Les cellules souches embryonnaires humaines Protocole de culture

 

souches embryonnaires humaines (il est) les cellules doivent être surveillés et soignés afin de maintenir en bonne santé, cultures non différenciées.

Au minimum, les cultures doivent être nourris tous les jours en effectuant un changement de milieu complet pour reconstituer les éléments nutritifs perdus et de garder les cultures sans facteurs de différenciation indésirables. Bien qu'une petite quantité de différenciation est normal et prévu dans la tige des cultures de cellules, la culture doit être régulièrement nettoyé en enlevant manuellement, ou “cueillette” zones différenciées. L'identification et la suppression de différenciation excessive des cultures de cellules hES sont des techniques essentielles dans le maintien d'une population en bonne santé des cellules.

Protocole

1. Entretien: L'observation des cultures sous le microscope

Retirer une plaque de cellules hES de l'incubateur 37 ° C et porter à microscope.
Observez les colonies à faible puissance, en utilisant un grossissement de 2X ou 5X, d'évaluer la qualité globale de la culture. Notez les points suivants: couleur moyenne normale, absence de toute contamination visible, taille globale de colonie, la qualité et de la densité, et toutes les autres observations.
Observer les changements de couleur moyenne.

En raison du changement du pH et l'épuisement des nutriments dans le milieu après une nuit d'incubation avec les cellules hES, le moyen changera d'une teinte rouge à un “paille” Couleur. Si le milieu apparaît violet, un changement de pH basique est produite. Si le milieu apparaît extrêmement jaune, le milieu est acidifié. Très moyen jaune peut être le résultat des colonies extrêmement surpeuplées dans le puits ou la contamination.

Le milieu doit apparaître clairement en tout temps. Bien qu'un certain niveau de débris cellulaires dans le milieu est normale, il ne doit jamais apparaître nuageux. Si un niveau élevé de débris cellulaires est observée, la culture est pas en bonne santé et peut être contaminé.
Si les cultures ne nécessitent pas d'entretien ou repiquage, ils peuvent être pris à l'enceinte de sécurité biologique à alimenter

Si les cultures contiennent plus d'environ 10% différenciant les colonies, les cellules doivent être “nettoyé” en enlevant manuellement les zones différenciées

Si les cultures contiennent des colonies grandes ou denses, ou la couche nourricière MEF est plus que 12 jours vieux, les cellules doivent être repiquées

2. L'alimentation des cellules hES

Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, retirer le couvercle de la boîte de culture et aspirez le milieu usé. Ne pas laisser la pointe de la pipette pour toucher une partie quelconque de la plaque autre que directement à l'intérieur des puits. En cas de problème de contamination, passer à une nouvelle, pipette stérile.
En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter la quantité appropriée de milieu de culture cellulaire réchauffé hES à chaque puits. Pour les cultures dans une plaque à 6 puits, ajouter 2.5 ml de milieu par puits.
Retourner la plaque dans l'incubateur à rester à 37 ° C et 5% CO2.

3. Retrait de la différenciation des cultures de cellules hES

Transformer 9 pouces Pipettes Pasteur en verre dans des outils de picking par moulage des conseils sur la flamme contrôlée d'un brûleur à alcool. Assurez-vous que la pointe de la pipette est scellé pour éviter toute contamination et arrondi pour éviter de rayer le plastique de la boîte de culture. Stériliser les outils de cueillette avant d'utiliser l'aide de la source de lumière UV dans l'enceinte de sécurité biologique ou la cueillette enceinte.
Retirez les zones différenciées. La différenciation se produit souvent que dans une partie d'une colonie de cellules hES, généralement le long des bords ou sous forme de points isolés dans le centre. Si seulement une partie d'une colonie est différenciant, seule la zone différenciée doit être retiré. La différenciation peut souvent soulever la plaque dans un “gluant” drap, et il est utile de séparer les premier cellules différenciées du reste de la colonie en traçant une ligne à travers la colonie avec l'extrémité de l'outil de prélèvement.
Une fois que les morceaux de la colonie sont séparés, glisser doucement l'outil d'insertion le long de la plaque pour détacher les cellules indésirables. Prenez soin de ne pas gratter trop de la couche d'alimentation entre les colonies MEF dans ce processus.
Lorsque toutes les cellules différenciées sont retirées de la plaque (et flottant dans le milieu), retourner la culture au cabinet de sécurité biologique. Aspirer le milieu contenant les cellules différenciées et de le remplacer par du milieu de culture cellulaire frais hES.

4. Les cellules hES repiquage

L'incubation enzymatique
Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, enlever le couvercle de la boîte de culture à 6 puits et aspirer le milieu usé à partir des puits à être repiquées. Ne pas laisser la pointe de la pipette pour toucher une partie quelconque de la plaque autre que directement à l'intérieur des puits.
En utilisant une pipette en verre stérile, ajouter 1 ml de collagénase IV réchauffé à chaque puits pour être repiquées.
Retourner la plaque dans l'incubateur à 37 ° C pour 5 minutes.
Racler et les cellules hES Pooling

Après incubation des cellules avec collagénase, observer les colonies sous le microscope. L'enzyme doit provoquer un changement subtil mais observable dans les bords de la colonie.
Dans l'enceinte de sécurité biologique, aspirer doucement l'enzyme à partir de chaque puits et les remplacer par 2.0 mL hES milieu de culture cellulaire.
Astuce de la plaque de culture légèrement vers vous et la 2.0 ml de milieu dans le premier puits avec un 5 mL Pipet de verre.

