Spaceflight attiva la proteina chinasi C Alpha segnalazione e modifica la Stadio di sviluppo di neonatali umana cellule cardiovascolari progenitrici

 

impatti volo spaziale in funzione cardiovascolare astronauti; però, il suo impatto sullo sviluppo cardiaco e le cellule staminali che costituiscono la base per la riparazione cardiaca è sconosciuto. di conseguenza, sono necessarie ulteriori ricerche per scoprire la potenziale rilevanza di tali cambiamenti per la salute umana. Utilizzando microgravità simulata (SMG) generato dal clinorotation bidimensionale e la cultura a bordo della Stazione Spaziale Internazionale (ISS), abbiamo valutato gli effetti di scarico meccanico su neonatale cellule progenitrici cardiovascolare umano (CPC) proprietà di sviluppo e segnalazione. A seguito di 6-7 giorni di SMG e 12 giorni di coltura ISS, abbiamo analizzato i cambiamenti nell'espressione genica. Entrambi gli ambienti hanno indotto l'espressione di geni che sono tipicamente associati con uno stato precedente di sviluppo cardiovascolare. Per comprendere il meccanismo con cui si sono verificate tali cambiamenti, abbiamo valutato l'espressione di piccole RhoGTPases meccanosensibili in CPC SMG-coltura e osservato livelli di RHOA e CDC42 diminuita. Per effetto di tali molecole sui livelli di calcio intracellulare, abbiamo valutato cambiamenti non canonica Wnt / segnalazione di calcio. Dopo 6-7 giorni sotto SMG, CPC esposti elevati livelli di WNT5A e PRKCA. allo stesso modo, CPC ISS-in coltura esposte elevati livelli di movimentazione di calcio e geni di segnalazione, che corrispondeva alla proteina chinasi C alfa (PKCα), una proteina chinasi calcio-dipendente, attivazione dopo 30 giorni. Akt è stato attivato, considerando fosforilate extracellulari chinasi livelli signal-regulated sono rimasti invariati. Per esplorare l'effetto di induzione di calcio nel CPC neonatali, abbiamo attivato PKCα utilizzando trattamento hWnt5a sulla Terra. Successivamente, primi cardiovascolari livelli dei marker di sviluppo sono stati elevati. Trascritti indotti dalla SMG e hWnt5a-trattamento sono espresse all'interno nodo senoatriale, che può rappresentare miocardio embrionale mantenuto nel suo stato primitivo. segnale del calcio è sensibile allo scarico meccanico e dirige CPC proprietà di sviluppo. Ulteriori ricerche sia nello spazio e sulla Terra può contribuire a perfezionare l'uso del CPC in terapie basate sulle cellule staminali ed evidenziare gli eventi molecolari dello sviluppo.

introduzione
Per quanto l'umanità si prepara per una presenza estesa nello spazio, gli effetti molecolari di microgravità (MG) sono sempre più oggetto di indagini. Come questa ricerca si è evoluta, l'applicazione di MG, reali o simulati, è stato trovato per avere un potenziale impiego terapeutico qui sulla Terra [1-3]. così, sforzi per caratterizzare la risposta biologica di condizioni di gravità ridotta, anche a livello molecolare, andrà a beneficio della società sia nello spazio e sulla Terra.

La ricerca nel nostro laboratorio ha dimostrato che microgravità simulata (SMG) impatti il ​​profilo dello sviluppo di cellule progenitrici cardiovascolari umane (CPC) in un modo età-dipendente [4]. È interessante notare che, analisi microarray in tali esperimenti identificati piccoli RhoGTPases e Wnt come alcuni dei sistemi colpiti dall'ambiente SMG in CPC neonatali.

L'effetto di scarico meccanico sulle cellule staminali embrionali di topo (mESCs) ha dimostrato di avere un impatto differenziazione e stemness, con gli esperimenti di Blaber et al. [5] dimostrando che corpi embrionali mantengono marcatori di auto-rinnovamento e presentano ridotte germe espressione marcatore livello definitivo quando volato nello spazio. però, negli stessi studi, quando corpi embrionali meccanicamente scariche ritornati sulla Terra, fossero in grado di differenziare più facilmente in colonie cardiomiociti contrattili. allo stesso modo, Jha et al. [6] scoperto che le cellule staminali pluripotenti indotte umane più facilmente differenziano in cardiomiociti utilizzando cultura tridimensionale accoppiato con transitoria, esposizione precoce alla SMG.

