मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की खेती प्रोटोकॉल

 

मानव भ्रूण स्टेम (जब HES) कोशिकाओं क्रम स्वस्थ बनाए रखने के लिए निगरानी की जानी चाहिए और परवाह के लिए, undifferentiated संस्कृतियों.

न्यूनतम पर, संस्कृतियों एक पूरा मध्यम परिवर्तन खो पोषक तत्वों की भरपाई और अवांछित भेदभाव कारकों में से मुक्त संस्कृतियों रखने के लिए प्रदर्शन से हर दिन खिलाया जाना चाहिए. हालांकि भेदभाव की एक छोटी राशि सामान्य और स्टेम सेल संस्कृतियों में की उम्मीद है, संस्कृति नियमित मैन्युअल निकाल कर साफ किया जाना चाहिए, या “उठा” विभेदित क्षेत्रों. कोशिकाओं की एक स्वस्थ आबादी के रखरखाव में पहचान करना और HES सेल संस्कृतियों से अतिरिक्त भेदभाव को दूर करने के लिए आवश्यक तकनीक रहे हैं.

मसविदा बनाना

1. रखरखाव: खुर्दबीन के नीचे संस्कृतियों अवलोकन

37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से HES कोशिकाओं में से एक थाली निकालें और माइक्रोस्कोप के लिए लाने के.
कम बिजली पर कालोनियों का निरीक्षण करें, 2X या 5X आवर्धन का उपयोग कर, समग्र संस्कृति गुणवत्ता का आकलन. नोट निम्नलिखित: सामान्य मध्यम रंग, कोई दिखाई संदूषण के अभाव, समग्र कॉलोनी आकार, गुणवत्ता और घनत्व, और किसी भी अन्य टिप्पणियों.
मध्यम रंग में परिवर्तन को ध्यान से देखें.

पीएच में परिवर्तन और HES कोशिकाओं के साथ एक रात ऊष्मायन के बाद मध्यम में पोषक तत्वों की कमी के कारण, मध्यम एक के लिए एक लाल रंग से बदल जाएगा “स्ट्रॉ” रंग. मध्यम बैंगनी प्रकट होता है, एक बुनियादी पीएच बदलाव आ गई है. मध्यम अत्यंत पीला दिखाई देता है, मध्यम अम्लीय है. बहुत पीला मध्यम अच्छी तरह से या संक्रमण में बेहद भीड़ कालोनियों का परिणाम हो सकता.

मध्यम हर समय स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए. हालांकि मध्यम में सेल मलबे का एक निश्चित स्तर सामान्य है, यह बादल नहीं दिखना चाहिए. सेल मलबे का एक उच्च स्तरीय मनाया जाता है तो, संस्कृति स्वस्थ नहीं है और दूषित किया जा सकता है.
संस्कृतियों रखरखाव या passaging आवश्यकता नहीं है, वे जैविक सुरक्षा कैबिनेट में लिया जा सकता है खिलाया जा करने के लिए

संस्कृतियों लगभग से अधिक शामिल हैं 10% फर्क कालोनियों, कोशिकाओं होना चाहिए “सफाई की” मैन्युअल रूप से अलग-अलग क्षेत्रों को हटाने के द्वारा

संस्कृतियों बड़े या घने कालोनियों शामिल है तो आगे, या MEF फीडर परत से अधिक है 12 दिन पुरानी, कोशिकाओं passaged किया जाना चाहिए

2. दूध पिलाने की HES कक्ष

एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, संस्कृति डिश के ढक्कन को हटा दें और खर्च मध्यम aspirate. सीधे कुओं के अंदर से थाली के किसी भी भाग दूसरे को स्पर्श करने के लिए पिपेट की नोक की अनुमति न दें. अगर वहाँ संदूषण के किसी भी चिंता का विषय है, एक नया करने के लिए बदल, बाँझ पिपेट.
एक बाँझ कांच pipet का प्रयोग, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए गरम HES सेल संस्कृति माध्यम की उचित मात्रा जोड़ने. एक 6-अच्छी तरह से थाली में संस्कृतियों के लिए, जोड़ना 2.5 अच्छी तरह से प्रति एमएल मध्यम.
इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटें 37 डिग्री सेल्सियस पर रहने के लिए और 5% सीओ 2.

