Macrofagi-Derived extracellulare succinato Licenze cellule staminali neurali per sopprimere Neuroinflammation cronica

 

Mette in risalto
• NSC da tessuti somatici o riprogrammazione diretta ugualmente reprimono neuroinflammation
• extracellulare succinato attiva SUCNR1 / GPR91 sulla NSC
• NSC attivati ​​secernono PGE2 e scavenging succinato, tipo così riprogrammazione 1 parlamentari
• Sucnr1 NSC mutanti hanno ridotto l'attività anti-infiammatoria dopo il trapianto
Sommario
cellule staminali neurali (NSC) Il trapianto può influenzare le risposte immunitarie e sopprimere l'infiammazione del sistema nervoso centrale. metaboliti, come succinato, modulare il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie, ma se e come NSC vengono attivati ​​da tali immunometabolites per controllare immunoreattività e infiammatorie risposte è chiaro. Qui, mostriamo che somatica trapiantato e NSC direttamente indotte migliorano infiammazione cronica CNS riducendo i livelli di succinato nel liquido cerebrospinale, diminuendo in tal modo fagociti mononucleari (MP) infiltrazione e danni CNS secondaria. Parlamentari infiammatorie rilasciano succinato, che attiva recettore succinato 1 (SUCNR1)/GPR91 su NSC, portandoli a secernere prostaglandina E2 e scavenging extracellulare succinato con effetti anti-infiammatori conseguenti. così, nostro lavoro rivela un ruolo inaspettato per l'asse succinato-SUCNR1 somatiche e direttamente indotta NSC, che controlla la risposta delle cellule staminali per segnali metabolici infiammatori rilasciati per tipo 1 Parlamentari nel cervello cronicamente infiammato.

introduzione
Progressi della biologia delle cellule staminali hanno suscitato speranze che le malattie del sistema nervoso centrale può essere migliorata da farmaci cellule staminali non ematopoietiche (Martino and Pluchino, 2006). Abbiamo fornito prove convincenti che il trapianto di cellule staminali neurali somatiche (NSC) migliora le caratteristiche clinico-patologiche di modelli animali di malattie infiammatorie del SNC. Al di là della sostituzione strutturale delle cellule del SNC feriti, nostro lavoro ha dimostrato che NSC trapiantate impegnarsi in programmi complessi di cellule staminali innesto a host comunicazione, nel complesso che porta a sostegno trofico e la modulazione adattativa e delle risposte immunitarie innate (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino and Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009B). In particolare, trapianti NSC ridurre l'onere di infiammazione al sito di lesione (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009un), diminuire il numero di tipo 1 fagociti mononucleari infiammatorie (parlamentari) (Cusimano et al., 2012), e favorire la guarigione dei feriti CNS attraverso meccanismi ancora poco caratterizzate.

però, la definizione clinica di terapie sperimentali NSC è ancora limitata dalle fonti da cui NSCs umani (hNSCs) sono derivati (Anderson et al., 2017), l'immunogenicità intrinseca di linee hNSC allogenici (Ramos-Zuniga et al., 2012, Rice et al., 2013), e la stabilità del cosiddetto “sacco cella destinata clinica” (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). Autologo e stabilmente espandibili NSC direttamente indotte (iNSCs) da fibroblasti dermici dei pazienti stanno emergendo come una valida alternativa alle terapie NSC (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). La riprogrammazione diretta in iNSCs evita la progressione laborioso attraverso uno stato pluripotente e successiva differenziazione in linee desiderate descritte per cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) tecnologia (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Perciò, rendendo iNSCs stabilmente espandibili da cellule somatiche rappresenta il modo più fattibile di ottenere cellule staminali autologhe cervello per applicazioni cliniche downstream (Wörsdörfer et al., 2013). però, l'efficacia di iNSCs direttamente riprogrammati nel trattamento di patologie infiammatorie del sistema nervoso centrale non è ancora stato testato.

In forme progressive di sclerosi multipla (SIGNORINA), infiammazione cronica CNS è dovuta all'attivazione diffusa mp che comprendono sia CNS microglia residente e derivate da monociti infiltranti macrofagi (Mallucci et al., 2015). Parlamentari si trovano in lesioni della sostanza grigia, vicino ai neuriti degenerazione e corpi cellulari neuronali (Peterson et al., 2001), e in lesioni della sostanza bianca, dove il bordo esterno della microglia attivata è associata a danno tissutale cronica (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Aree di aspetto normale della sostanza bianca sono caratterizzati anche da un accumulo MP, che porta alla formazione di noduli microgliali che guidano malattia patologia indipendentemente attivazione delle cellule T concomitante (Moll et al., 2011). Il ruolo dannoso di infiammazione cronica MP-guidato in progressiva MS è anche supportato da prove in modelli di malattia degli animali, dove il suo carico complessivo correla con la funzione neuronale alterata (Plank et al., 2017), atrofia cerebrale (Tambalo et al., 2015), e ridotta risposte rigenerativi (Jiang et al., 2014).

