Macrophage dérivé extracellulaires Succinate Licences cellules neurales souches à Neuroinflammation chronique Supprimer

 

Points forts
• NSCs de tissus somatiques ou répriment également directe reprogrammation neuroinflammation
• succinate extracellulaires active SUCNR1 / GPR91 sur NNC
• NSCs Activated sécrètent PGE2 et piègent succinate, le type ainsi reprogrammation 1 Les députés
• mutant Sucnr1 NNC ont réduit l'activité anti-inflammatoire après transplantation
Résumé
cellules souches neurales (NSC) la transplantation peut influencer les réponses immunitaires et supprimer l'inflammation dans le système nerveux central. métabolites, tels que le succinate, moduler le phénotype et la fonction des cellules immunitaires, mais si et comment NSCs sont également activés par des immunometabolites pour contrôler les réponses inflammatoires et immunoréactivité est peu claire. Ici, nous montrons que somatiques transplantés et directement induite NSCs une inflammation chronique du système nerveux central améliorent en réduisant les niveaux succinate dans le liquide céphalorachidien, diminuant ainsi phagocytes mononucléaires (MP) infiltration et les dommages du système nerveux central secondaire. Les députés inflammatoires libèrent succinate, ce qui active le récepteur de succinate 1 (SUCNR1)/GPR91 sur NNC, les amenant à sécréter la prostaglandine E2 et scavenge succinate extracellulaire avec des effets anti-inflammatoires consécutifs. Ainsi, notre travail révèle un rôle inattendu pour l'axe succinate-SUCNR1 dans les cellules somatiques et NSCs directement induite, qui contrôle la réponse des cellules souches à des signaux métaboliques inflammatoires libérés par type 1 Les députés dans le cerveau une inflammation chronique.

introduction
Les progrès de la biologie des cellules souches ont fait naître l'espoir que les maladies du système nerveux central peuvent être améliorés par des médicaments de cellules souches non-hématopoïétiques (Martino et Pluchino, 2006). Nous avons fourni des preuves convaincantes que la transplantation de cellules souches neurales somatiques (NNC) améliore les caractéristiques clinico-pathologiques des modèles animaux de maladies inflammatoires du système nerveux central. Au-delà du remplacement structurel des cellules du SNC blessés, notre travail a montré que NNC transplantées se livrent à la tige complexes des programmes de communication du greffon à l'hôte cellulaire, premier ensemble de support trophique et la modulation des réponses immunitaires innées et adaptatives (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino et Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009b). Plus précisément, NSC les transplantations réduisent la charge de l'inflammation au site de la lésion (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009une), diminuer le nombre de type 1 phagocytes inflammatoires mononucléaires (Les députés) (Cusimano et al., 2012), et favoriser la guérison du système nerveux central blessé par des mécanismes encore mal caractérisés.

toutefois, la traduction clinique des thérapies expérimentales NSC est encore limitée par les sources dont NSCs humaines (hNSCs) sont dérivés (Anderson et al., 2017), l'immunogénicité intrinsèque des lignées allogéniques HNSC (Ramos-Zuniga et al., 2012, Rice et al., 2013), et la stabilité de la soi-disant « lot de cellules clinique destinée » (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). Autologue et de manière stable expansibles directement induites NSCs (iNSCs) à partir des fibroblastes dermiques des patients émergent comme une alternative valable aux thérapies NSC (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). La reprogrammation directe dans iNSCs évite la progression laborieuse dans un état pluripotent et la différenciation ultérieure en lignées souhaitées décrites pour les cellules souches pluripotentes induites (IPSC) La technologie (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Donc, faire iNSCs de manière stable expansibles partir de cellules somatiques représente le moyen le plus possible d'obtenir des cellules souches du cerveau autologues pour des applications cliniques en aval (Wörsdörfer et al., 2013). toutefois, l'efficacité de iNSCs directement reprogrammé dans le traitement des troubles inflammatoires du système nerveux central n'a pas encore été testé.

Dans les formes progressives de la sclérose en plaques (MME), l'inflammation chronique du système nerveux central est soutenue par une activation généralisée des députés qui comprennent à la fois la microglie résidente du système nerveux central et dérivé monocytes-macrophages infiltrant (Mallucci et al., 2015). Les députés se trouvent dans les lésions de la matière grise, près de dégénérant axones et les corps cellulaires neuronaux (Peterson et al., 2001), et dans les lésions de la substance blanche, où le bord externe de la microglie activée est associée à une lésion tissulaire chronique (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Domaines de la substance blanche normale qui apparaissent sont également caractérisés par une accumulation MP, ce qui conduit à la formation de nodules microgliales qui entraînent la pathologie de la maladie, indépendamment de l'activation des lymphocytes T concomitant (Moll et al., 2011). Le rôle néfaste de l'inflammation chronique conduit MP dans la SP progressive est également étayée par des preuves dans les modèles de maladies animales, où sa charge globale est en corrélation avec la fonction neuronale altérée (Planche et al., 2017), atrophie cérébrale (Tambalo et al., 2015), et la réduction des réactions de régénération (Jiang et al., 2014).

