir beyin ata koruyucuları olarak NSC'lerde kavramı (Martino ve PLUCHINO, 2007).

Ek çalışmalar, nöro-immün süksinat-SUCNR1 ekseninin işlevini karakterize etmek için gerekli olan, Nöral kök / progenitör hücreler için hücresel metabolizmanın kritik rolüne ek analizler sunmak (Knobloch ve Jessberger, 2017), ve kronik iltihaplı beyinde bu yolu hedef tamamlayıcı farmakolojik yaklaşımların geliştirilmesi.

Sonuç olarak, Biz NSC'lerde süksinat SUCNR1 bağımlı mekanizma yoluyla nöroenflamasyon iyileştirmek için kronik olarak inflame CNS'de biriken hücre dışı süksinat anlamda burada göstermektedir. Çalışmalarımız somatik rejeneratif potansiyelini doğrudan neden olduğu NSCs destekleyen yeni bir anti-enflamatuar bir mekanizma tanımlar, Bu şekilde, kronik inflamatuar ve dejeneratif nörolojik hastalıklar için kişiselleştirilmiş kök hücre ilaçların yeni bir dönem için zemin.


NBScience

Kontrat Araştırma Organizasyonu

Kök hücre tedavisi