स्पेसफ्लाइट सक्रिय प्रोटीन kinase सी अल्फा सिग्नलिंग और मानव नवजात हृदय पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का विकास मंच संशोधित करता है

 

अंतरिक्ष यात्रियों में स्पेसफ्लाइट प्रभावों हृदय समारोह; तथापि, हृदय विकास और स्टेम सेल कि हृदय की मरम्मत के लिए आधार के रूप में पर इसके प्रभाव अज्ञात है. तदनुसार, आगे अनुसंधान मानव स्वास्थ्य के लिए इस तरह के बदलाव की क्षमता प्रासंगिकता को उजागर करने की जरूरत है. नकली microgravity का उपयोग करना (SMG) दो आयामी clinorotation और संस्कृति अंतर्राष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन पर द्वारा उत्पन्न (आईएसएस), हम मानव नवजात हृदय पूर्वज सेल पर यांत्रिक उतराई के प्रभाव का आकलन किया (सीपीसी) विकास गुण और संकेतन. SMG के बाद 6-7 दिन और 12 आईएसएस संस्कृति का दिन, हम जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण किया. दोनों वातावरण है कि आम तौर हृदय विकास के पहले के एक राज्य के साथ जुड़े रहे जीनों की अभिव्यक्ति प्रेरित. व्यवस्था है जिसके द्वारा इस तरह के बदलाव हुआ समझने के लिए, हम SMG-सुसंस्कृत सीपीसी में mechanosensitive छोटे RhoGTPases की अभिव्यक्ति का आकलन किया और कहा की कमी हुई RhoA और Cdc42 के स्तर. intracellular कैल्शियम के स्तर पर इन अणुओं के प्रभाव को देखते हुए, हम noncanonical Wnt / कैल्शियम संकेतन में परिवर्तन का मूल्यांकन. SMG तहत 6-7 दिनों के बाद, सीपीसी को WNT5A और PRKCA के बढ़े स्तर का प्रदर्शन किया. उसी प्रकार, आईएसएस-सुसंस्कृत सीपीसी को कैल्शियम से निपटने के बढ़े स्तर के और संकेत जीन का प्रदर्शन किया, जो प्रोटीन kinase सी अल्फा के अनुरूप था (PKCα), एक कैल्शियम पर निर्भर प्रोटीन kinase, सक्रियण के बाद 30 दिन. AKT सक्रिय किया गया था, जबकि फॉस्फोरिलेटेड बाह्य संकेत विनियमित काइनेज स्तरों अपरिवर्तित रहे. नवजात सीपीसी में कैल्शियम प्रेरण के प्रभाव का पता लगाने के, हम PKCα पृथ्वी पर hWnt5a उपचार का उपयोग करके सक्रिय. इसके बाद, जल्दी हृदय विकास मार्कर के स्तर बढ़े हुए थे. SMG और hWnt5a उपचार से प्रेरित टेप सिनोट्रायल नोड के भीतर व्यक्त कर रहे हैं, इसके आदिम राज्य में बनाए रखा भ्रूण मायोकार्डियम का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं जो. कैल्शियम संकेतन यांत्रिक उतराई के प्रति संवेदनशील है और सीपीसी विकास गुण का निर्देशन. दोनों अंतरिक्ष में और पृथ्वी पर और अधिक शोध की मदद कर सकते स्टेम सेल आधारित उपचार करने में सीपीसी की उपयोग को बेहतर बनाने और विकास की आणविक घटनाओं पर प्रकाश डाला.

परिचय
मानव जाति अंतरिक्ष में एक विस्तारित उपस्थिति के लिए तैयार करता है के रूप में, microgravity की आणविक प्रभाव (एमजी) तेजी से जांच का विषय बन गए हैं. के रूप में इस शोध विकसित किया गया है, एमजी के आवेदन, चाहे असली या नकली, यहाँ पृथ्वी पर संभावित चिकित्सकीय प्रयोग के लिए पाया गया है [1-3]. इस प्रकार, कम गुरुत्वाकर्षण की स्थिति के लिए जैविक प्रतिक्रिया चिह्नित करने के लिए प्रयासों को, एक आण्विक स्तर पर सहित, दोनों अंतरिक्ष में और पृथ्वी पर समाज को लाभ होगा.