L'activation des députés par des stimuli pro-inflammatoire provoque un commutateur métabolique vers glycolyse et réduit la phosphorylation oxydative (OXPHOS) (Kelly et O'Neill, 2015). Des données récentes suggèrent que, dans ce recâblage métabolique, type 1 PM inflammatoires accumulent succinate, avec d'importantes implications physiopathologiques (Tannahill et al., 2013). succinate inhibe l'activité intracellulaire de prolyl hydroxylases enzymes (PHD), stabilisant ainsi l'élément sensible à l'hypoxie (HIF)-1a et l'induction de la transcription de l'interleukine (IL)-1b (Tannahill et al., 2013). en outre, oxydation du succinate par la succinate déshydrogénase (SDH) repurposes mitochondries de la synthèse d'ATP aux espèces réactives de l'oxygène (ERO) production en tant que signal pro-inflammatoire supplémentaire (Mills et al., 2016). Type 1 MP inflammatoires libèrent également extracellulaire succinate et régulent positivement son récepteur apparenté succinate de 1 (SUCNR1), un récepteur couplé à la protéine G (également connu sous le nom GPR91), qui fonctionne comme capteur paracrine et autocrine pour améliorer la production d'IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).

En tant que tel, le métabolisme est en train d'émerger comme une cible thérapeutique importante pour moduler l'activation des deux macrophages (Kelly et O'Neill, 2015) et microglies (Orihuela et al., 2016), et les voies associées succinate ont des fonctions clés modulateurs immunitaires pour les maladies inflammatoires aiguës et chroniques (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).

Compte tenu des propriétés immunomodulateurs établies de NNC (Pluchino et Cossetti, 2013), nous avons supposé que NNC peut exercer leurs effets thérapeutiques dans la neuro-inflammation chronique en modulant le métabolisme MP vers la réduction des dommages secondaires du système nerveux central.

Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la capacité de NNC somatiques et directement induits pour contrer les changements métaboliques de type 1 PM inflammatoires à la fois in vivo et in vitro. Nous montrons que iNSCs transplantées et NNC sont fonctionnellement équivalents dans la neuro-inflammation chronique dans l'amélioration des souris avec encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Transplantées iNSCs / NSCs basculer dans le profil d'activation de la microglie CNS-résidente et des monocytes-macrophages dérivés infiltrant vers un phénotype anti-inflammatoire, ainsi que de réduire les niveaux du succinate immunometabolite dans le liquide céphalorachidien (CSF). iNSCs / NSCs diminuent également succinate extracellulaire libéré par type 1 Les députés inflammatoires à leur métabolisme vers reprogramment OXPHOS in vitro. de façon mécaniste, nous montrons que succinate sécrétée par le type 1 Les députés en iNSCs suscite / NSCs une cascade de signalisation en aval SUCNR1, qui permet à leur activité anti-inflammatoire. Cette fonction anti-inflammatoire autorisé succinate de iNSCs / NSCs est médiée par la sécrétion de prostaglandine (PG) E2, ainsi que par balayage considérable de succinate extracellulaire. La perte de fonction Sucnr1 dans NSCs conduit à réduire de façon significative les activités anti-inflammatoires in vitro et in vivo après transplantation dans l'EAE.

Notre étude révèle un axe succinate-SUCNR1 qui précise comment NSCs réagissent aux signaux métaboliques inflammatoires pour inhiber l'activation de Type 1 Les députés de la neuro-inflammation chronique.

Résultats
NSC transplantation chronique et Neuroinflammation améliore est associée à la réduction de la Immunometabolite Succinate dans le liquide céphalorachidien
Nous avons d'abord évalué les effets de la intracérébroventriculaire (ICV) transplantation au pic de la maladie (PD) de iNSCs ou NSCs chez des souris atteintes d'EAE chronique induite par MOG35-55 et comparée à des souris EAE témoin traité avec PBS. Avant la transplantation, iNSCs et NNC ont été élargies, caractérisé (Figure S1), et étiquetés avec farnésyle (F)GFP in vitro. À 30 jours après la transplantation (récupérable), greffes INSc et NSC ont survécu, distribué, et intégré dans le cerveau et la moelle épinière EAE (Figure S2). Seule une minorité de cellules FGFP récupérées + (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NNC: 1.7% ± 0.1%) se multipliaient (Figure 1A) ou l'expression neuronale (Figure 1B), astrocytes (Figure 1C), ou oligodendrocytes (Figure 1D) des marqueurs de la lignée (Figure S2). La majorité (% -75) des survivants iNSCs à la transplantation ont été trouvés au lieu de ne pas être l'expression l'un des marqueurs de la lignée de neurones testés et localisant autour des zones de niche comme méningés périvasculaires près de F4 / 80 + MP endogènes (Figure 1E), comme observé dans les greffes NSC somatiques (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). La transplantation de iNSCs induit une importante et de longue durée (Jusqu'à 90 récupérable) l'amélioration des scores EAE, qui a commencé à partir 15 à 20 dpt en avant (Les figures 1F et S2). La récupération fonctionnelle a également été confirmée par l'analyse de la démarche automatisée assistée par ordinateur (Figure S2). Global, iNSCs ICV-transplantées étaient sains et saufs et ont abouti à la récupération comportementale et pathologique.

