Derivadas de macrófagos extracelular Succinato de Licencias células madre neuronales para reprimir neuroinflamación crónica

 

Reflejos
• NSC de tejidos somáticos o reprogramación directa igualmente reprimen la neuroinflamación
• succinato extracelular activa SUCNR1 / GPR91 en las NSC
• NSC activadas secretan PGE2 y limpian succinato, tipo así reprogramación 1 parlamentarios
• Sucnr1 NSCs mutantes han reducido la actividad anti-inflamatoria después del trasplante
Resumen
de células madre neurales (NSC) El trasplante puede influir en las respuestas inmunes y suprimir la inflamación en el SNC. metabolitos, tales como succinato, modular el fenotipo y la función de las células inmunes, pero si y cómo las NSC también son activados por dichos immunometabolites para controlar inmunorreactividad e inflamatorias respuestas no está clara. aquí, mostramos que somática trasplantado y NSCs inducidas directamente mejorar la inflamación crónica del SNC mediante la reducción de los niveles de succinato en el líquido cefalorraquídeo, disminuyendo de ese modo fagocito mononuclear (MP) la infiltración y el daño en el SNC secundaria. Parlamentarios inflamatorias liberan succinato, que activa receptor succinato 1 (SUCNR1)/GPR91 en las NSC, llevándolos a secretan la prostaglandina E2 y scavenge extracelular succinato con efectos antiinflamatorios consecuentes. Así, nuestro trabajo revela un papel inesperado para el eje de succinato-SUCNR1 en somática y NSCs inducida directamente, que controla la respuesta de las células madre a las señales metabólicas inflamatorios liberados por tipo 1 MPs en el cerebro inflamado crónicamente.

Introducción
Los avances en la biología de células madre han aumentado las esperanzas de que las enfermedades del sistema nervioso central pueden ser mejoradas por las medicinas de células madre no hematopoyéticas (Martino y Pluchino, 2006). Hemos proporcionado pruebas convincentes de que el trasplante de células madre neurales somáticas (NSC) mejora las características clínico-patológicas de modelos animales de trastornos inflamatorios del SNC. Más allá de la sustitución estructural de las células del SNC lesionadas, Nuestro trabajo ha demostrado que NSCs trasplantados participan en programas complejos de células madre-injerto a host de comunicación, global que lleva a soporte trófico y modulación adaptativa y de la respuesta inmune innata (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino y Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009segundo). Específicamente, NSC trasplantes de reducir la carga de la inflamación en el sitio de la lesión (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009un), disminuir el número de tipo 1 fagocitos mononucleares inflamatorias (parlamentarios) (Cusimano et al., 2012), y promover la cicatrización de la herida SNC a través de mecanismos aún mal caracterizado.

sin embargo, la traducción clínica de terapias experimentales NSC sigue estando limitado por las fuentes de las que NSC humanos (hNSCs) son derivados (Anderson et al., 2017), la inmunogenicidad intrínseca de líneas HNSC alogénicas (Ramos-Zúñiga et al., 2012, Rice et al., 2013), y la estabilidad de la llamada “gran cantidad de células clínico previsto” (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). Autólogo y NSCs inducidas directamente de forma estable expandibles (iNSCs) a partir de fibroblastos dérmicos de los pacientes se están convirtiendo en una alternativa válida a las terapias NSC (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). La reprogramación directa en iNSCs evita la progresión laborioso a través de un estado pluripotente y la posterior diferenciación en linajes deseadas descritas para la célula madre pluripotente inducida (IPSC) tecnología (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Por lo tanto, haciendo iNSCs de forma estable expandibles a partir de células somáticas representa la manera más factible de obtener células madre del cerebro autólogas para aplicaciones clínicas posteriores (Wörsdörfer et al., 2013). sin embargo, la eficacia de iNSCs directamente reprogramadas en el tratamiento de trastornos inflamatorios del SNC todavía no ha sido probado.

En las formas progresivas de esclerosis múltiple (SRA), inflamación crónica del SNC es sostenida por la activación generalizada de MPs que incluyen tanto CNS microglia residente y monocitos derivados de la infiltración de macrófagos (Mallucci et al., 2015). Parlamentarios se encuentran en lesiones de la materia gris, cerca de degeneración neuritas y cuerpos celulares neuronales (Peterson et al., 2001), y en las lesiones de la sustancia blanca, donde el borde externo de microglia activada se asocia con el daño tisular crónica (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Áreas de apariencia normal de la materia blanca también se caracterizan por la acumulación de MP, lo que conduce a la formación de nódulos microgliales que impulsan patología de la enfermedad, independientemente de la activación concomitante de células T (Muelle et al., 2011). El papel perjudicial de la inflamación crónica MP-impulsado en progresiva MS también está apoyada por la evidencia en modelos de enfermedad animal, donde su carga global se correlaciona con una alteración de la función neuronal (Plank et al., 2017), atrofia cerebral (Tambalo et al., 2015), y la reducción de las respuestas regenerativas (Jiang et al., 2014).