हमारे अपने प्रयोगशाला में अनुसंधान कि नकली microgravity ने दिखा दिया है (SMG) प्रभावों मानव हृदय पूर्वज कोशिकाओं के विकास के प्रोफ़ाइल (सीपीसी को) एक उम्र पर निर्भर ढंग से [4]. सुहावना होते हुए, उन प्रयोगों सिस्टम नवजात सीपीसी में SMG वातावरण से प्रभावित में से कुछ होने के रूप में छोटे RhoGTPases और WNT सिगनल पहचान में माइक्रोएरे विश्लेषण.

मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं पर यांत्रिक उतराई का असर (mESCs) भेदभाव और stemness प्रभाव को दिखाया गया है, Blaber एट अल द्वारा प्रयोगों के साथ. [5] प्रदर्शन embryoid निकायों को बनाए रखने कि आत्म नवीकरण और प्रदर्शन के मार्करों निश्चित रोगाणु परत मार्कर अभिव्यक्ति कम जब अंतरिक्ष में भेजा. तथापि, इसी अध्ययन में, जब यंत्रवत् उतार embryoid निकायों पृथ्वी पर लौट आए, वे सिकुड़ा cardiomyocyte उपनिवेशों में और अधिक आसानी से अलग करने के लिए सक्षम थे. उसी प्रकार, झा एट अल. [6] कि मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल और अधिक आसानी से तीन आयामी संस्कृति का उपयोग कर cardiomyocytes क्षणिक के साथ मिलकर में भेद पाया, SMG के लिए जल्दी जोखिम.

ये अलग प्रयोगों के लिए एक समान घटना है जिसमें एक कम गुरुत्वाकर्षण संस्कृति SMG या एमजी कि वृद्धि की भेदभाव की क्षमता में परिणाम है जब कोशिकाएं सामान्य गुरुत्वाकर्षण की स्थिति को लौटा दिया जाता है के तहत stemness का एक उन्नत राज्य को बढ़ावा देता है प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. इस प्रकार, हृदय की मरम्मत के लिए प्रासंगिक स्टेम सेल चिकित्सा हृदय पूर्वज में यांत्रिक संकेतन के लिए प्रासंगिक तंत्र से छेड़छाड़ द्वारा सुधार किया जा सकता है. विशेष रूप से, हृदय पूर्वज में बढ़ाया stemness उत्प्रेरण प्रत्यारोपण पर एक तदनुसार बढ़ाया नैदानिक ​​प्रभाव की सुविधा हो सकती है.

यांत्रिक संवेदन अणुओं में बदलाव, ऐसे छोटे RhoGTPases के रूप में, एमजी के लिए आणविक अनुकूलन में शामिल होने का विश्वास कर रहे हैं [7,8]. महत्वपूर्ण बात, इन अणुओं भी intracellular संकेत दे रास्ते को प्रभावित करने में सक्षम हैं, जैसे कैल्शियम दोलनों के रूप में, जो बाद में AKT सक्रिय कर सकते हैं [9] और बाह्य संकेत विनियमित काइनेज (ERK) [10]. कार्डियोजेनेसिस के संदर्भ में, इन प्रक्रियाओं आगमनात्मक और प्रजनन-शील संकेतों के बीच एक संतुलन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं [11,12]. इसलिये, जल्दी सीपीसी की सामान्य गुरुत्वाकर्षण पर्यावरण से छेड़छाड़ महत्वपूर्ण तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है जिसके द्वारा जल्दी हृदय पूर्वज को विकसित करने या विस्तार. आधारित सेल पुनर्योजी चिकित्सा के इस तरह के अंतर्दृष्टि आगे हृदय विकास को समझते हैं और स्टेम के परिणामों को बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता.