Nous avons ensuite analysé la composition des infiltrats inflammatoires du système nerveux central par l'intermédiaire d'une cytométrie de flux ex vivo dans INSC- et NSC-transplanté par rapport au témoin traité avec du STP-souris EAE. La transplantation de iNSCs ou NNC n'a eu aucun effet sur la fraction du CNS-infiltrant les cellules T, Les cellules B, et le total des députés, ainsi que dans celle de CD3 + / CD4 + T sous-ensembles de cellules (y compris Th1, Th2, Treg, ThGM-CSF, et des sous-ensembles Th17) à 30 récupérable (Figure S3). Au lieu, NSC- ou des souris EAE-transplantés ont montré un commutateur NSC significative dans le profil de l'activation des cellules CX3CR1 + avec diminution de ~ 1,5 fois du CD80 + Type 1 microglie inflammatoires et une augmentation parallèle de la microglie MRC1 + anti-inflammatoire (Figure 1G). également, SNC-infiltrant (monocyte dérivé) CCR2 + macrophages de INSc- ou des souris EAE transplanté NSC a subi commutateur de phénotype significative avec diminution environ 1,3 fois du CD80 + Type 1 macrophages inflammatoires et parallèle augmentation de environ 1,8 fois des macrophages MRC1 + anti-inflammatoires (Figure 1 H). Cet effet a été accompagnée d'une réduction significative de l'expression du type 1 marqueur inflammatoire de MP synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS) par F4 / 80 + PM in vivo (Les figures 1I et S3).

Nous avons ensuite analysé les niveaux d'expression des principaux pro- et les gènes anti-inflammatoires dans l'ensemble du système nerveux central. NSC- et les souris transplantées NSC-EAE deux présentaient des taux significativement réduits d'interleukine-1 bêta (Il1b) dans le cerveau et la moelle épinière et des niveaux accrus de récepteur du mannose de type C 1 (MRc1) dans la moelle épinière, à la fois 10 récupérable (Figure 1J).

Nous avons trouvé aucune différence significative dans la barrière hémato-encéphalique (BBB) perméabilité à 30 dpt lorsque la comparaison iNSC- / NSC-transplantés avec témoin traité avec PBS souris EAE (Figure S3).

finalement, NSC- et les souris transplantées NSC-EAE accumulé significativement réduit la perte axonale (Figure 1K) et démyélinisation (Figure 1 L) dans la moelle épinière.

Compte tenu de l'importance du métabolisme établi dans la régulation du phénotype et la fonction des députés, nous avons examiné si les transplantations NSC ont affecté le microenvironnement métabolique neuroinflammatoire. À cette fin, nous avons réalisé un profilage métabolique non ciblé de métabolites polaires par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) des échantillons de LCR et le plasma appariés (Tableau S1). témoin traité avec PBS souris EAE a montré une augmentation significative de plusieurs CSF (mais pas de plasma) métabolites, parmi lesquels succinate seulement atteint un sommet 45 jours après la vaccination (dpi) (correspond à 30 récupérable; Figure 1 M). souris EAE non soumises à la chirurgie ont également montré une augmentation significative succinate que dans le LCR à 45 dpi (par rapport à des souris témoins en bonne santé), qui n'a pas été différent des niveaux de succinate dans les témoins traités avec du PBS-CSF souris EAE (Figure S3).

Alors que nous ne détectons aucun changement significatif du taux de métabolite plasmatique entre INSc / NSC-transplanté et de contrôle PBS-souris traitées EAE (Tableau S1), nous avons constaté que la transplantation de iNSCs ou NNC a conduit à une baisse significative du succinate de CSF à 30 récupérable (Figure 1 M; Tableau S1).

Plus loin, nous avons trouvé aucune différence significative dans succinate LCR lorsque l'on compare les souris PBS-traitées EAE par rapport à des souris EAE avec ICV injecté des fibroblastes de souris (MFS) comme les cellules témoins (Figure S3).

Ainsi, iNSCs et NSCs directement injectés dans le système nerveux central EAE induire un changement de phénotype spécifique de MP, qui est associée à une réduction du succinate de immunometabolite dans le LCR et que l'amélioration de la neuro-inflammation chronique.