Questi esperimenti separati possono rappresentare un fenomeno simile in cui una cultura bassa gravità favorisce una migliore stato di stemness sotto SMG o MG che si traduce in una maggiore capacità di differenziazione quando le cellule sono restituiti normali condizioni di gravità. così, terapie con cellule staminali rilevanti per la riparazione cardiaca può essere migliorata manipolando i meccanismi relativi alla segnalazione meccanica in progenitori cardiovascolari. In particolare, inducendo maggiore staminalità nei progenitori cardiovascolari può facilitare una corrispondente maggiore effetto clinico dopo trapianto.

Alterazioni nelle molecole di rilevamento meccanico, come le piccole RhoGTPases, si ritiene sia coinvolta nell'adattamento molecolare per MG [7,8]. È importante sottolineare che, queste molecole sono anche in grado di influenzare vie di segnalazione intracellulare, come oscillazioni di calcio, che successivamente può attivare AKT [9] e extracellulare chinasi signal-regulated (ERK) [10]. Nel contesto di cardiogenesis, questi processi sono fondamentali per mantenere un equilibrio tra segnali induttivi e proliferative [11,12]. Perciò, manipolando l'ambiente a gravità normale dei primi CPC può evidenziare importanti meccanismi con cui progenitori cardiaci sviluppare o espandere. Tali approfondimenti possono essere applicati per capire meglio lo sviluppo cardiovascolare e migliorare gli esiti di cellule staminali a base di terapie rigenerative.

Nel contesto della riparazione cardiaca, primi studi clinici di questi tipi di terapie sono promettenti [13-15], ma sono ostacolati da un fallimento di attecchimento delle cellule e polemica sul tipo di cella appropriata [16]. Perciò, l'applicazione dei risultati da esperimenti MG ad esperimenti terrestri possono aiutare a superare le carenze di prove cliniche in corso l'utilizzo di CPC per la riparazione cardiaca.

Nel tentativo di caratterizzare sia gli effetti di MG su una popolazione di primi CPC, nonché il potenziale uso di questi cambiamenti sulla Terra, abbiamo coltivato CPC umani neonatali con un clinostat bidimensionale e nel Laboratorio Nazionale a bordo della Stazione Spaziale Internazionale (ISS). Abbiamo cercato di identificare i cambiamenti nella trascrizione di geni coinvolti nella segnalazione in risposta alla SMG e MG, nonché gli effetti di tali modifiche alla segnaletica su staminalità. Abbiamo poi modellato caratteristiche di questi cambiamenti molecolari in vitro usando una piccola molecola in condizioni di gravità normale. In tal modo, vi presentiamo i componenti della risposta cellulare adattativa per MG e le loro implicazioni per migliorare il potenziale rigenerativo di CPC neonatali.

Materiali e metodi
Isolamento e la coltura del primo CPC
L'Institutional Review Board della Loma Linda University ha approvato il protocollo per l'uso di tessuto che è stato scartato durante la chirurgia cardiovascolare, senza informazioni private identificabili, per questo studio con una rinuncia del consenso informato. CPC sono stati isolati da tessuto cardiaco dei neonati (1 giorno-1 mese), come precedentemente descritto [17]. Brevemente, tessuto atriale è stato tagliato in piccoli grumi (~ 1.0 mm3) e poi enzimaticamente digerito con collagenasi (Roche, Indianapolis, NEL) ad una concentrazione di lavoro di 1,0 mg / ml. La soluzione risultante è stata quindi fatta passare attraverso un filtro cella 40 micron. Le cellule sono state clonate in una piastra a 96 pozzetti per diluizione limite ad una concentrazione finale di 0.8 cellule per pozzetto per creare popolazioni di espansione.

Poi, cloni sono stati sottoposti a screening per la coespressione di Isl1 e c-Kit e integrati con che comprende terreni di crescita 10% siero fetale bovino (Thermo Scientific, Waltham, MA), 100mg / ml di penicillina-streptomicina (life Technologies, Carlsbad, CA), 1.0% essenziale soluzione minima media non essenziali aminoacidi (life Technologies), e 22% mezzi di crescita delle cellule endoteliali (Lonza, Basilea, Svizzera) in media 199 (life Technologies). Il kit MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection (Lonza, Basilea, Svizzera) è stato utilizzato per testare per la contaminazione da micoplasma

 

 

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