3. HES सेल संस्कृतियों से भेद निकाला जा रहा है

परिवर्तन 9 एक शराब बर्नर के नियंत्रित लौ पर सुझाव दिए गए मोल्डिंग द्वारा पिकिंग उपकरण में इंच कांच पाश्चर pipettes. सुनिश्चित करें कि पिपेट की नोक संदूषण को रोकने के बंद और संस्कृति पकवान की प्लास्टिक खरोंच से बचाने के लिए गोल है रहो. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश स्रोत का उपयोग या बाड़े उठा उपयोग करने से पहले उठा उपकरण नसबंदी.
विभेदित क्षेत्रों निकालें. भेदभाव अक्सर एक HES सेल कॉलोनी के केवल एक हिस्से में होता है, आमतौर पर किनारों के साथ या केंद्र में अलग धब्बे के रूप में. केवल एक कॉलोनी का एक वर्ग फर्क है, तो, केवल विभेदित क्षेत्र निकालने की आवश्यकता. भेदभाव अक्सर एक में प्लेटों में उठा सकते हैं “चिपचिपा” चादर, और यह पहली पिकिंग उपकरण के अंत के साथ कॉलोनी के माध्यम से एक रेखा खींचने से कॉलोनी के बाकी हिस्सों से अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगी है.
एक बार जब कॉलोनी के टुकड़े अलग होती है, धीरे प्लेट के साथ पिकिंग उपकरण बहने अवांछित कोशिकाओं अलग करने. ध्यान इस प्रक्रिया में दूर कालोनियों के बीच MEF फीडर परत के बहुत ज्यादा स्क्रैप करने का नहीं ले लो.
विभेदित कोशिकाओं के सभी प्लेट से हटा दिया जाता है (और मध्यम में तैरते), जैविक सुरक्षा कैबिनेट में संस्कृति वापसी. विभेदित कोशिकाओं से युक्त मध्यम Aspirate और ताजा HES सेल संस्कृति माध्यम के साथ बदलें.

4. HES कक्ष passaging

एनजाइम ऊष्मायन
एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, 6-अच्छी तरह से संस्कृति डिश के ढक्कन को हटा दें और खर्च मध्यम aspirate से कुओं passaged हो. सीधे कुओं के अंदर से थाली के किसी भी भाग दूसरे को स्पर्श करने के लिए पिपेट की नोक की अनुमति न दें.
एक बाँझ कांच pipet का प्रयोग, जोड़ना 1 प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए गरम कोलैजिनेज़ चतुर्थ के एमएल passaged हो.
के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटें 5 मिनट.
स्क्रैप करना और HES कक्ष पूलिंग

कोलैजिनेज़ साथ कोशिकाओं विकासशील बाद, खुर्दबीन के नीचे कालोनियों का निरीक्षण. एंजाइम कॉलोनी किनारों में एक सूक्ष्म लेकिन नमूदार परिवर्तन के कारण जाना चाहिए.
जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक से एंजाइम aspirate और के साथ बदलें 2.0 एमएल HES सेल संस्कृति माध्यम.
आप की ओर थोड़ा संस्कृति प्लेट युक्ति और समय लग 2.0 एक साथ पहली बार अच्छी तरह से में एमएल मध्यम 5 एमएल कांच pipet.