NNC Réduire les niveaux et Succinate Reprogrammer le métabolisme de type 1 Mφ in vitro Inflammatory
Nous avons ensuite les mécanismes moléculaires par lesquels iNSCs / NSCs présentent des activités anti-inflammatoires sur le type 1 Les députés, en utilisant un système in vitro qui récapitule les interactions entre MP et iNSCs / NSCs. de moelle osseuse dérivées de macrophages Naive (Mφ) ont été polarisé dans un type 1 phénotype inflammatoire avec LPS (MφLPS), comme décrit (Tannahill et al., 2013). MφLPS ont ensuite été co-cultivées avec iNSCs (MφLPS-iNSCs) ou NNC (MφLPS-NSCs) dans un système trans-bien qui évite des contacts entre cellules (Figure 2A). Mφ non polarisée ont été utilisés comme témoins.

le profilage de l'expression du gène de biopuces a montré des changements de transcription importants dans MφLPS avec 7,401 les gènes affectés (par rapport Mφ; valeur ajustée de p < 0.1; Figure 2B; Tableau S2) et 51 gènes exprimés dans MφLPS-iNSCs ou MφLPS-NSCs (par rapport MφLPS; valeur ajustée de p < 0.1; Figures 2B et 2C; Tableau S2). Ce dernier ensemble de gènes a été enrichi dans les processus biologiques liés à la régulation positive de l'activation leucocytaire (ALLER: 0002696), la différenciation leucocytaire myéloïde (ALLER: 0002761), et les processus du système immunitaire (ALLER: 0002376). Validation indépendante qRT-PCR des gènes pro-inflammatoires Mφ sélectionnés a confirmé une régulation négative significative des niveaux d'expression de IL12B, IL15, Il15ra, et CD69, ainsi que les gènes inflammatoires classiques NOS2, facteur de nécrose tumoral (Tnf), et Il1b dans MφLPS-iNSCs et MφLPS-NSCs (par rapport MφLPS; La figure 2D). Cet effet a été couplé avec la régulation à la hausse concomitante des niveaux d'expression des gènes associés à un phénotype anti-inflammatoire Mφ, comme uronyl-2-sulfotransférase (paragraphe) et la moelle osseuse antigène de cellules stromales 1 (BST1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), ainsi que arginase 1 (arg1) et MRc1 (par rapport MφLPS; Figure 2E). Lorsque iNSCs / NNC ont été co-cultivées avec lipopolysaccharide (LPS)-activés cellules microgliales BV2 de la souris avant que, réduction significative des niveaux d'expression des gènes pro-inflammatoires et NOS2 Il1b a également été observée (Figure 2F).

Pour créer un lien profils d'expression génique avec des états métaboliques fonctionnels, nous avons évalué le taux de consommation d'oxygène de base (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de MφLPS que les lectures de leur acide tricarboxylique (TCA) les activités du cycle et de la glycolyse, respectivement. Nous avons constaté une réduction significative de l'OCR et une augmentation significative de ECAR en MφLPS (par rapport Mφs). Au lieu, MφLPS-iNSCs et MφLPS-NNC ont subi la restauration significative des valeurs OCR et ECAR (par rapport MφLPS; Les figures 2G et 2H), comme observé dans la commutation Mφ à un phénotype anti-inflammatoire (O'Neill et Pearce, 2016).

Dans un effort pour clarifier les déterminants métaboliques de ces effets anti-inflammatoires, nous avons effectué une analyse LC-MS untargeted de la teneur en métabolite petite molécule extracellulaire et intracellulaire de MφLPS. Comme prévu, la stimulation LPS a profondément changé le milieu extracellulaire et métabolique intracellulaire de Mφ (MφLPS) (par rapport Mφ; Tableau S3). En co-cultures, MφLPS-iNSCs et MφLPS-NSCs deux ont montré une réduction significative du glutamate extracellulaire, GABA, et succinate (par rapport MφLPS; Figure 2I; Tableau S3). en outre, MφLPS-iNSCs et MφLPS-NSCs affichent également une réduction significative du succinate intracellulaire et itaconate (par rapport MφLPS; Figure 2J; Tableau S3).

Conformément à la réduction des niveaux succinate, nous avons constaté que MφLPS-iNSCs et MφLPS-NSCs considérablement réduit les niveaux présentaient de HIF-1α, de la pyruvate kinase de la protéine en amont isozyme M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figure 2K), ainsi que de l'IL-1β (par rapport MφLPS; Figure 2L).

Tout à fait, ces données in vitro montrent que iNSCs / NSCs réduisent l'accumulation de deux succinate intracellulaire et extracellulaire dans des co-cultures de type 1 Les députés inflammatoires, les reprogrammation vers un phénotype anti-inflammatoire OXPHOS.

Les signaux via succinates SUCNR1 / GPR91 dans la souris et NSCs humaine
Compte tenu de l'importance du succinate en tant que signal immunometabolic, nous avons examiné si succinate libéré par type 1 PM pro-inflammatoires pourraient réguler l'activité des cellules environnantes in situ, y compris celle de iNSCs / NSCs transplanté.

Nous avons constaté que iNSCs transplantées / NNC détectés à proximité de méningée zones périvasculaires (Figures 3A et 3B ) et F4 / 80 + députés (La figure 3C) exprimé SUCNR1 in vivo dans le système nerveux central. SUCNR1 a également été exprimé au niveau des protéines sur les deux iNSCs et NSCs in vitro, mais pas dans MFS (Figure 3D).