La activación de MPs por estímulos pro-inflamatoria provoca un interruptor metabólico hacia la glucólisis y la reducción de la fosforilación oxidativa (la fosforilación oxidativa) (Kelly y O'Neill, 2015). La evidencia reciente sugiere que, dentro de este recableado metabólica, tipo 1 MPs inflamatorias se acumulan succinato, con importantes implicaciones fisiopatológicas (Tannahill et al., 2013). succinato intracelular inhibe la actividad de prolil hidroxilasas enzimas (PHDs), estabilizando de este modo la hipoxia elemento sensible (HIF)-1alpha y la inducción de la transcripción de la interleucina (Illinois)-1b (Tannahill et al., 2013). además, oxidación de succinato por la succinato deshidrogenasa (SDH) repurposes mitocondrias de la síntesis de ATP a las especies reactivas de oxígeno (ROS) producción de señales pro-inflamatorias como adicional (Mills et al., 2016). Tipo 1 MPs inflamatorias también liberan succinato extracelularmente y upregulate su receptor afín succinato 1 (SUCNR1), un receptor acoplado a proteína G (también conocido como GPR91), que funciona como sensor de autocrina y paracrina para mejorar la producción de IL-1β (Littlewood-Evans et al., 2016).

Como tal, metabolismo se está convirtiendo en una importante diana terapéutica para modular la activación tanto de macrófagos (Kelly y O'Neill, 2015) y microglia (Orihuela et al., 2016), y rutas relacionadas con succinato-tienen funciones inmunomoduladoras clave para las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).

Dadas las propiedades moduladoras inmunitarias establecidas de NSCs (Pluchino y Cossetti, 2013), la hipótesis de que NSCs puede ejercer sus efectos terapéuticos en la neuroinflamación crónica modulando el metabolismo MP hacia la reducción del daño del CNS secundaria.

En este trabajo, se investigaron los mecanismos moleculares que subyacen a la capacidad de NSCs somáticos e inducidos directamente para contrarrestar los cambios metabólicos de tipo 1 MPs inflamatorias tanto in vivo como in vitro. Se demuestra que iNSCs y NSCs trasplantados son funcionalmente equivalentes en la mejora de la neuroinflamación crónica en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). iNSCs trasplantadas / NSCs cambiar en el perfil de activación del CNS residente microglia y monocitos derivados de la infiltración de macrófagos hacia un fenotipo anti-inflamatoria, así como reducir los niveles de la succinato immunometabolite en el líquido cefalorraquídeo (CSF). iNSCs / NSC también disminuyen succinato extracelular liberado por tipo 1 MPs inflamatorios para reprogramar su metabolismo hacia OXPHOS in vitro. Mecánicamente, mostramos que succinato secretada por tipo 1 MPs provoca en iNSCs / NSCs una cascada de señalización aguas abajo SUCNR1, que permite a su actividad anti-inflamatoria. Esta función anti-inflamatoria succinato-licencia de iNSCs / NSCs está mediada por la secreción de prostaglandina (PG) E2, así como por una considerable compactación de succinato extracelular. La pérdida de función Sucnr1 en NSCs conduce a la reducción de manera significativa las actividades anti-inflamatorias in vitro e in vivo después del trasplante en EAE.

Nuestro estudio revela un eje succinato-SUCNR1 que aclara cómo NSCs responden a las señales metabólicas inflamatorias para inhibir la activación de tipo 1 Parlamentarios en la neuroinflamación crónica.