प्लेट के नीचे करने के pipet होल्डिंग सीधा, धीरे अच्छी तरह से भर में pipet टिप में बहने जबकि धीरे धीरे मध्यम रिहा.
scraping और pipetting गति दोहराएँ 3-4 कालोनियों के सभी जब तक बार अच्छी तरह से हटा दिया गया है. Pipet धीरे टुकड़े की बहुत छोटा में कालोनियों को तोड़ने से बचने के लिए. कोशिकाओं को पहले अच्छी तरह से हटा दिया गया है जब, अच्छी तरह से में सामग्री को छोड़ दें और अगले अच्छी तरह से दूर कोशिकाओं scraping शुरू.

जब कुओं के सभी passaged हो स्क्रैप किया गया है, मध्यम पूल एक बाँझ में प्रत्येक अच्छी तरह से कॉलोनी टुकड़ों से युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब.
जोड़कर स्क्रैप कुओं कुल्ला 1 प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए HES सेल संस्कृति माध्यम के एमएल. इस कुल्ला को एकत्र करें और शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण.

ट्यूब में धीरे pipet कोशिकाओं वांछित आकार तक कॉलोनी टुकड़े को तोड़ने के लिए.
के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र 5 पर मिनट 200 एक्स जी.

HES सेल कोशिकाओं प्लेटिंग

HES कोशिकाओं अपकेंद्रित्र में होने के दौरान, एक नया 6 अच्छी तरह से MEF फीडर प्लेट तैयार. उपयुक्त HES सेल जानकारी के साथ प्लेट लेबल करें: कोशिका की परत, नए मार्ग संख्या, और पारित होने की तारीख. कुओं से MEF मध्यम Aspirate और जोड़ने 1.0 एमएल पीबीएस प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए. धीरे कुओं के आसपास बफर घुमाना और पीबीएस धोने aspirate. जोड़ना 1.5 प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एमएल HES सेल संस्कृति माध्यम और थाली अलग सेट.

HES कोशिकाओं centrifuging खत्म कर रहे हैं, ट्यूब जैविक सुरक्षा कैबिनेट में वापस लाने. सतह पर तैरनेवाला aspirate, शिथिल पैक सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.
के लिए पर्याप्त माध्यम के साथ गोली में कोशिकाओं Resuspend 1 एमएल जब HES अच्छी तरह से प्रति सेल संस्कृति मध्यम प्लेटेड जा करने के लिए. जब में विभाजित 6 नए कुओं, में गोली resuspend 6 एमएल मध्यम.

धीरे और समान रूप से जोड़ने 1 MEF फीडर प्लेट में से प्रत्येक के लिए तैयार अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन की एमएल.
प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और ध्यान से वापस करने के लिए आगे थाली स्लाइड, और पक्ष समान रूप से अच्छी तरह से भर में कोशिकाओं को वितरित करने के पक्ष को.
कोशिकाओं रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर संलग्न करने के लिए अनुमति दें.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

Undifferentiated HES कोशिकाओं छोटे हैं, अच्छे से बंधा हुआ, और आमतौर पर बड़े से मिलकर बनता है, अधिक फैला कोशिकाओं.

विभिन्न morhopologies खुर्दबीन के नीचे कम आवर्धन के तहत देखा जा सकता है. एक अच्छा सेल आकृति विज्ञान छोटे होते हैं, कसकर पैक कोशिकाओं है कि एक monolayer में विकसित. कोशिकाओं स्वच्छ होना चाहिए, परिभाषित किनारों, के साथ कोई भेदभाव करने के लिए कम.

जब HES कोशिकाओं के साथ काम करने बाँझपन हर समय बनाए रखा जाना चाहिए. स्वच्छ और जैविक सुरक्षा कैबिनेट नसबंदी और उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों.

सभी अभिकर्मकों एक का उपयोग कर फ़िल्टर किया जाना चाहिए 0.22 सुक्ष्ममापी छेद के आकार फिल्टर का उपयोग करने से पहले. HES सेल संस्कृति में antiboiotics के उपयोग आवश्यक नहीं है और बचा जाना चाहिए.