Pour mieux évaluer si SUCNR1 dans iNSCs / NNC a été fonctionnellement activé par le succinate, nous avons étudié la cascade de signalisation en aval in vitro. Lorsqu'il est exposé à succinate (Figure 3E; Rubic et al., 2008), 34.2% (± 7,4%) de iNSCs et 31.7% (± 6,5%) de NNC a montré une libération de réserves de calcium intracellulaire (Les figures S4 et 3F). Cette réponse a été suivie d'une régulation positive significative de la phospho-p38 protéine kinase activée par mitogène (Figure 3G), indicative de son activation. Nous avons confirmé l'expression de SUCNR1 et SUCNR1 aussi dans NSCs foetus humain (hNSCs) et iNSCs humains (hiNSCs) (Les figures 3H et 3I). Comme dans iNSCs de souris, signalisation p38-dépendante succinate a été évoquée dans hiNSCs, mais pas dans hiNSCs pré-traitées avec l'inhibiteur sélectif SUCNR1 4c (Figure 3J).

Ainsi, iNSCs souris et de l'homme et de NNC expriment SUCNR1 fonctionnelle, ce qui induit une voie de signalisation en aval de sa stimulation avec le succinate de immunometabolite.

SUCNR1 stimulation Lance la sécrétion de prostaglandine E2 par NNC
Afin de clarifier les conséquences fonctionnelles de SUCNR1 de signalisation dans NSCs, nous avons généré des souris dépourvues de NNC Sucnr1 (Sucnr1 - / - NSCs) (Rubic et al., 2008; Figure S4). Par rapport à contrôler NSCs, Sucnr1 - / - NNC a montré des courbes de croissance similaires et la différenciation in vitro (Figure S4). toutefois, lorsqu'il est exposé à succinate à différents points dans le temps et les concentrations, Sucnr1 - / - NSCs montré aucune régulation positive de phospho-p38 (Figure S4). La stimulation par le glutamate ou l'ATP + thapsigargine induit dans Sucnr1 - / - NSCs une réponse de calcium similaire à celui de NNC de commande (Figure S4). Au contraire, traitement succinate n'a pas provoqué de libération de calcium des réserves intracellulaires (Figure S4), qui a indiqué un SUCNR1 défectueux de signalisation dans Sucnr1 - / - NSCs.

Nous avons ensuite réalisé une puce à ADN profilage de l'expression génique après le traitement par le succinate dans NSCs de contrôle et Sucnr1 - / - NSCs (Tableau S4). Nous avons constaté que synthase prostaglandine-endopéroxide 2 (PTGS2), l'enzyme clé dans la biosynthèse de PG codant pour la PTGS2 inductible, est le gène le plus dans upregulated NSCs de contrôle stimulée par succinate (log2 changement de pliage 1.05), mais pas dans Sucnr1 stimulée par le succinate - / - NSCs (log2 changement de pliage -0,43; Figure 4A). Nous avons validé ces résultats sur PTGS2 par qRT-PCR, ce qui confirme que les niveaux d'expression étaient significativement régulés à la hausse (2.1- à 2,7 fois le changement) en iNSCs stimulée succinate et NSCs, alors qu'ils ne sont pas en Sucnr1 succinate traité - / - NSCs (Figure 4B).

Compte tenu du rôle de la PGE2 en tant que régulateur des effets immunodépresseurs des cellules souches mésenchymateuses (MSCs) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), nous avons testé son accumulation dans les milieux de culture de tissus de iNSCs, NNC, et Sucnr1 - / - NSCs après stimulation par succinate. iNSCs et NSCs, mais pas Sucnr1 - / - NSCs, a montré significative (>2.5-plier) augmentation de leur libération basale de PGE2 dès 30 min après succinate. Cet effet succinate induit a été abolie par un prétraitement avec le dresseur PTGS2 irréversible SC-58125 (Figure 4C). Comme dans iNSCs de souris, exposition de hiNSCs en succinate a provoqué une augmentation significative des concentrations de PGE2 dans les milieux de culture tissulaire, alors à nouveau prétraitement avec soit SC-58125 ou 4c empêché sa sortie (Figure 4D).

Pour étendre davantage la pertinence de ces résultats à la co-cultures entre NNC et MφLPS, nous avons analysé les niveaux de PGE2 dans les milieux de culture tissulaire. Nous avons constaté que MφLPS-NNC a accumulé des niveaux plus élevés de PGE2 par rapport à MφLPS, tandis que le prétraitement des NSCs co-cultivées avec SC-58125 significativement réduit les niveaux de PGE2 (Figure 4E). SC-58125 prétraitement de NNC a également été associée à une augmentation significative de l'expression Il1b dans MφLPS (Figure 4F) et avec une réduction de l'OCR valeurs indicatives d'un phénotype pro-inflammatoire (Figure 4G). toutefois, nous avons remarqué que NNC prétraité avec SC-58125 a conservé des effets anti-inflammatoires résiduels sur MφLPS par rapport à Sucnr1 - / - NSCs (Figure 4F). Au contraire, la perte de la fonction Sucnr1 dans NSCs complètement aboli leurs effets anti-inflammatoires sur MφLPS (Les figures 4F et 4G). Nous montrons également que la capacité anti-inflammatoire dépendante PGE2 observée de NNC est conservée et pertinente pour l'homme NSCs.