resultados
NSC Trasplante aminora la neuroinflamación crónica y se acopla con reducción de la Immunometabolite succinato en el líquido cefalorraquídeo
En primer lugar, se evaluó los efectos de la intracerebroventricular (icv) trasplante en el pico de la enfermedad (PD) de iNSCs o NSCs en ratones con MOG35-55 inducida-crónica EAE y lo comparó con los ratones con EAE de control tratado con PBS. Antes del trasplante, iNSCs y NSC se ampliaron, caracterizada (Figura S1), y se marcaron con farnesylated (F)GFP in vitro. A 30 días después del trasplante (recuperable), INSC y NSC trasplantes sobrevivieron, repartido, e integrado dentro del cerebro y la médula espinal EAE (Figura S2). Sólo una minoría de células fGFP recuperados + (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSC: 1.7% ± 0.1%) fueron proliferando (Figura 1A) o expresar neuronal (Figura 1B), astroglial (Figura 1C), o oligodendroglial (Figura 1D) marcadores de linaje (Figura S2). La mayoría (~ 75%) de iNSCs sobreviven al trasplante fueron encontrados lugar a no ser que expresa cualquiera de los marcadores de linaje neural probados y localización de alrededor de meníngeas zonas perivasculares de nicho-como cerca de F4 / 80 + MPs endógenos (Figura 1E), como se observó en injertos NSC somáticas (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). El trasplante de iNSCs indujo una significativa y de larga duración (hasta 90 recuperable) mejora de las puntuaciones de EAE, que se inició a partir 15 a 20 dpt en adelante (Figuras 1F y S2). La recuperación funcional fue también confirmada por análisis de la marcha automatizada asistida por ordenador (Figura S2). En general, iNSCs trasplantados-ICV eran seguros y condujeron a la recuperación del comportamiento y patológica.

A continuación, analizó la composición de los infiltrados inflamatorios del SNC a través ex vivo citometría de flujo en ICSN- y NSC-trasplantado versus control tratado con PBS EAE ratones. El trasplante de iNSCs o NSCs no tuvo efectos sobre la fracción de células T CNS-infiltrantes, Las células B, y el total de los parlamentarios, así como en la de subconjuntos de células CD3 + / CD4 + T (incluyendo Th1, Th2, Treg, ThGM-CSF, subconjuntos y Th17) a 30 recuperable (Figura S3). En lugar, NSC- o NSC-transplantaron ratones EAE mostraron un cambio significativo en el perfil de activación de las células CX3CR1 + con disminución ~ 1,5 veces de la CD80 + Tipo 1 microglia inflamatorios y aumento paralelo de la microglia + anti-inflamatoria MRC1 (Figura 1G). Igualmente, SNC-infiltrante (derivadas de monocitos) CCR2 + macrófagos de INSC- ratones EAE o trasplantado-NSC sometió interruptor significativa fenotipo con la disminución ~1.3 veces de la CD80 + Tipo 1 macrófagos inflamatorios y aumento ~1.8-pliegue paralelo de los macrófagos MRC1 + anti-inflamatorios (Figura 1H). Este efecto fue acompañado de una reducción significativa de la expresión del tipo 1 marcador MP inflamatoria nítrico inducible sintasa de óxido (iNOS) por / 80 + MPs F4 en vivo (Las figuras 1I y S3).

A continuación, analizaron los niveles de expresión de los pro principal- y genes anti-inflamatorios en todo el CNS. NSC- y los ratones EAE NSC-trasplantado ambos mostraron niveles significativamente reducidos de la interleucina-1 beta (IL-1B) en el cerebro y la médula espinal y el aumento de los niveles de receptor de manosa tipo C 1 (Mrc1) en la médula espinal, por lo tanto 10 recuperable (Figura 1J).

No se encontraron diferencias significativas en la barrera hematoencefálica (acreditación) la permeabilidad al 30 dpt al comparar iNSC- / NSC-trasplantados con control tratado con PBS EAE ratones (Figura S3).

Finalmente, NSC- y NSC-trasplantado ratones EAE acumulado pérdida axonal reducido significativamente (Figura 1K) y desmielinización (Figura 1L) en la médula espinal.

Dada la importancia del metabolismo establecido en la regulación del fenotipo y la función de los parlamentarios, se investigó si los trasplantes NSC afectados el microambiente metabólica neuroinflammatory. Para tal fin, se realizó un perfil metabólico no directo de los metabolitos polares mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) de muestras de LCR y plasma emparejados (Tabla S1). control de EAE ratones tratados con PBS mostró un aumento significativo de varios CSF (pero no plasma) metabolitos, entre las que sólo se alcanzó el succinato 45 días después de la inmunización (ppp) (correspondiente a 30 recuperable; Figura 1M). ratones EAE no sometidos a cirugía también mostraron un aumento de succinato significativa sólo en el CSF en 45 ppp (frente a ratones de control sanos), que no era diferente de los niveles de succinato en el control tratado con PBS CSF ratones EAE (Figura S3).

Mientras que nosotros no detectamos ningún cambio significativo en los niveles de metabolitos de plasma entre ICSN / NSC trasplantado-y de los ratones con EAE de control tratados con PBS (Tabla S1), encontramos que el trasplante de iNSCs o NSC condujo a una caída significativa de succinato de LCR en el momento 30 recuperable (Figura 1M; Tabla S1).