 

एक अलग वातावरण एक नामित पिकिंग स्टेशन के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए. स्टेशन के लिए बाँझ बाड़े एक स्थिर बाड़े हो सकता है (इस तरह के एक पीसीआर कार्य केंद्र के रूप में) एक यूवी प्रकाश स्रोत के साथ, लामिना का प्रवाह हुड, या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट.

पिकिंग स्टेशन के अंदर एक चीर-फाड़ माइक्रोस्कोप कालोनियों का निरीक्षण करने की जरूरत है के रूप में अलग-अलग क्षेत्रों निकाल दिए जाते हैं. एक स्थिर बाड़े या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के सामने कांच पैनल उचित हवा का प्रवाह और बाँझपन समझौता किए बिना माइक्रोस्कोप पैनल के माध्यम से विस्तार करने के लिए के oculars के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए.

स्वस्थ HES सेल संस्कृतियों बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं इष्टतम समय में passaged किया जाना चाहिए, आम तौर पर हर 4-7 दिन. इस समय कालोनियों उनके अधिकतम आकार तक पहुँच चुके हैं और मर्ज करने के लिए शुरू किया जा सकता है. मर्ज किए गए कालोनियों संस्कृति में भेदभाव की दर में वृद्धि कर सकते हैं. स्प्लिट अनुपात आम तौर पर बीच आती हैं 1:3 तथा 1:5, प्लेटेड कालोनियों की संख्या के आधार पर, विस्तार की दर, और संस्कृति की स्थिति.

Overplated कालोनियों (विभाजन अनुपात बहुत कम है) संभावना समय से पहले विलय और होगा passaged जाने की जरूरत है इससे पहले कि वे अपने अधिकतम आकार तक पहुँचने.

एक MEF फीडर परत है कि तुलना में अधिक है पर संस्कृति 2 सप्ताह का नया MEFs कि एक समान विकास और प्रसार का समर्थन करेंगे करने पर passaged किया जाना चाहिए.

के बाद से भेदभाव स्वाभाविक रूप से HES सेल संस्कृतियों में होता है, एक छोटी राशि की उम्मीद है. बार-बार या अत्यधिक भेदभाव हो सकता है अगर संस्कृतियों उचित देखभाल प्राप्त नहीं होता है. कोशिकाओं हर दिन खिलाया जाना चाहिए, मार्ग के बीच अतिवृद्धि से बचा जाना चाहिए. हमेशा ताजा अभिकर्मकों का उपयोग.

मीडिया के सभी, MEFs और अभिकर्मकों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए 14 दिन एक समान HES सेल विकास से बचने के लिए. अभिकर्मकों की नई बहुत सारे, इस तरह के नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट के रूप में, एफबीएस और MEFs, जांच की जानी चाहिए उपयोग करने से पहले. याद रखें कि किसी भी विभेदित कोशिकाओं से हटाया नहीं passaging से पहले नई संस्कृतियों को हस्तांतरित किया जाएगा.

भी, 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखने के लिए जब भी संभव कोशिश. समय कोशिकाओं इनक्यूबेटर के बाहर वाले खर्च को कम (उदाहरण के लिए:. खुर्दबीन मंच पर या जैविक सुरक्षा कैबिनेट में।) एक गर्म खुर्दबीन मंच बहुत फायदेमंद हो सकता है अगर कोशिकाओं समय की विस्तारित अवधि के लिए इनक्यूबेटर का हो जाएगा.

जब खुर्दबीन के नीचे HES सेल संस्कृतियों के अवलोकन, पहले समग्र गुणवत्ता और कालोनियों के आकार का आकलन एक कम बिजली का उपयोग कर देख (2एक्स या 5x) लक्ष्य. संभावित विभेदित कोशिकाओं कम बिजली पर मनाया जाता है, तो, विभेदित आकृति विज्ञान एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग कर इस बात की पुष्टि (10एक्स).

 


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