En tant que tel, hiNSCs a induit une réduction significative de l'expression Il1b en MφLPS dans des co-cultures (Figure 4H), qui a été couplée à une restauration des valeurs ROC (Figure 4E) et les niveaux de PGE2 ont augmenté dans les milieux de culture tissulaire (Figure 4J). Ces effets ont été complètement supprimées par le prétraitement des hiNSCs avec l'inhibiteur sélectif SUCNR1 4c (Les figures 4H-4J).

Ainsi, l'activation de la voie de signalisation SUCNR1 chez la souris et l'homme NSCs déclenche la libération de PGE2 conduisant à des effets anti-inflammatoires sur le type 1 Les députés.

toutefois, expériences d'inhibition ciblant soit PTGS2 ou SUCNR1 prévoient que sont susceptibles de jouer un rôle clé supplémentaires mécanismes SUCNR1-dépendant PGE2 indépendants dans les effets anti-inflammatoires de NNC.

SUCNR1 stimulation déclenche l'absorption de Succinate par NNC
tableaux d'expression génique de NNC stimulée succinate a révélé que, En plus PTGS2, NaCt / Slc13a5 était parmi les gènes les plus surexprimés dans de type sauvage (WT) NNC (log2 changement de pliage = 0.49), mais pas dans Sucnr1 - / - NSCs (log2 changement de pliage = -0,12). SLC13A5 est un co-transporteur dicarboxylate connu pour être impliqué dans le transport succinate (Srisawang et al., 2007). Compte tenu de l'épuisement constant de succinate trouvé in vivo dans le LCR de INSc- ou des souris EAE transplanté NSC et in vitro dans des co-cultures avec MφLPS, nous avons supposé que iNSCs / NSCs activeraient SLC13A5 à succinate scavenge.

Nous avons constaté que l'expression de SLC13A5, ainsi que du co-transporteur de dicarboxylate de haute affinité SLC13A3, ont été considérablement augmenté dans iNSCs et NSCs, mais pas dans Sucnr1 - / - NSCs, lors de la stimulation succinate (Figure 5A). De même, hiNSCs exposés à succinate régulés à la hausse les taux d'expression protéique de ces deux SLC13 co-transporteurs in vitro (Figure 5B).

Nous avons étudié ensuite le rôle de ces co-transporteurs en mesurant l'absorption du succinate dans iNSCs et NSCs. Nous avons constaté que les deux iNSCs et une accumulation considérable de NNC [14C]-succinate (Figure 5C) tout en réduisant la quantité de extracellulaire [14C]-succinate dans un milieu de culture tissulaire (Figure 5D). Sucnr1 - / - NNC ni accumulé [14C]-succinate-ils, ni par voie intracellulaire l'appauvrir extracellulairement (Les figures 5C et 5D). Il est intéressant de, Sucnr1 - / - NSCs, que nous avons montré aucun effet sur l'expression Il1b dans MφLPS (Figure 4F), pas réduire les niveaux extracellulaires succinate dans les co-cultures avec MφLPS (Figure 5E). Comme preuve supplémentaire de l'importance de l'épuisement succinate dans la modulation du phénotype de type 1 Les députés pro-inflammatoires, nous montrons que le traitement avec recombinant actif (r)sous-unité A SDH complexe est capable de réduire de manière significative l'expression de Il1b dans MφLPS (Figure S5).

Ainsi, signalisation SUCNR1 dans NSCs demande l'absorption du succinate de immunometabolite, appauvrissant ainsi la piscine extracellulaire disponible maintenir l'activation autocrine et paracrine de type 1 Les députés.

La transplantation de Sucnr1 perte de fonction NSCs montre avec facultés affaiblies Capacité à améliorer Neuroinflammation chronique in vivo
Pour confirmer le rôle de l'axe succinate-SUCNR1 dans la médiation de la réponse des greffes NSC succinate in vivo, nous avons évalué les effets de la transplantation ICV de Sucnr1 - / - NNC chez la souris avec EAE chronique.

À 30 récupérable, Sucnr1 - / - NNC a survécu, distribué, et intégré dans le cerveau et la moelle épinière EAE sans différence significative par rapport au témoin NSCs (Figure S6). toutefois, la transplantation de Sucnr1 - / - NSCs induit seulement une légère reprise des déficits comportementaux EAE par rapport à témoin traité avec PBS souris EAE (EAE score Sucnr1 - / - NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), ce qui est nettement moins prononcée (50% de l'effet) que celle observée chez les souris transplantées avec EAE NSCs de commande (EAE score NSCs: 2.1 ± 0.3; La figure 6A).