Promover, no se encontraron diferencias significativas en succinato de CSF cuando la comparación de los ratones con EAE tratados con PBS frente a ratones EAE inyectado ICV con fibroblastos de ratón (FMs) como células de control (Figura S3).

Así, iNSCs y NSCs directamente inyectados en la EAE CNS inducir un interruptor fenotipo específico de MPs, que se asocia con la reducción de la succinato immunometabolite en sólo en el CSF y la mejora de la neuroinflamación crónica.

NSC reducir los niveles de succinato y reprogramar el metabolismo de Tipo 1 Inflamatoria Phi In Vitro
A continuación, investigaron los mecanismos moleculares a través del cual iNSCs / NSCs muestran actividades anti-inflamatorias en tipo 1 parlamentarios, usando un sistema in vitro que recapitula las interacciones entre MPs y iNSCs / NSCs. macrófagos Naive de médula ósea derivadas de (Phi) fueron polarizada en un tipo 1 fenotipo inflamatorio con LPS (MφLPS), como se describe (Tannahill et al., 2013). MφLPS fueron co-cultivadas con iNSCs (MφLPS-iNSCs) o NSC (MφLPS-NSC) en un sistema de trans-así que evita contactos de célula a célula (Figura 2A). No polarizada Phi se utilizaron como controles.

perfiles de expresión génica Microarray mostró cambios transcripcionales significativas en MφLPS con 7,401 los genes afectados (frente Phi; valor p ajustado < 0.1; Figura 2B; Tabla S2) y 51 genes expresados ​​diferencialmente en MφLPS-iNSCs o MφLPS-NSCs (frente MφLPS; valor p ajustado < 0.1; Las Figuras 2B y 2C; Tabla S2). Este último conjunto de genes se enriqueció en los procesos biológicos relacionados con la regulación positiva de la activación de leucocitos (IR: 0002696), la diferenciación de leucocitos mieloide (IR: 0002761), y los procesos del sistema inmune (IR: 0002376). Independiente validación qRT-PCR de genes pro-inflamatorias Phi seleccionados confirmó la regulación por disminución significativa de los niveles de expresión de IL12B, IL15, Il15ra, y CD69, así como los genes inflamatorios clásicos NOS2, factor de necrosis tumoral (TNF), y la IL-1B en MφLPS-iNSCs y MφLPS-NSC (frente MφLPS; Figura 2D). Este efecto se acopló con la regulación al alza concomitante de los niveles de expresión de genes asociados con un fenotipo antiinflamatorio Phi, tales como uronyl-2-sulfotransferasa (párrafo) y el antígeno de células estromales de médula ósea 1 (BST1) (Al Shabany et al., 2016, Martínez et al., 2015), así como la arginasa 1 (arg1) y Mrc1 (frente MφLPS; Figura 2E). Cuando iNSCs / NSCs fueron co-cultivadas con lipopolisacárido (LPS)-células BV2 ratón microgliales activadas como antes, También se observó una reducción significativa de los niveles de expresión de los genes pro-inflamatorias IL-1B y NOS2 (Figura 2F).

Para enlazar los perfiles de expresión génica con estados metabólicos funcionales, se evaluó la tasa de consumo de oxígeno basal (LOC) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de MφLPS como lecturas de la su ácido tricarboxílico (TCA) las actividades del ciclo y glucolíticas, respectivamente. Se encontró una reducción significativa de OCR y un aumento significativo de ECAR en MφLPS (frente Mφs). En lugar, MφLPS-iNSCs y MφLPS-NSC fueron sometidos a obras de reforma de ambos valores OCR y ECAR (frente MφLPS; Las Figuras 2G y 2H), como se observa en la conmutación Phi a un fenotipo antiinflamatorio (O'Neill y Pearce, 2016).

En un esfuerzo para aclarar los determinantes metabólicas de estos efectos anti-inflamatorios, se realizó un análisis LC-MS no directo del contenido de metabolito de molécula pequeña extracelular e intracelular de MφLPS. Como se esperaba, estimulación LPS cambió profundamente el medio metabólico extracelular e intracelular de Phi (MφLPS) (frente Phi; Tabla S3). En co-cultivos, MφLPS-iNSCs y MφLPS-NSC ambos mostraron una reducción significativa de glutamato extracelular, GABA, y succinato (frente MφLPS; Figura 2I; Tabla S3). además, MφLPS-iNSCs y MφLPS-NSCs también muestran una reducción significativa de succinato intracelular y itaconato (frente MφLPS; Figura 2J; Tabla S3).