En tenant la pipette perpendiculaire au fond de la plaque, glisser doucement la pointe de la pipette à travers le puits tout en libérant lentement le milieu.
Répétez le mouvement et racler pipetage 3-4 fois jusqu'à ce que toutes les colonies ont été retirées du puits. Pipet doucement pour éviter de casser les colonies en trop petits morceaux. Lorsque les cellules ont été retirées du premier puits, laisser le contenu dans le puits et commencer à gratter les cellules hors du puits suivant.

Lorsque tous les puits à être repiquées ont été gratté, regrouper le milieu contenant les morceaux de colonies provenant de chaque puits dans une stérile 15 ml tube conique.
Rincer les puits en ajoutant raclées 1 ml de milieu de culture cellulaire hES à chaque puits. Recueillir ce rinçage et transfert vers le tube conique.

Pipeter doucement les cellules dans le tube pour briser les morceaux de colonies jusqu'à la taille désirée.
Centrifuger les cellules pour 5 minutes à 200 x g.

Le plaquage des cellules de cellules hES

Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparer une nouvelle plaque d'alimentation MEF 6 puits. Étiquette de la plaque avec les informations de cellules hES appropriées: ligne cellulaire, nouveau numéro de passage, et la date de passage. Aspirer le milieu MEF des puits et ajouter 1.0 ml de PBS à chaque puits. Agiter doucement le tampon autour des puits et aspirer le lavage PBS. Ajouter 1.5 ml de milieu de culture de cellules hES à chaque puits et mettre de côté la plaque.

Lorsque les cellules hES sont finis en centrifugeant, amener le tube de retour à l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire faiblement emballés.
Remettre les cellules dans le culot avec le milieu suffisant pour 1 mL hES milieu de culture cellulaire par puits à plaquer. Lors du fractionnement en 6 nouveaux puits, remettre en suspension le culot dans 6 ml de milieu.

Doucement et uniformément ajouter 1 ml de la suspension cellulaire à chaque puits de la plaque préparée d'alimentation MEF.
Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C et soigneusement glisser la plaque vers l'avant vers l'arrière, et de chaque côté pour répartir uniformément les cellules à travers le puits.
Permettre aux cellules de se fixer à 37 ° C pendant une nuit.

5. Les résultats représentatifs:

Indifférenciées cellules hES sont petites, fermement emballé, et se composent généralement de plus grande, plus dispersés cellules.

Différentes morhopologies peuvent être vus sous un faible grossissement au microscope. Une bonne morphologie cellulaire contient de petites, cellules serrées qui se développent dans une monocouche. Les cellules doivent être propres, bords définis, avec peu ou pas de différenciation.

Stérilité doit être maintenu en tout temps lorsque vous travaillez avec des cellules hES. Nettoyez et stérilisez l'enceinte de sécurité biologique et tout l'équipement avant utilisation.

Tous les réactifs doivent être filtrés à l'aide d'un 0.22 um filtre de taille de pores avant l'utilisation. L'utilisation de antiboiotics dans la culture cellulaire hES n'est pas nécessaire et devrait être évitée.

 

Un environnement distinct devrait être mis en place comme station de cueillette désigné. L'enceinte stérile de la station peut être une enceinte statique (comme un poste de travail PCR) avec une source de lumière UV, une hotte à flux laminaire, ou une enceinte de sécurité biologique.

Un microscope à disséquer l'intérieur de la station de cueillette est nécessaire pour observer les colonies que les zones différenciées sont supprimées. Le panneau de verre avant d'une enceinte statique ou une enceinte de sécurité biologique doit être modifié pour permettre les oculaires du microscope à étendre à travers le panneau sans compromettre la bonne circulation d'air et la stérilité.

Pour maintenir des cultures de cellules hES en bonne santé, les cellules doivent être repiquées au moment optimal, généralement tous les 4-7 journées. A cette époque, les colonies ont atteint leur taille maximale et peut être commencer à fusionner. colonies peuvent Fusionné augmenter le taux de différenciation dans la culture. Split rapports tombent généralement entre 1:3 et 1:5, en fonction du nombre de colonies plaquées, taux d'expansion, et des conditions de culture.

colonies Overplated (rapport de division trop faible) fusionnera probablement prématurément et doivent être repiquées avant d'atteindre leur taille maximale.

Cultures sur une couche nourricière MEF qui est plus que 2 semaines doivent être repiquées sur les nouveaux FAE qui soutiendront la croissance et la prolifération indifférenciée.

Étant donné que la différenciation se produit naturellement dans des cultures de cellules hES, une petite quantité devrait. la différenciation fréquente ou excessive peut se produire si les cultures ne reçoivent pas les soins appropriés. Les cellules doivent être nourris tous les jours, surcroissance entre les passages doivent être évités. Toujours utiliser des réactifs frais.

Tous les médias, Réactifs et FAE doivent être utilisés dans 14 jours pour éviter la croissance des cellules hES indifférenciées. De nouveaux lots de réactifs, telles que le remplacement Knockout Sérum, FBS et FAE, devraient être examinés avant l'utilisation. Rappelez-vous que toutes les cellules différenciées n'a pas éliminé avant repiquage seront transférés aux nouvelles cultures.

Aussi, essayez de garder les cellules à 37 ° C lorsque cela est possible. Réduire au minimum le temps, les cellules passent en dehors de l'incubateur (par exemple. sur la scène du microscope ou dans l'armoire de sécurité biologique.) Une étape de microscope chauffé peut être très bénéfique si les cellules seront de l'incubateur pendant des périodes de temps prolongées.

En observant les cultures de cellules hES au microscope, d'abord évaluer la qualité globale et la taille des colonies vue en utilisant une faible puissance (2x ou 5x) objectif. Si les cellules potentiellement différenciées sont observées à faible puissance, confirmer la morphologie différenciée à l'aide d'un objectif plus fort grossissement (10X).

 


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