Attivazione di deputati da stimoli pro-infiammatoria provoca un interruttore metabolico verso glicolisi e ridotta fosforilazione ossidativa (OXPHOS) (Kelly e O'Neill, 2015). Prove recenti suggeriscono che, all'interno di questo ricablaggio metabolica, genere 1 Parlamentari infiammatori accumulano succinato, con importanti implicazioni fisiopatologiche (Tannahill et al., 2013). succinato intracellulare inibisce l'attività degli enzimi prolil idrossilasi (dottorati), stabilizzando così ipossia elemento sensibile (HIF)-1alfa e inducendo la trascrizione di interleuchina (IL)-1B (Tannahill et al., 2013). inoltre, ossidazione del succinato deidrogenasi da succinato (SDH) repurposes mitocondri da sintesi di ATP a specie reattive dell'ossigeno (ROS) produzione ulteriore segnale pro-infiammatorio (Mills et al., 2016). genere 1 Mp infiammatorie rilasciano succinato extracellulare e upregulate suo recettore succinato 1 (SUCNR1), un recettore G-protein-coupled (conosciuto anche come GPR91), che funziona come sensore autocrina e paracrina per migliorare la produzione di IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).

Come tale, metabolismo sta emergendo come un importante obiettivo terapeutico per modulare l'attivazione di entrambi i macrofagi (Kelly e O'Neill, 2015) e microglia (Orihuela et al., 2016), e percorsi di succinato connesse sono le funzioni chiave di modulatori del sistema immunitario per le malattie infiammatorie acute e croniche (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).

Date le proprietà modulazione del sistema immunitario stabilite di NSC (Pluchino and Cossetti, 2013), abbiamo ipotizzato che le cellule staminali neurali può esercitare i loro effetti terapeutici in neuroinfiammazione cronica modulando il metabolismo MP verso la riduzione dei danni del sistema nervoso centrale secondaria.

In questo lavoro, abbiamo studiato i meccanismi molecolari alla base della capacità di CSN somatiche e direttamente indotte per contrastare i cambiamenti metabolici di tipo 1 Mp infiammatori sia in vivo che in vitro. Abbiamo dimostrato che iNSCs e NSC trapiantate sono funzionalmente equivalenti nel migliorare neuroinfiammazione cronica nei topi affetti da encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). iNSCs trapiantati / NSC commutano nel profilo di attivazione del CNS residente microglia e derivate da monociti infiltranti macrofagi verso un fenotipo antinfiammatorio, nonché ridurre i livelli di succinato immunometabolite nel liquido cerebrospinale (CSF). iNSCs / NSC anche diminuire succinato extracellulare rilasciato per tipo 1 Parlamentari infiammatori per riprogrammare il loro metabolismo verso OXPHOS in vitro. meccanicisticamente, mostriamo che succinato secreta per tipo 1 Mp suscita in iNSCs / NSC una cascata di segnalazione a valle SUCNR1, che permette la loro attività anti-infiammatoria. Questa funzione antinfiammatoria succinato licenza di iNSCs / NSC è mediata dalla secrezione di prostaglandine (PG) E2, come anche per una notevole scavenging di succinato extracellulare. Perdita di funzione Sucnr1 nelle NSC porta a ridurre significativamente le attività anti-infiammatori in vitro e in vivo dopo trapianto in EAE.

Il nostro studio scopre un asse succinato-SUCNR1 che chiarisce come NSC rispondono ai segnali metabolici infiammatori di inibire l'attivazione di tipo 1 Parlamentari in neuroinfiammazione cronica.

risultati
NSC trapianto migliora Neuroinflammation cronica ed è accoppiato con riduzione del Immunometabolite succinato nel liquido cerebrospinale
In primo luogo abbiamo valutato gli effetti della intracerebroventricolare (ICV) il trapianto al picco della malattia (PD) di iNSCs o NSC in topi con MOG35-55 indotta cronica EAE e confrontato ai topi EAE controllo PBS trattati. Prima del trapianto, iNSCs e NSC sono stati ampliati, caratterizzato (Figura S1), ed etichettate con farnesylated (f)GFP in vitro. A 30 giorni dopo il trapianto (recuperabili), INSC e NSC trapianti sono sopravvissuti, distribuito, ed integrato all'interno del cervello e del midollo spinale EAE (Figura S2). Solo una minoranza delle cellule + fGFP recuperati (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) sono stati proliferanti (Figura 1A) o di esprimere neuronale (Figura 1B), astrogliale (Figura 1C), o oligodendrogliale (Figura 1D) marcatori lignaggio (Figura S2). La maggioranza (~75%) di iNSCs sopravvissuti al trapianto sono stati trovati invece di non essere esprimere qualsiasi dei marcatori lignaggio neurali testati e localizzare intorno settori di nicchia come perivascolari meningea vicino a F4 / 80 + parlamentari endogeni (Figura 1E), come osservato in somatici innesti NSC (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). Il trapianto di iNSCs indotto un significativo e di lunga durata (fino a 90 recuperabili) miglioramento dei punteggi EAE, che ha iniziato da 15 a 20 dpt in poi (Figure 1F e S2). Il recupero funzionale è stato confermato anche da analisi del cammino automatizzata assistita da computer (Figura S2). Complessivamente, iNSCs ICV-trapiantati erano al sicuro e ha portato al recupero comportamentale e patologico.