Consistente con la reducción de los niveles de succinato, encontramos que MφLPS-iNSCs y MφLPS-NSCs exhibieron niveles de HIF-1α redujeron significativamente, de la corriente arriba isoenzima proteína piruvato quinasa M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Figura 2K), así como de IL-1β (frente MφLPS; Figura 2L).

En total, estos datos in vitro proporcionan evidencia de que iNSCs / NSCs reducir la acumulación de tanto succinato intracelular y extracelular en co-cultivos con el tipo 1 parlamentarios inflamatorias, la reprogramación de ellos hacia un fenotipo anti-inflamatoria OXPHOS.

Las señales de succinato a través SUCNR1 / GPR91 en el ratón y humano NSC
Dada la importancia de succinato como señal de immunometabolic, investigamos si succinato liberado por tipo 1 MPs pro-inflamatorias podrían regular la actividad de las células circundantes en situ, incluyendo el de trasplantado iNSCs / NSCs.

Hemos encontrado que iNSCs trasplantados / NSC detectadas en las proximidades de las zonas perivasculares meníngea (Figuras 3A y 3B ) y F4 / 80 + MPs (Figura 3C) expresado SUCNR1 in vivo en el SNC. SUCNR1 también se expresó en el nivel de proteína en ambos iNSCs y NSCs in vitro, pero no en los BM (Figura 3D).

A fin de evaluar si SUCNR1 en iNSCs / NSCs fue activado funcionalmente por succinato, se investigó su cascada de señalización aguas abajo in vitro. Cuando se expone a succinato (Figura 3E; Rubic et al., 2008), 34.2% (± 7,4%) de iNSCs y 31.7% (± 6,5%) de NSCs mostraron una liberación de los almacenes intracelulares de calcio (Figuras S4 y 3F). Esta respuesta fue seguido por una regulación positiva significativa de la fosfo-p38 activada por mitógenos proteína quinasa (Figura 3G), indicativa de su activación. Se confirmó la expresión de SUCNR1 y SUCNR1 también en las NSC fetal humano (hNSCs) y iNSCs humanos (hiNSCs) (Las figuras 3H y 3I). Al igual que en iNSCs ratón, la señalización de p38 succinato dependiente fue evocado en hiNSCs, pero no en hiNSCs pre-tratados con el inhibidor 4c SUCNR1 selectiva (Figura 3J).

Así, de ratón y humanos iNSCs y NSCs expresan SUCNR1 funcional, que induce una vía de señalización aguas abajo de su estimulación con el succinato immunometabolite.

Inicia SUCNR1 La estimulación de la secreción de prostaglandina E2 por NSC
Para aclarar las consecuencias funcionales de SUCNR1 de señalización en las NSC, hemos generado ratones que carecen de NSC Sucnr1 (Sucnr1 - / - NSC) (Rubic et al., 2008; Figura S4). En comparación con el control de las NSC, Sucnr1 - / - mostraron NSCs similares curvas de crecimiento y diferenciación in vitro (Figura S4). sin embargo, cuando se expone a succinato en diferentes puntos temporales y concentraciones, Sucnr1 - / - NSC no mostraron ninguna regulación al alza de fosfo-p38 (Figura S4). La estimulación con glutamato o ATP + thapsigargin inducida en Sucnr1 - / - NSCs una respuesta de calcio similar a la de NSCs de control (Figura S4). De lo contrario, tratamiento succinato no provocó la liberación de calcio de las reservas intracelulares (Figura S4), lo que indica una defectuosa señalización en Sucnr1 SUCNR1 - / - NSCs.

A continuación realizó un perfil de expresión génica de microarrays después del tratamiento con succinato en NSCs de control y Sucnr1 - / - NSCs (Tabla S4). Hemos encontrado que la prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (Ptgs2), la enzima clave en la biosíntesis de PG que codifica la inducible PTGS2, era el gen más upregulated en NSCs de control de succinato estimulada (log2 cambio veces 1.05), pero no en Sucnr1-succinato estimulado - / - NSCs (log2 veces el cambio -0,43; Figura 4A). Hemos validado estos resultados en Ptgs2 de QRT-PCR, confirmar que los niveles de expresión se upregulated significativamente (2.1- a 2,7 veces el cambio) en iNSCs succinato estimulada y NSCs, mientras que no estaban en Sucnr1-succinato tratada - / - NSCs (Figura 4B).

