Spaceflight Protéine Kinase C Active Alpha Signaling et modifie le stade de développement de cellules progénitrices cardiovasculaire néonatale humaine

 

impacts spaceflight la fonction cardiovasculaire chez les astronautes; toutefois, son impact sur le développement cardiaque et les cellules souches qui forment la base pour la réparation cardiaque est inconnue. En conséquence, d'autres recherches sont nécessaires pour découvrir la pertinence potentielle de ces changements pour la santé humaine. L'utilisation microgravité simulée (SMG) généré par clinorotation à deux dimensions et de la culture à bord de la Station spatiale internationale (ISS), nous avons évalué les effets de déchargement mécanique sur progéniteurs cardiovasculaires néonatale humaine (CPC) propriétés de développement et de signalisation. Suite à 6-7 jours de SMG et 12 jours de culture ISS, nous avons analysé les changements dans l'expression des gènes. Les deux environnements induit l'expression des gènes qui sont généralement associés à un état antérieur du développement cardiovasculaire. Pour comprendre le mécanisme par lequel ces changements sont survenus, nous avons évalué l'expression de petites RhoGTPases dans le SCPC SMG mécano-culture et observé une diminution du taux de RHOA et CDC42. Compte tenu de l'effet de ces molécules sur les niveaux de calcium intracellulaire, nous avons évalué les changements dans noncanonical Wnt / signalisation de calcium. Après 6-7 jours sous SMG, Présentaient des taux élevés CPC de WNT5A et PRKCA. De même, ISS-culture CPC présentaient des niveaux élevés de manipulation de calcium et les gènes de signalisation, ce qui correspond à la protéine kinase C alpha (PKCa), une protéine kinase dépendante du calcium, activation après 30 journées. Akt a été activé, tandis que les niveaux de kinase régulée par des signaux extracellulaires-phosphorylés sont restés inchangés. Pour explorer l'effet de l'induction de calcium dans le SCPC néonatale, nous avons activé PKCa en utilisant un traitement hWnt5a sur Terre. Par la suite, premiers niveaux de marqueurs de développement cardiovasculaire étaient élevés. Transcriptions induites par SMG et hWnt5a traitements sont exprimés dans le noeud sino-auriculaire, qui peut représenter le myocarde embryonnaire maintenu dans son état primitif. la signalisation de calcium est sensible au déchargement mécanique et dirige les propriétés de développement CPC. Des recherches plus approfondies dans l'espace et sur la Terre peut aider à affiner l'utilisation des thérapies dans les CPC à base de cellules souches et mettre en évidence les événements moléculaires du développement.

introduction
Comme l'humanité se prépare à une présence accrue dans l'espace, les effets de la microgravité moléculaires (MG) sont de plus en plus l'objet d'une enquête. Comme cette recherche a évolué, l'application de MG, réelles ou simulées, a été constaté que l'utilisation thérapeutique potentielle sur Terre [1-3]. Ainsi, les efforts visant à caractériser la réponse biologique à des conditions de gravité réduite, y compris à un niveau moléculaire, profitera à la société à la fois dans l'espace et sur Terre.

La recherche dans notre propre laboratoire a montré que la microgravité simulée (SMG) impacts du profil du développement de cellules progénitrices humaines cardiovasculaires (CPC) d'une manière dépendant de l'âge [4]. Il est intéressant de, l'analyse des microréseaux dans ces expériences identifiées et petites RhoGTPases signalisation Wnt comme certains des systèmes affectés par l'environnement SMG dans le SCPC néonatale.

L'effet de déchargement mécanique sur les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs) a été démontré un impact sur la différenciation et stemness, avec des expériences de Blaber et al. [5] ce qui démontre que des corps embryoïdes conservent des marqueurs d'auto-renouvellement et présentent une expression réduite du marqueur de la couche de germe définitive lorsqu'il est déployé dans l'espace. toutefois, dans les mêmes études, lorsque les corps embryoïdes mécaniquement déchargés retour sur Terre, ils ont pu différencier plus facilement dans les colonies de cardiomyocytes contractiles. De même, Jha et al. [6] ont découvert que les cellules souches pluripotentes humaines induites se différencient en cardiomyocytes plus facilement à l'aide de culture en trois dimensions couplée à transitoire, exposition précoce à la SMG.