Abbiamo poi analizzato la composizione di infiltrati infiammatori SNC tramite ex vivo citofluorimetria a INSC- e NSC-trapiantato verso il controllo PBS trattati topi EAE. Il trapianto di iNSCs o NSC non ha avuto effetti sulla frazione di cellule T SNC-infiltranti, cellule B, e parlamentari totali, nonché dal fatto che delle sottopopolazioni di cellule CD3 + / CD4 + T (tra cui Th1, Th2, Treg, ThGM-CSF, e sottoinsiemi Th17) a 30 recuperabili (Figura S3). Anziché, NSC- o NSC-trapiantate topi EAE mostrato un interruttore significativa nel profilo di attivazione delle cellule CX3CR1 + con ~1.5 volte diminuzione del CD80 + tipo 1 microglia infiammatorie e parallelo incremento della MRC1 + microglia antinfiammatorio (Figura 1G). allo stesso modo, CNS-infiltrante (derivate da monociti) CCR2 + macrofagi da INSC- topi EAE o NSC-trapiantati subito significativa interruttore fenotipo con ~1.3 volte diminuzione del CD80 + tipo 1 macrofagi infiammatori e parallelo aumento ~1.8-piega delle MRC1 + anti-infiammatori macrofagi (Figura 1H). Questo effetto è stato accompagnato da una significativa riduzione dell'espressione del tipo 1 marcatore MP infiammatorio nitrico inducibile ossido sintasi (iNOS) da F4 / 80 + deputati in vivo (Figure 1I e S3).

Abbiamo poi analizzato i livelli di espressione del pro principale- e geni anti-infiammatori in tutta CNS. NSC- e NSC-trapiantato topi EAE entrambi i quali dimostrano ridotti livelli di interleuchina-1 beta (Il1b) nel cervello e nel midollo spinale e aumento dei livelli di recettore del mannosio tipo C 1 (MRC1) nel midollo spinale, sia a 10 recuperabili (figura 1J).

Abbiamo trovato differenze significative nella barriera emato-encefalica (BBB) permeabilità al 30 dpt Confrontando iNSC- / NSC-trapiantati con controllo PBS-topi trattati EAE (Figura S3).

Finalmente, NSC- e NSC-trapiantato topi EAE accumulato significativamente ridotta perdita assonale (Figura 1K) e demielinizzazione (Figura 1L) nel midollo spinale.

Data l'importanza del metabolismo stabilita nel regolare il fenotipo e la funzione di parlamentari, abbiamo studiato se il trapianto di NSC colpiti microambiente metabolico neuroinflammatory. A questa fine, abbiamo eseguito un profilo metabolico non mirati di metaboliti polari mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) di campioni di CSF e di plasma abbinati (tabella S1). controllo topi EAE PBS-trattati hanno mostrato un aumento significativo di vari CSF (ma non plasma) metaboliti, tra cui succinato picco solo 45 giorni post-vaccinazione (dPI) (corrisponde a 30 recuperabili; Figura 1M). topi EAE non sottoposti ad un intervento chirurgico anche mostrato un significativo aumento della succinato solo nel CSF a 45 dPI (rispetto ai topi di controllo sani), che non era diverso dai livelli di succinato in topi EAE controllo CSF ​​PBS trattati (Figura S3).

Che non abbiamo rilevato alcun cambiamento significativo nei livelli di metaboliti plasma tra dell'INSC / NSC-trapiantato topi EAE controllo trattati con PBS (tabella S1), abbiamo scoperto che il trapianto di cellule staminali neurali iNSCs o ha portato a un calo significativo nel liquor succinato a 30 recuperabili (Figura 1M; tabella S1).

Ulteriore, abbiamo trovato differenze significative nel CSF succinato quando si confrontano i topi trattati con PBS EAE rispetto topi EAE iniettato ICV con fibroblasti di topo (MFs) come cellule di controllo (Figura S3).

così, iNSCs e NSC direttamente iniettati nella EAE CNS indurre un interruttore specifico fenotipo di deputati, che è associato con la riduzione del succinato immunometabolite solo CSF ​​e miglioramento della neuroinfiammazione cronica.

NSC ridurre i livelli di succinato e riprogrammare il metabolismo di tipo 1 Infiammatoria Mφ in vitro
Abbiamo quindi studiato i meccanismi molecolari attraverso cui iNSCs / NSC mostrano attività anti-infiammatori sulle tipo 1 parlamentari, utilizzando un sistema in vitro che ricapitola le interazioni tra deputati e iNSCs / NSC. macrofagi Naive midollo osseo di derivazione (Mφ) sono stati polarizzati in un tipo 1 fenotipo infiammatorio con LPS (MφLPS), come descritto (Tannahill et al., 2013). MφLPS sono stati poi co-coltura con iNSCs (MφLPS-iNSCs) o NSC (MφLPS-NSC) in un sistema trans-bene che evita contatti cellula-cellula (Figura 2A). Polarizzata Mφ sono stati utilizzati come controlli.