Dado el papel de PGE2 como regulador de los efectos inmunosupresores de las células madre mesenquimales (MSC) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), probamos su acumulación en los medios de cultivo de tejido de iNSCs, NSC, y Sucnr1 - / - NSCs después de la estimulación con succinato. iNSCs y NSC, pero no Sucnr1 - / - NSC, mostró significativa (>2.5-doblez) aumento de su liberación basal de PGE2 tan pronto como sea 30 min después de succinato. Este efecto succinato inducida fue abolida por pre-tratamiento con el irreversible PTGS2 bloqueador de SC-58125 (Figura 4C). Al igual que en iNSCs ratón, exposición de hiNSCs a succinato provocó un aumento significativo de las concentraciones de PGE2 en medio de cultivo tisular, mientras que de nuevo pre-tratamiento con cualquiera de SC-58125 o 4c impedido su liberación (Figura 4D).

Para ampliar aún más la relevancia de estos hallazgos para co-cultivos entre NSCs y MφLPS, se analizaron los niveles de PGE2 en medio de cultivo tisular. Hemos encontrado que MφLPS-NSC acumula mayores niveles de PGE2 en comparación con MφLPS, mientras que el tratamiento previo de NSCs co-cultivadas con los niveles de PGE2 SC-58125 significativamente reducidos (Figura 4E). SC-58125 de pre-tratamiento de NSCs también se acopló con un aumento significativo de la expresión de IL-1B en MφLPS (Figura 4F) y con una reducción de OCR valores indicativos de un fenotipo pro-inflamatoria (Figura 4G). sin embargo, nos dimos cuenta de que NSCs pre-tratados con SC-58125 retenido algunos efectos anti-inflamatorios residuales en MφLPS comparación con Sucnr1 - / - NSCs (Figura 4F). De lo contrario, pérdida Sucnr1 de función en NSCs abolió completamente sus efectos antiinflamatorios en MφLPS (Las figuras 4F y 4G). También muestran que la PGE2 dependiente de la capacidad anti-inflamatoria observada de NSCs se conserva y relevante para NSCs humanos.

Como tal, hiNSCs indujo una reducción significativa de la expresión de IL-1B en MφLPS en co-cultivos (Figura 4H), que se acopló con una restauración de los valores de OCR (Figura 4I) y aumento de los niveles de PGE2 en medio de cultivo tisular (Figura 4J). Estos efectos fueron completamente suprimidos por pre-tratamiento de hiNSCs con el 4c inhibidor selectivo SUCNR1 (Figuras 4H-4J).

Así, la activación de SUCNR1 vía de señalización en el ratón y NSCs humanos provoca la liberación de PGE2 que conduce a efectos antiinflamatorios sobre el tipo de 1 parlamentarios.

sin embargo, Los experimentos de inhibición de orientación ya sea PTGS2 o SUCNR1 anticipan que independientes: mecanismos SUCNR1-dependiente de la PGE2 adicionales es probable que desempeñen un papel clave en los efectos anti-inflamatorios de NSCs.

SUCNR1 Estimulación Desencadena la captación de succinato por NSC
La expresión génica de conjuntos de NSC-succinato estimulado revelaron que, Además Ptgs2, NACT / Slc13a5 fue uno de los genes más upregulated de tipo salvaje (WT) NSC (log2 veces el cambio = 0.49), pero no en Sucnr1 - / - NSC (log2 veces el cambio = -0,12). SLC13A5 es un dicarboxilato de co-transportador se sabe están involucrados en el transporte succinato (Srisawang et al., 2007). Dado el agotamiento consistente de succinato encuentra tanto en vivo en el LCR de ICSN- o NSC-trasplantado ratones EAE e in vitro en co-cultivos con MφLPS, la hipótesis de que iNSCs / NSC activarían SLC13A5 para barrer succinato.

Hemos encontrado que la expresión de SLC13A5, así como de la alta afinidad SLC13A3 dicarboxilato co-transportador, se incrementaron significativamente en iNSCs y NSCs, pero no en Sucnr1 - / - NSC, tras la estimulación succinato (Figura 5A). similar, hiNSCs expuestos a succinato upregulated los niveles de expresión de proteínas de ambas estas SLC13 co-transportadores in vitro (Figura 5B).