Ex vivo analyse à base de cytométrie à écoulement de la composition d'infiltrats inflammatoires du système nerveux central a montré que la transplantation des souris EAE avec Sucnr1 - / - NNC n'a pas réussi à modifier les proportions de type 1 MP-inflammatoires y compris des anti-inflammatoires et CX3CR1 + microglie et CCR2 + dérivées de monocytes-macrophages infiltrants-en contraste avec les effets de NNC de commande (Les figures 6B et 6C). pathologie des tissus post-mortem a confirmé en outre les effets sur les tissus de protection contre la réduction de Sucnr1 - / - greffes NSC (Les figures 6D et 6E).

Nous avons ensuite étudié les taux de PGE2 et de succinate dans le LCR et des échantillons appariés de plasma NSC-transplantés et témoins traités par PBS souris EAE. Nous avons constaté que les deux Sucnr1 - / - et NNC NNC de contrôle n'a pas induit d'importants changements des niveaux de PGE2 dans le LCR. Plasma PGE2 a augmenté de manière significative chez les souris EAE seulement (par rapport aux témoins en bonne santé), sans effet de traitement observé (Figure 6F). Il est important, tandis que la transplantation de NNC de commande réduit le succinate de CSF (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NNC: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1 - / - greffes NSC n'a montré aucun effet (Sucnr1 - / - NSCs: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Figure 6G).

Ces données confirment l'exigence d'une voie de signalisation SUCNR1 fonctionnelle dans la régulation des effets anti-inflammatoires et neuroprotectrices des greffes NSC in vivo et soulignent l'importance de balayage succinate comme un mécanisme anti-inflammatoire d'action principal de NNC.

Discussion
Il existe un besoin clinique non satisfait de développer des approches cellulaires et moléculaires pour cibler les pilotes de base de la physiopathologie des conditions chroniques neuro-inflammatoires qui incluent des formes progressives de sclérose en plaques (Volpe et al., 2016). En principe, Les cellules souches possèdent un potentiel thérapeutique qui est distinct de celui des petites molécules et des agents biologiques et vont bien au-delà du domaine de la médecine régénérative classique. médicament partiel et le dispositif partiel, Les cellules souches pourraient travailler des agents modificateurs de la maladie comme biologiques (DMAs) qui détectent des signaux diverses, migrer vers des sites spécifiques dans le corps, intégrer les entrées à prendre des décisions, et exécuter des comportements de réponse complexes dans le contexte d'un microenvironnement tissulaire spécifique (Fischbach et al., 2013). Tous ces attributs pourraient être mis à profit pour traiter plusieurs processus pathologiques, y compris l'inflammation persistante conduit MP et la dégénérescence des tissus qui se produisent dans la SEP progressive.

Ici, nous avons utilisé accessible, autologue, et iNSCs de manière stable expansibles (Thier et al., 2012), ainsi que NNC somatiques, d'étudier les effets de la transplantation de cellules souches du cerveau dans un modèle de souris de la neuro-inflammation chronique, qui imite la cascade inflammatoire observée dans la SP progressive.

Nous avons constaté que la transplantation de iNSCs dans la circulation du LCR des souris EAE favorise des résultats équivalents à ceux observés précédemment chez des souris greffées avec NSCs somatiques (Pluchino et al., 2003). iNSCs transplantées ou NNC induit une amélioration clinique significative, ainsi qu'une réduction des axones et des dommages myéline, sans réduction significative de la perméabilité BBB à 30 récupérable. Des études complémentaires permettront de préciser si des changements de perméabilité de la BHE ou le recrutement des monocytes inflammatoires au système nerveux central se produisent immédiatement après la transplantation de iNSCs / NSCs. Si un tel effet est susceptible de changer les principaux résultats cliniques des maladies à forte prévalence de l'infiltration des cellules inflammatoires du système nerveux central par, telles que EAE / MS, est difficile d'anticiper.

Au lieu, nous avons constaté que notre paradigme de la transplantation était associée à un commutateur spécifique dans le profil d'activation des deux CX3CR1 + cellules microgliales et CCR2 + dérivées de monocytes-macrophages infiltrants avec une diminution du CD80 + Type 1 PM inflammatoires et une augmentation parallèle des PM de MRC1 + anti-inflammatoires. iNSCs / NSCs transplantées distribués et ont survécu dans le système nerveux central de souris EAE, tout en accumulant de préférence au niveau des zones méningés périvasculaires juxtaposée aux députés endogènes. Tout à fait, ces résultats impliquerait la présence de certains mécanismes encore inconnus de couplage intercellulaire entre les cellules souches greffées et inflammatoires députés. Que cette communication INSc / NSC-MP in vivo ne se produit que dans des niches périvasculaires ou encore au niveau des autres structures émergentes de capteurs comme immunitaires du cerveau qui incluent le plexus choroïde reste à résoudre (Ge et al., 2017).