Microarray profilo di espressione genica ha mostrato significativi cambiamenti trascrizionali in MφLPS con 7,401 geni colpiti (contro Mφ; valore p rettificato < 0.1; Figura 2B; tabella S2) e 51 geni differenzialmente espressi in MφLPS-iNSCs o MφLPS-NSC (contro MφLPS; valore p rettificato < 0.1; Figure 2B e 2C; tabella S2). Quest'ultimo gruppo di geni è stato arricchito nei processi biologici legati alla regolazione positiva di attivazione dei leucociti (PARTIRE: 0002696), differenziazione dei leucociti mieloide (PARTIRE: 0002761), e dei processi del sistema immunitario (PARTIRE: 0002376). Indipendente convalida qRT-PCR dei geni pro-infiammatori Mφ selezionati confermato significativa down-regulation dei livelli di espressione di IL12B, IL15, Il15ra, e CD69, come pure i geni infiammatori classici NOS2, fattore di necrosi tumorale (tnf), e Il1b in MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSC (contro MφLPS; Figura 2D). Questo effetto è stato accoppiato con la sovraregolazione concomitante dei livelli di espressione di geni associati con Mφ fenotipo antinfiammatorio, come uronyl-2-sulfotransferase (paragrafo) e del midollo osseo antigene cellule stromali 1 (Bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), così come arginase 1 (arg1) e MRC1 (contro MφLPS; Figura 2E). Quando iNSCs / NSC sono stati co-coltura con lipopolisaccaride (LPS)-cellule topo BV2 microgliali attivate come prima, è stata anche osservata una significativa riduzione dei livelli di espressione dei geni pro-infiammatori NOS2 e Il1b (Figura 2F).

Per creare un collegamento profili di espressione genica con stati funzionali metabolici, abbiamo valutato il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di MφLPS come letture di loro acidi tricarbossilici (TCA) attività di ciclo e glycolytic, rispettivamente. Abbiamo trovato una significativa riduzione di OCR e un aumento significativo di ECAR in MφLPS (contro Mφs). Anziché, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSC sono stati sottoposti a notevole restauro di entrambi i valori OCR e ECAR (contro MφLPS; Figure 2G e 2H), come osservato in commutazione Mφ ad un fenotipo antinfiammatorio (O'Neill e Pearce, 2016).

Nel tentativo di chiarire i determinanti metabolici di questi effetti anti-infiammatori, abbiamo effettuato untargeted analisi LC-MS della piccola molecola contenuti metabolita extracellulare e intracellulare di MφLPS. Come previsto, stimolazione con LPS profondamente cambiato l'ambiente extracellulare e metabolico intracellulare di Mφ (MφLPS) (contro Mφ; Tabella S3). In co-colture, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSC entrambi hanno mostrato una significativa riduzione del glutammato extracellulare, GABA, e succinato (contro MφLPS; Figura 2I; Tabella S3). inoltre, MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSC visualizzate anche una significativa riduzione dei intracellulare succinato e itaconato (contro MφLPS; Figura 2J; Tabella S3).

Coerentemente con la riduzione dei livelli di succinato, abbiamo scoperto che MφLPS-iNSCs e MφLPS-NSC esibivano significativamente i livelli di HIF-1α ridotti, del monte proteina di piruvato chinasi isoenzima M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figura 2K), nonché di IL-1β (contro MφLPS; Figura 2L).

Del tutto, questi dati in vitro dimostrano che iNSCs / NSC riducono sia l'accumulo di succinato intracellulare ed extracellulare in co-coltura con tipo 1 parlamentari infiammatori, riprogrammando verso un fenotipo antinfiammatorio OXPHOS.

Segnali succinato via SUCNR1 / GPR91 nel topo e NSC umano
Data l'importanza di succinato come segnale immunometabolic, abbiamo studiato se succinato rilasciato per tipo 1 Deputati pro-infiammatori potrebbero regolare l'attività delle cellule circostanti in situ, tra cui quello di trapiantato iNSCs / NSC.

Abbiamo trovato che iNSCs trapiantate / NSC identificati in prossimità meningee aree perivascolari (Figure 3A e 3B ) e F4 / 80 + parlamentari (Figura 3C) espressa SUCNR1 in vivo nel SNC. SUCNR1 stata espressa anche a livello proteico su entrambi iNSCs e NSC in vitro, ma non in MFs (Figura 3D).