A continuación se investigó el papel de estos co-transportadores mediante la medición de la absorción de succinato en iNSCs y NSC. Se encontró que tanto iNSCs y NSC acumulan significativamente [14do]-succinato (Figura 5C) al tiempo que reduce la cantidad de extracelular [14do]-succinato en medio de cultivo tisular (Figura 5D). Sucnr1 - / - NSC ni acumulada [14do]-succinato intracelularmente ni tampoco se agotan extracelularmente (Figuras 5C y 5D). Curiosamente, Sucnr1 - / - NSC, que hemos demostrado tener ningún efecto sobre la expresión de IL-1B en MφLPS (Figura 4F), logrado reducir los niveles extracelulares de succinato en co-cultivos con MφLPS (Figura 5E). Como una prueba más de la importancia de agotamiento de succinato en la modulación del fenotipo de tipo 1 MPs pro-inflamatorias, mostramos que el tratamiento con recombinante activo (r)subunidad complejo SDH A es capaz de reducir significativamente la expresión de IL-1B en MφLPS (Figura S5).

Así, SUCNR1 de señalización en NSCs solicita la captación del succinato immunometabolite, con lo que agotan la piscina extracelular disponible sostener la activación autocrina y paracrina de tipo 1 parlamentarios.

El trasplante de Sucnr1 NSC con pérdida de función Muestra deterioro de la capacidad para mejorar la neuroinflamación crónica En Vivo
Para confirmar el papel de los eje-SUCNR1 succinato en la mediación de la respuesta de los injertos NSC a succinato in vivo, se evaluaron los efectos de la trasplante icv de Sucnr1 - / - NSC en ratones con EAE crónica.

A 30 recuperable, Sucnr1 - / - NSC sobrevivió, repartido, e integrado dentro del cerebro y la médula espinal EAE, sin diferencias significativas en comparación con el control de las NSC (Figura S6). sin embargo, el trasplante de Sucnr1 - / - NSCs indujo sólo una ligera recuperación de los déficits de comportamiento de EAE frente a ratones con EAE de control tratado con PBS (EAE-score Sucnr1 - / - NSC: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), que fue significativamente menos pronunciada (50% del efecto) que la observada en los ratones EAE transplantado con NSCs de control (EAE-NSC puntuación: 2.1 ± 0.3; Figura 6A).

análisis basado en citometría de flujo ex vivo de la composición de infiltrados inflamatorios del SNC mostró que el trasplante de ratones EAE con Sucnr1 - / - NSCs falló a cambiar las proporciones de tipo 1 MPS-incluyendo inflamatorias y anti-inflamatorias CX3CR1 + microglia y CCR2 + derivadas de monocitos infiltrarse macrófagos, en contraste con los efectos de NSCs de control (Las figuras 6B y 6C). patología tisular post mortem confirmó aún más los efectos de tejido de protección reducidos de Sucnr1 - / - injertos NSC (Las Figuras 6D y 6E).

A continuación, investigaron los niveles de PGE2 y succinato en muestras de LCR y plasma coincidentes de NSC-trasplantado y el control tratado con PBS EAE ratones. Se encontró que tanto Sucnr1 - / - NSC NSC y de control no inducir cambios significativos de los niveles de PGE2 en el LCR. Plasma PGE2 aumentó significativamente sólo en ratones EAE (en comparación con los controles sanos), sin efecto del tratamiento observado (Figura 6F). En tono rimbombante, mientras que el trasplante de NSCs de control reducido succinato CSF (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSC: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1 - / - injertos NSC no mostró efectos (Sucnr1 - / - NSC: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; Figura 6G).

Estos datos confirman el requisito de una vía de señalización SUCNR1 funcional en la regulación de los efectos anti-inflamatorios y neuroprotectores de los trasplantes de NSC en vivo y subrayan la importancia de barrido de succinato como un mecanismo anti-inflamatoria predominante de acción de NSCs.

Discusión
Hay una necesidad clínica no satisfecha de desarrollar enfoques celulares y moleculares para orientar los conductores centrales de la fisiopatología de las condiciones neuroinflamatorias crónicas que incluyen formas progresivas de EM (Volpe et al., 2016). En principio, células madre poseen un potencial terapéutico que es distinta de la de pequeñas moléculas y productos biológicos y se extienden mucho más allá de la arena medicina regenerativa clásica. medicamento de la Parte y el dispositivo de parte, células madre podrían trabajar agentes modificadores de la enfermedad como biológicos (DMA) que las señales de diversos sentidos, migrar a sitios específicos en el cuerpo, integrar los insumos para tomar decisiones, y ejecutar comportamientos complejos de respuesta en el contexto de un microambiente del tejido específica (Fischbach et al., 2013). Todos estos atributos podrían ser aprovechadas para el tratamiento de varios procesos patológicos, incluyendo el persistente MP-impulsado la inflamación y el tejido degeneración que se producen en MS progresiva.

aquí, utilizamos accesible, autólogo, y iNSCs de forma estable expandibles (Thier et al., 2012), así como NSCs somáticas, para investigar los efectos de trasplante de células madre del cerebro en un modelo de ratón de la neuroinflamación crónica, que imita la cascada inflamatoria observada en la EM progresiva.