हृदय की मरम्मत के संदर्भ में, उपचार के इन प्रकार के प्रारंभिक क्लिनिकल परीक्षण का वादा कर रहे हैं [13-15], लेकिन उचित प्रकार की कोशिका से अधिक सेल engraftment और विवाद का एक विफलता से stymied रहे हैं [16]. इसलिये, पृथ्वी-आधारित प्रयोगों के लिए एमजी प्रयोगों से निष्कर्ष के आवेदन में मदद मिल सकती वर्तमान चिकित्सीय हृदय की मरम्मत के लिए सीपीसी को के उपयोग से जुड़े परीक्षणों की कमियों पर काबू पाने.

जल्दी सीपीसी की आबादी पर दोनों एमजी के प्रभाव को चिह्नित करने के प्रयास के साथ-साथ पृथ्वी पर इन परिवर्तनों के संभावित उपयोग में, हम एक दो आयामी clinostat और राष्ट्रीय प्रयोगशाला में अंतर्राष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन पर का उपयोग कर नवजात मानव सीपीसी को संवर्धित (आईएसएस). हम SMG और एमजी के जवाब के साथ-साथ stemness पर इस तरह के संकेत परिवर्तन के प्रभावों में संकेत में शामिल जीनों के प्रतिलेखन में परिवर्तनों की पहचान करने की मांग की. हम तो सामान्य गुरुत्वाकर्षण परिस्थितियों में एक छोटे अणु का उपयोग कर इन विट्रो में इन आणविक परिवर्तन की सुविधाओं मॉडलिंग. ऐसा करने में, हम नवजात सीपीसी की पुनर्योजी क्षमता को बढ़ाने के लिए एमजी और उनके प्रभाव को अनुकूल सेलुलर प्रतिक्रिया के घटकों पेश.

सामग्री और तरीके
अलगाव और जल्दी सीपीसी की संस्कृति
लोमा लिंडा विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड ऊतक के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल है कि हृदय शल्य चिकित्सा के दौरान हटा दिया गया अनुमोदित, पहचान योग्य निजी जानकारी के बिना, सूचित सहमति की छूट के साथ इस अध्ययन के लिए. सीपीसी को नवजात शिशुओं के हृदय ऊतक से पृथक किया गया (1 दिन-1 महीने), पहले से वर्णित के रूप में [17]. संक्षिप्त, आलिंद ऊतक छोटे गुच्छों में काट दिया गया था (~ 1.0 mm3) और फिर enzymatically कोलैजिनेज़ का उपयोग कर पचा (रॉश, इंडियानापोलिस, में) 1.0 मिलीग्राम की एक काम कर रहे एकाग्रता / एमएल पर. जिसके परिणामस्वरूप समाधान तो एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पारित किया गया था. कोशिकाओं एक 96 अच्छी तरह से थाली में की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कमजोर पड़ने सीमित करके क्लोन किया गया 0.8 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के विस्तार के लिए आबादी बनाने के लिए.

फिर, क्लोन Isl1 और सी किट के Coexpression के लिए जांच की और विकास मीडिया शामिल के साथ पूरक थे 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (थर्मो वैज्ञानिक, Waltham, एमए), 100माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (जीवन टेक्नोलॉजीज, Carlsbad, सीए), 1.0% न्यूनतम आवश्यक मध्यम अनावश्यक अमीनो एसिड समाधान (जीवन टेक्नोलॉजीज), तथा 22% endothelial कोशिकाओं की वृद्धि मीडिया (Lonza, बेसल, स्विट्जरलैंड) मध्यम में 199 (जीवन टेक्नोलॉजीज). MycoAlert प्लस माइकोप्लाज्मा जांच किट (Lonza, बेसल, स्विट्जरलैंड) माइकोप्लाज़्मा संदूषण के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था

 

 

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