Per valutare ulteriormente se SUCNR1 in iNSCs / NSC è stato funzionalmente attivato da succinato, abbiamo studiato la sua cascata di segnalazione a valle in vitro. Se esposto a succinato (Figura 3E; Rubic et al., 2008), 34.2% (± 7,4%) di iNSCs e 31.7% (± 6,5%) di NSCs mostrato un rilascio di depositi di calcio intracellulare (Figure S4 e 3F). Questa risposta è stata seguita da un upregulation significativa del mitogeno-activated protein chinasi fosfo-p38 (Figura 3G), indicativo della sua attivazione. Abbiamo confermato l'espressione di SUCNR1 e SUCNR1 anche nell'uomo NSC fetale (hNSCs) e iNSCs umani (hiNSCs) (Figure 3H e 3I). Come in iNSCs topo, succinato-dipendente segnalazione p38 è stata evocata nel hiNSCs, ma non in hiNSCs pre-trattati con l'inibitore selettivo 4c SUCNR1 (Figura 3J).

così, topo e umani iNSCs e NSC esprimono SUCNR1 funzionale, che induce un percorso di segnalazione a valle della stimolazione con il succinato immunometabolite.

SUCNR1 stimolazione Avvia la secrezione di prostaglandina E2 da NSC
Per chiarire le conseguenze funzionali di SUCNR1 segnalazione nelle NSC, abbiamo generato NSC da topi privi Sucnr1 (Sucnr1 - / - NSC) (Rubic et al., 2008; Figura S4). Rispetto a controllare NSC, Sucnr1 - / - NSC mostrato simile curve di crescita e la differenziazione in vitro (Figura S4). però, quando esposti a succinato a tempi diversi e concentrazioni, Sucnr1 - / - NSC non hanno mostrato upregulation di fosfo-p38 (Figura S4). La stimolazione con glutammato o ATP + thapsigargin indotta in Sucnr1 - / - NSC una risposta di calcio simile a quella del controllo NSC (Figura S4). Anzi, trattamento succinato non ha provocato il rilascio di calcio dai depositi intracellulari (Figura S4), che ha indicato un SUCNR1 difettoso segnalazione in Sucnr1 - / - NSC.

Abbiamo quindi effettuato un gene expression profiling microarray dopo il trattamento con succinato in NSC controllo e Sucnr1 - / - NSC (Tabella S4). Abbiamo scoperto che sintasi prostaglandina-endoperoxide 2 (Ptgs2), l'enzima chiave nella biosintesi PG codificante inducibile PTGS2, è stato il gene più upregulated in NSCs controllo succinato stimolata (fold change log2 1.05), ma non in succinato-stimolato Sucnr1 - / - NSC (log2 fold change -0.43; Figura 4A). Abbiamo convalidato questi risultati sul Ptgs2 da qRT-PCR, confermando che i suoi livelli di espressione sono stati significativamente upregulated (2.1- a 2,7 volte il cambiamento) in iNSCs succinato-stimolato e NSC, mentre non erano in succinato trattati Sucnr1 - / - NSC (Figura 4B).

Dato il ruolo di PGE2 come regolatore degli effetti immunosoppressivi di cellule staminali mesenchimali (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), abbiamo testato il suo accumulo nei terreni di coltura tissutale da iNSCs, NSC, e Sucnr1 - / - NSC dopo stimolazione con succinato. iNSCs e NSC, ma non Sucnr1 - / - NSC, ha mostrato significativi (>2.5-piegare) aumento del loro rilascio basale di PGE2 più presto 30 min dopo succinato. Questo effetto succinato indotta è stata abolita da pretrattamento con l'irreversibile PTGS2 bloccante SC-58125 (Figura 4C). Come in iNSCs topo, esposizione di hiNSCs di succinato suscitato un significativo incremento delle concentrazioni di PGE2 in terreni di coltura tissutale, considerando nuovamente pre-trattamento con SC-58125 o 4c impedito il suo rilascio (Figura 4D).

Per estendere ulteriormente la rilevanza di questi risultati per co-colture tra NSC e MφLPS, abbiamo analizzato i livelli di PGE2 in terreni di coltura tissutale. Abbiamo trovato che MφLPS-NSC accumulato più elevati livelli di PGE2 rispetto al MφLPS, mentre il pre-trattamento delle NSCs co-coltura con SC-58125 ha ridotto significativamente i livelli di PGE2 (Figura 4E). SC-58125 pretrattamento di NSC è anche accoppiato con un significativo aumento dell'espressione Il1b in MφLPS (Figura 4F) e con una riduzione di OCR valori indicativi di un fenotipo pro-infiammatorio (Figura 4G). però, abbiamo notato che le cellule staminali neurali pre-trattati con SC-58125 ha mantenuto alcuni effetti anti-infiammatori residue su MφLPS rispetto al Sucnr1 - / - NSC (Figura 4F). Anzi, perdita Sucnr1 di funzione nel NSC completamente abolito i loro effetti anti-infiammatori sulle MφLPS (Figure 4F e 4G). Mostriamo anche che l'osservato PGE2-dipendente la capacità anti-infiammatoria delle NSC è conservata e rilevanti per la NSC umani.