Ces expériences distinctes peuvent représenter un phénomène similaire dans lequel une culture à faible gravité favorise un état amélioré de stemness sous SMG ou MG qui se traduit par la capacité de différenciation accrue lorsque les cellules sont renvoyées à des conditions normales de gravité. Ainsi, les thérapies de cellules souches pertinentes pour la réparation cardiaque peut être améliorée en manipulant les mécanismes pertinents pour la signalisation mécanique dans les progéniteurs cardiovasculaires. En particulier, induisant stemness amélioré dans les progéniteurs cardiovasculaires peut faciliter un effet clinique sur la transplantation en conséquence améliorée.

Les modifications dans les molécules de détection mécaniques, tels que les petits RhoGTPases, sont soupçonnés d'être impliqués dans l'adaptation moléculaire à MG [7,8]. Il est important, ces molécules sont également en mesure d'avoir un impact des voies de signalisation intracellulaire, tels que les oscillations de calcium, qui peut ensuite activer AKT [9] et extracellulaire signal régulé kinase (ERK) [10]. Dans le contexte de la cardiogenèse, ces processus sont essentiels pour le maintien d'un équilibre entre les signaux inductifs et proliferatives [11,12]. Donc, la manipulation de l'environnement de gravité normal de mettre en évidence début mai CPC des mécanismes importants par lesquels progéniteurs cardiaques précoces établir ou élargir. Ces idées peuvent être appliquées pour mieux comprendre le développement cardiovasculaire et d'améliorer les résultats de base de cellules souches thérapies régénératives.

Dans le cadre de la réparation cardiaque, les premiers essais cliniques de ces types de thérapies sont prometteuses [13-15], mais sont contrecarrés par un échec de la greffe de cellules et la controverse sur le type de cellule appropriée [16]. Donc, l'application des résultats des expériences MG à des expériences basées sur la Terre peuvent aider à surmonter les insuffisances des essais cliniques en cours portant sur l'utilisation de la réparation cardiaque pour CPC.

Dans un effort pour caractériser les effets de MG sur une population de début et les CPC que l'utilisation potentielle de ces changements sur la Terre, nous néonatales humains mis en culture SCD en utilisant un clinostat à deux dimensions et dans le laboratoire national à bord de la Station spatiale internationale (ISS). Nous avons cherché à identifier les changements dans la transcription des gènes impliqués dans la signalisation en réponse à SMG et MG ainsi que les effets de ces changements de signalisation sur stemness. Nous caractéristiques de ces modélisé puis des changements moléculaires in vitro en utilisant une petite molécule dans des conditions normales de gravité. Ce faisant,, nous présentons des composants de la réponse cellulaire adaptative à MG et leurs implications pour améliorer le potentiel de régénération des nouveau-nés SCD.

Matériaux et méthodes
L'isolement et la culture de début CPC
La Commission de révision institutionnelle de l'Université Loma Linda a approuvé le protocole d'utilisation du tissu qui a été mis au rebut lors de la chirurgie cardio-vasculaire, sans informations privées identifiables, pour cette étude avec une renonciation du consentement éclairé. SCD ont été isolés à partir de tissu cardiaque de nouveau-nés (1 jour 1 mois), comme décrit précédemment [17]. Brièvement, le tissu auriculaire a été coupé en petits bouquets (~ 1.0 mm 3) puis digéré par voie enzymatique à l'aide de collagénase (Roche, Indianapolis, DANS) à une concentration de travail de 1,0 mg / mL. La solution résultante a été ensuite passé à travers un tamis cellulaire de 40 um. Les cellules ont été clonées dans une plaque à 96 puits en limitant la dilution à une concentration finale de 0.8 cellules par puits pour créer des populations d'expansion.

alors, Les clones ont été criblés pour la coexpression de Isl1 et c-Kit et complétées avec un milieu de croissance comprenant 10% de sérum bovin fœtal (Thermo Scientific, Waltham, MA), 100ug / ml de pénicilline-streptomycine (Life Technologies, Carlsbad, Californie), 1.0% minimum essentiel moyen solution d'acides aminés non essentiels (Life Technologies), et 22% milieu de croissance des cellules endothéliales (Lonza, Bâle, Suisse) en moyenne 199 (Life Technologies). Le MycoAlert PLUS Kit de détection Mycoplasma (Lonza, Bâle, Suisse) a été utilisé pour tester la contamination par des mycoplasmes

 

 

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