Nous avons ensuite les mécanismes immunologiques sous-jacents entraînant les effets bénéfiques de NNC sur les députés lors de la neuro-inflammation chronique. analyse de petites molécules non ciblée des échantillons de LCR et le plasma appariés a révélé des changements métaboliques profonds dans le CSF de souris EAE, avec des différences entre le début et les phases retardées de la maladie.

carnitine, leucine + isoleucine, citrulline, allantoïne, ornithine, et l'acide urique ont tous augmenté de façon significative chez les souris EAE témoin traité avec PBS au sommet de la maladie. Nos résultats sont conformes aux données publiées montrant que leucine, ainsi que l'acide urique et ses sous-produits de l'allantoïne, sont tous augmenté dans le LCR de sujets avec MS (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Alors que l'augmentation carnitine CSF n'a pas été dans la SEP, des augmentations importantes ont été décrites dans des conditions inflammatoires non-MS du système nerveux central, telles que l'encéphalite (Wikoff et al., 2008) et la méningite (Shinawi et al., 1998).

inversement, seulement succinate a montré un retard (à savoir, 45 dpi) augmenter dans le LCR de témoins traités PBS souris EAE. Succinate devient un précieux marqueur biologique in vivo de détresse métabolique et inflammatoire (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills et O'Neill, 2014). Il est important, nous avons constaté que le succinate a diminué de façon significative dans le LCR des souris transplantées NSC iNSC- /. La réduction du succinate de peste porcine classique après transplantation INSc ou NSC était d'intérêt et pourrait avoir un rôle de premier plan dans l'interférence avec la neuro-inflammation chronique.

Succinate libéré Type 1 PM inflammatoire est un signal inflammatoire clé qui interagit avec son récepteur spécifique couplé à la protéine G SUCNR1. SUCNR1 agit comme un détecteur de début de stress métabolique dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques, y compris l'hypertension induite par la rénine, ischémie / reperfusion, inflammation, l'agrégation plaquettaire, et l'angiogenèse de la rétine (Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). particulièrement, nous avons constaté que l'expression de SUCNR1 est nécessaire pour les effets thérapeutiques de NNC transplantées in vivo.

Succinate à médiation par l'activation de SUCNR1 sur les rongeurs et les humains iNSCs et NSCs active la signalisation du calcium et la protéine kinase activée par un mitogene (Nafk) phosphorylation in vitro, provoquant ainsi l'acquisition d'un phénotype anti-inflammatoire concertée dans NSCs. D'un côté, SUCNR1 activé la sécrétion de PGE2, un pléiotropique bien établi immunomodulateur, dont la fonction cible plusieurs types de cellules dans le microenvironnement enflammée, y compris les députés (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). D'autre part, -SUCNR1 succinate de signalisation dans iNSCs et NNC a conduit à la régulation positive de deux membres de la famille SLC13 des co-transporteurs (à savoir, SLC13A3 et SLC13A5) et l'absorption de succinate extracellulaire.

in vivo, nous démontrons balayage efficace de succinate locale extracellulaire par NNC injecté chez des souris EAE par la circulation du LCR, qui est prédominant, par rapport à la sécrétion de PGE2. La perte de signalisation dépendante SUCNR1 dans NSCs transplantées a conduit à une réduction significative de leurs effets anti-inflammatoires et neuroprotectrices, tandis que Sucnr1 - / - greffes NSC ont montré aucune différence de survie, Distribution, et la différenciation par rapport NSCs de contrôle.

Nous supposons alors que le succinate extracellulaire sécrété par type 1 PM inflammatoires déclenche un comportement de balayage qui transplanté NSCs ajuster en réponse à une augmentation de la disponibilité du substrat (Srisawang et al., 2007). Ce roman couplage métabolique intercellulaire correspond bien à la présentation de la documentation disponible que, dans les micro-environnements spécifiques, cellules en compétition pour les nutriments disponibles, affectant la fonction de l'autre et le destin (Pearce et Pearce, 2013).

Nous prévoyons que l'épuisement succinate par SUCNR1 exprimant iNSCs et NNC pourrait jouer un rôle crucial dans la réduction de la disponibilité d'un signal métabolique clé dans des contextes inflammatoires où les interactions entre les cellules souches greffées et des cellules hôtes immunitaires deviennent complémentaires (Pluchino et Cossetti, 2013). Plus généralement, nos résultats sont conformes à la provocation, mais encore émergent, concept de NNC en tant que gardiens ancestraux du cerveau capables d'exercer plusieurs immunomodulateurs complémentaires et tissus effets trophiques (Martino et Pluchino, 2007).

Des études supplémentaires sont nécessaires pour caractériser la fonction de l'axe succinate-SUCNR1 dans les interactions neuro-immunes, fournir des indications supplémentaires sur le rôle critique du métabolisme cellulaire pour souches neurales / cellules souches (Knobloch et Jessberger, 2017), et développer des interventions pharmacologiques complémentaires ciblant cette voie dans le cerveau une inflammation chronique.

En conclusion, nous montrons ici que NNC sens le succinate extracellulaire qui accumule dans le système nerveux central inflammation chronique pour améliorer la neuro-inflammation par des mécanismes dépendants de SUCNR1-succinate. Notre travail identifie un nouveau mécanisme anti-inflammatoire qui sous-tend le potentiel de régénération des somatiques et NSCs directement induites, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle ère de médicaments de cellules souches personnalisées pour les maladies neurologiques inflammatoires et dégénératives chroniques.


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