Come tale, hiNSCs indotto una riduzione significativa dell'espressione Il1b in MφLPS in co-colture (Figura 4H), che è stato accoppiato con un ripristino dei valori OCR (Figura 4I) e aumento dei livelli di PGE2 in terreni di coltura tissutale (figura 4J). Questi effetti sono stati completamente soppressi dal pretrattamento hiNSCs con l'inibitore selettivo 4c SUCNR1 (Figure 4H-4J).

così, l'attivazione del pathway SUCNR1 nel topo e NSC umane innesca il rilascio di PGE2 portando ad effetti anti-infiammatori su tipo 1 parlamentari.

però, esperimenti di inibizione rivolti sia PTGS2 o SUCNR1 anticipano che ulteriori SUCNR1-dipendente-PGE2-indipendenti-meccanismi sono suscettibili di svolgere un ruolo chiave negli effetti anti-infiammatori di NSC.

SUCNR1 stimolazione Attiva l'assorbimento di succinato da NSC
array di espressione genica di NSCs succinato-stimolata hanno rivelato che, Oltre Ptgs2, NACT / Slc13a5 è stato tra i geni più upregulated in wild-type (WT) NSC (fold change log2 = 0.49), ma non in Sucnr1 - / - NSC (log2 fold change = -0.12). SLC13A5 è un co-transporter dicarbossilato noti per essere coinvolti nel trasporto succinato (Srisawang et al., 2007). Dato l'esaurimento coerente di succinato pensa che sia in vivo nel liquor di dell'INSC- o NSC-trapiantati topi EAE e in vitro in co-colture con MφLPS, abbiamo ipotizzato che iNSCs / NSC avrebbero attivare SLC13A5 a pulire succinato.

Abbiamo scoperto che l'espressione di SLC13A5, nonché della alta affinità dicarbossilato co-transporter SLC13A3, erano significativamente aumentate in iNSCs e NSC, ma non in Sucnr1 - / - NSC, dopo stimolazione succinato (Figura 5A). allo stesso modo, hiNSCs esposti a succinato upregulated i livelli di espressione della proteina di entrambi questi SLC13 co-trasportatori in vitro (Figura 5B).

Abbiamo poi studiato il ruolo di questi co-trasportatori misurando succinato assorbimento in iNSCs e NSC. Abbiamo scoperto che entrambi i iNSCs e NSC significativamente accumulati [14C]-succinato (Figura 5C) riducendo la quantità di extracellulare [14C]-succinato in terreni di coltura tissutale (Figura 5D). Sucnr1 - / - NSC né accumulato [14C]-succinato intracellulare né hanno riducono lo extracellulare (Figure 5C e 5D). È interessante notare che, Sucnr1 - / - NSC, che abbiamo dimostrato di avere effetti sulla espressione Il1b in MφLPS (Figura 4F), non è riuscito a ridurre i livelli di succinato extracellulari in co-culture con MφLPS (Figura 5E). Come ulteriore prova dell'importanza di esaurimento succinato nel modulare il fenotipo di tipo 1 Parlamentari pro-infiammatorie, ci dimostrano che il trattamento con ricombinante attiva (r)SDH complesso subunità A è in grado di ridurre significativamente l'espressione di Il1b in MφLPS (Figura S5).

così, segnalazione SUCNR1 nel NSC richiede l'adozione del succinato immunometabolite, riducendo di fatto la piscina extracellulare disponibile sostenere l'attivazione autocrina e paracrina di tipo 1 parlamentari.

Il trapianto di Sucnr1 perdita-di-funzione NSC mostra ridotta capacità di migliorare Neuroinflammation cronica In Vivo
Per confermare il ruolo dell'asse-SUCNR1 succinato nel mediare la risposta di innesti NSC a succinato in vivo, abbiamo valutato gli effetti del trapianto di ICV di Sucnr1 - / - NSC nei topi con EAE cronica.

A 30 recuperabili, Sucnr1 - / - NSC sopravvissuto, distribuito, e integrato all'interno del cervello e del midollo spinale EAE senza differenze significative rispetto ai controlli NSC (Figura S6). però, il trapianto di Sucnr1 - / - NSC indotto solo una lieve ripresa del deficit comportamentali EAE rispetto ai topi di controllo EAE PBS trattati (EAE punteggio-Sucnr1 - / - NSC: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), che era significativamente meno pronunciato (50% dell'effetto) di quella osservata nei topi EAE trapiantati con cellule staminali neurali di controllo (EAE punteggio-NSC: 2.1 ± 0.3; Figura 6A).

Ex vivo analisi basata citometria a flusso della composizione di infiltrati infiammatori SNC dimostrato che il trapianto di topi EAE con Sucnr1 - / - NSC omesso di spostare le proporzioni di tipo 1 infiammatori e anti-infiammatori MPS-compresi CX3CR1 + microglia e CCR2 + derivate da monociti infiltranti macrofagi-in contrasto con gli effetti di controllo NSC (Figure 6B e 6C). Alberino patologia dei tessuti mortem confermato ulteriormente gli effetti ridotte tessuto-protettivo di Sucnr1 - / - innesti NSC (Figure 6D e 6E).

Abbiamo quindi studiato i livelli di PGE2 e succinato in campioni di CSF e plasma abbinati da topi EAE controllo PBS trattati NSC-trapiantato e. Abbiamo scoperto che entrambi Sucnr1 - / - NSC e NSC di controllo non sono riusciti a indurre cambiamenti significativi dei livelli di PGE2 nel liquor. Plasma PGE2 significativamente aumentata in soli topi EAE (rispetto ai controlli sani), senza effetti trattamento osservata (Figura 6F). È importante sottolineare che, considerando che il trapianto di NSC controllo ridotta CSF succinato (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1 - / - innesti NSC non ha mostrato effetti (Sucnr1 - / - NSC: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Figura 6G).

Questi dati confermano l'esigenza di un percorso di segnalazione funzionale SUCNR1 nella regolazione degli effetti anti-infiammatori e neuroprotettivi di trapianti NSC in vivo e sottolineano l'importanza di succinato scavenging come meccanismo antinfiammatorio predominante di azione di NSC.

Discussione
V'è una necessità clinica insoddisfatta di sviluppare approcci cellulari e molecolari per indirizzare i conducenti principali della fisiopatologia delle condizioni neuroinfiammatori croniche che includono forme progressive di SM (Volpe et al., 2016). In linea di principio, cellule staminali possiedono un potenziale terapeutico che è distinta da quella di piccole molecole e biologici e vanno ben oltre la classica medicina rigenerativa dell'arena. di droga Parte e dispositivo di parte, cellule staminali potrebbero funzionare agenti modificanti la malattia come biologici (DMA) quel senso segnali diversi, migrare in siti specifici del corpo, integrare gli ingressi di prendere decisioni, ed eseguire comportamenti complessi risposta nel contesto di uno specifico microambiente tissutale (Fischbach et al., 2013). Tutti questi attributi potrebbero essere sfruttate per trattare diversi processi patologici, compreso il persistente MP-driven infiammazione e tessuto degenerazione che si verificano in MS progressiva.

Qui, abbiamo usato accessibili, autologo, e iNSCs stabilmente espandibili (Thier et al., 2012), così come NSC somatiche, per studiare gli effetti del trapianto di cellule staminali del cervello in un modello murino di neuroinfiammazione cronica, che imita la cascata infiammatoria osservata in progressiva MS.

Abbiamo scoperto che il trapianto di iNSCs nella circolazione CSF di topi EAE promuove risultati equivalenti a quelli precedentemente osservato nei topi trapiantati con somatica NSC (Pluchino et al., 2003). iNSCs trapiantati o NSC indotto un significativo miglioramento clinico, nonché una minore assonale e danni mielina, senza alcuna riduzione significativa della permeabilità BBB a 30 recuperabili. Ulteriori studi aiuteranno chiarire se cambiamenti di permeabilità BBB o reclutamento di monociti infiammatorie al SNC verificano immediatamente dopo il trapianto di iNSCs / NSC. Se tale effetto è destinata a cambiare i principali risultati clinici di malattie con elevata prevalenza di CNS infiltrazione di cellule infiammatorie, come EAE / MS, è difficile prevedere.

Anziché, abbiamo scoperto che il nostro paradigma di trapianto è stato associato ad un interruttore specifico nel profilo di attivazione di entrambi CX3CR1 + cellule microgliali e CCR2 + derivate da monociti macrofagi infiltranti con una diminuzione del CD80 + tipo 1 Mp infiammatorie e parallelo incremento delle MRC1 + anti-infiammatori deputati. iNSCs trapiantati / NSC distribuiti e sono sopravvissuti nel sistema nervoso centrale di topi EAE, mentre preferenzialmente accumulo a livello di aree perivascolari meningee in contrapposizione ai deputati endogeni. Del tutto, questi risultati implicherebbero la presenza di alcuni meccanismi ancora sconosciuti di accoppiamento intercellulare tra cellule staminali innestate e deputati infiammatorie. Se questa comunicazione INSC / NSC-MP in vivo avviene solo in nicchie perivascolari o anche a livello di altri immunitario strutture di sensori simili emergenti del cervello che comprende il plesso coroideo resta da affrontare (Ge et al., 2017).

Abbiamo quindi studiato i meccanismi immunologici sottostanti mappa gli effetti benefici sul NSC deputati durante neuroinflammation cronica. Mirati analisi piccolo molecola di campioni di CSF e di plasma abbinati rivelato profondi cambiamenti metabolici nel CSF di topi EAE, con differenze tra i primi e le fasi ritardate della malattia.

Carnitina, leucina + isoleucina, citrullina, allantoina, ornitina, e acido urico sono stati tutti significativamente aumentata nei topi EAE controllo PBS trattati al picco di malattia. I nostri risultati sono coerenti con evidenze pubblicate che dimostrano che leucina, così come l'acido urico e suoi allantoina sottoprodotto, sono tutti aumentati nel liquor di soggetti con SM (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Considerando che una maggiore carnitina CSF non è stato riportato in MS, aumenti importanti sono stati descritti in non-MS condizioni infiammatorie del SNC, come l'encefalite (Wikoff et al., 2008) e la meningite (Shinawi et al., 1998).

al contrario, solo succinato ha mostrato un ritardo (cioè, 45 dPI) aumentare nel liquor di controllo PBS trattati topi EAE. Succinato sta diventando una preziosa in vivo biomarker di stress metabolico e l'attività infiammatoria (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills e O'Neill, 2014). È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che succinato era significativamente diminuito nel liquor di topi iNSC- / NSC-trapiantati. La riduzione del QCS succinato seguenti INSC o il trapianto NSC era di interesse e potrebbe avere un ruolo di primo piano nel interferire con neuroinfiammazione cronica.

Succinato rilasciato dal tipo 1 Mp infiammatori è un segnale infiammatoria chiave che interagisce con il suo specifico recettore G-protein-coupled SUCNR1. SUCNR1 agisce come un rivelatore precoce di stress metabolico in diverse condizioni fisiologiche e patologiche, comprese ipertensione renina-indotta, ischemia / riperfusione, infiammazione, l'aggregazione piastrinica, e l'angiogenesi retinica (Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). In particolare, abbiamo scoperto che è richiesta l'espressione di SUCNR1 per gli effetti terapeutici di NSC trapiantate in vivo.

attivazione di SUCNR1 succinato mediata su roditori e iNSCs umani e NSC attiva calcio di segnalazione e mitogeno-activated protein chinasi (Nafk) fosforilazione in vitro, suscitando così l'acquisizione di un fenotipo antinfiammatorio concertata nelle NSC. Da una parte, SUCNR1 attivata la secrezione di PGE2, un modulatore immunitario pleiotropica consolidata, funzione il cui obiettivi più tipi di cellule all'interno del microambiente infiammato, inclusi i parlamentari (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). D'altra parte, succinato-SUCNR1 segnalazione in iNSCs e NSC portato alla sovraregolazione dei due membri della famiglia SLC13 di co-trasportatori (cioè, SLC13A3 e SLC13A5) e l'adozione di succinato extracellulare.

In vivo, dimostriamo efficace scavenging di extracellulare succinato locale NSC iniettato in topi EAE attraverso la circolazione CSF, che è predominante, rispetto alla secrezione di PGE2. La perdita di segnalazione SUCNR1-dipendente NSC trapiantate portato alla significativa riduzione nei loro effetti anti-infiammatori e neuroprotettivi, mentre Sucnr1 - / - innesti NSC non ha mostrato alcuna differenza di sopravvivenza, distribuzione, e la differenziazione rispetto NSC controllo.

Abbiamo poi ipotizziamo che il succinato extracellulare secreta per tipo 1 Mp infiammatori avvia un comportamento scavenging che trapiantato NSC regolare in risposta all'aumento disponibilità substrato (Srisawang et al., 2007). Questo romanzo accoppiamento metabolico intercellulare adatta bene con la proiezione letteratura disponibile che, all'interno di microambienti particolari, cellule competono per i nutrienti disponibili, che colpisce la funzione e il destino di ciascuno (Pearce e Pearce, 2013).

Prevediamo che la deplezione succinato da SUCNR1 esprimenti iNSCs e NSC potrebbe svolgere un ruolo cruciale nel ridurre la disponibilità di un segnale metabolico chiave in contesti infiammatori in cui le interazioni tra le cellule staminali trapiantate e ospitare le cellule immunitarie diventano complementari (Pluchino and Cossetti, 2013). Più generalmente, i nostri risultati sono in linea con la provocatoria, ma ancora emergente, concetto di NSC come custodi ancestrali del cervello in grado di esercitare vari modulatori immunitario e del tessuto effetti trofici complementari (Martino and Pluchino, 2007).

Sono necessari ulteriori studi per caratterizzare ulteriormente la funzione dell'asse succinato-SUCNR1 nelle interazioni neuro-immunitario, fornire ulteriori approfondimenti sul ruolo fondamentale del metabolismo cellulare per le cellule neurali staminali / progenitrici (Knobloch e Jessberger, 2017), e sviluppare interventi farmacologici mirati complementari questo percorso nel cervello cronicamente infiammato.

In conclusione, mostriamo qui che NSC percepire il succinato extracellulare che si accumula nel cronicamente infiammato sistema nervoso centrale per migliorare neuroinflammation attraverso meccanismi succinato-SUCNR1-dipendenti. Il nostro lavoro identifica un meccanismo anti-infiammatorio romanzo che sostiene il potenziale rigenerativo di somatica e NSC direttamente indotte, aprendo così la strada ad una nuova era di farmaci di cellule staminali personalizzate per le malattie neurologiche infiammatorie e degenerative croniche.


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