Encontramos que el trasplante de iNSCs en la circulación de LCR de ratones EAE promueve resultados equivalentes a los observados en los ratones trasplantados con somática NSC (Pluchino et al., 2003). iNSCs trasplantado o NSCs inducidos mejoría clínica significativa, así como la reducción axonal y el daño de mielina, sin reducción significativa de la permeabilidad de la BHE en 30 recuperable. Otros estudios ayudarán a clarificar si los cambios de permeabilidad de la BHE o reclutamiento de monocitos inflamatorios en el SNC ocurrir inmediatamente después del trasplante de iNSCs / NSCs. Si es probable que cambie los principales resultados clínicos de enfermedades con alta prevalencia de la infiltración del SNC por células inflamatorias tal efecto, tales como EAE / MS, es difícil anticipar.

En lugar, encontramos que nuestro paradigma de trasplante se asoció con un conmutador específico en el perfil de activación de ambos + células microgliales CX3CR1 y CCR2 + derivadas de monocitos macrófagos infiltrantes con una disminución de la CD80 + Tipo 1 MPs inflamatorios y aumento paralelo de las MPs MRC1 + anti-inflamatorios. iNSCs trasplantadas / NSCs distribuidos y sobrevivieron en el SNC de ratones EAE, mientras que preferentemente se acumula en el nivel de las zonas perivasculares meníngeas en yuxtaposición con MPs endógenos. En total, estos hallazgos implicarían la presencia de algunos mecanismos aún desconocidos de acoplamiento intercelular entre las células madre injertadas y MPs inflamatorias. Si esta comunicación ICSN / NSC-MP in vivo se lleva a cabo sólo en nichos perivasculares o también a nivel de otras estructuras de sensor-como inmunes emergentes del cerebro que incluye el plexo coroideo permanece ser abordado (Ge et al., 2017).

A continuación, investigaron los mecanismos inmunológicos subyacentes que impulsan los efectos beneficiosos de las NSC a los parlamentarios durante la neuroinflamación crónica. Untargeted análisis de moléculas pequeñas de muestras de LCR y plasma emparejados reveló profundos cambios metabólicos en el LCR de ratones EAE, con diferencias entre los principios y las fases tardías de la enfermedad.

carnitina, leucina + isoleucina, citrulina, alantoína, ornitina, y ácido úrico aumentaron todos significativamente en el control EAE ratones tratados con PBS en el pico de la enfermedad. Nuestros resultados son consistentes con la evidencia publicada mostrando que la leucina, así como el ácido úrico y sus alantoína subproducto, son todos aumentado en el CSF de sujetos con MS (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Mientras que el aumento carnitina CSF no se ha informado en la EM, aumentos importantes se han descrito en las condiciones inflamatorias no-MS del SNC, tales como la encefalitis (Wikoff et al., 2008) y la meningitis (Shinawi et al., 1998).

A la inversa, Sólo succinato mostró un retraso (es decir, 45 ppp) aumentar en el LCR de control tratado con PBS EAE ratones. Succinato se está convirtiendo en una valiosa en biomarcador vivo de angustia metabólico y la actividad inflamatoria (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills y O'Neill, 2014). En tono rimbombante, encontramos que succinato se redujo significativamente en el LCR de ratones trasplantados-NSC iNSC- /. La reducción de succinato de LCR tras INSC o trasplante NSC era de interés y podría tener un papel destacado en interferir con la neuroinflamación crónica.

Succinato liberado de tipo 1 MPs inflamatoria es una señal inflamatoria clave que interactúa con su específico del receptor acoplado a la proteína G SUCNR1. SUCNR1 actúa como un detector temprano de estrés metabólico en varias condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo la hipertensión renina-inducida, isquemia lesión / reperfusión, inflamación, la agregación plaquetaria, y la angiogénesis de la retina (de Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Notablemente, se encontró que se requiere la expresión de SUCNR1 para los efectos terapéuticos de NSCs trasplantados in vivo.

activación de SUCNR1 Succinato mediada en roedores y humanos iNSCs y NSCs activa la señalización de calcio y la proteína quinasa activada por mitógeno (Nafk) fosforilación in vitro, provocando de este modo la adquisición de un fenotipo antiinflamatorio concertada en NSCs. Por un lado, SUCNR1 activa la secreción de PGE2, un modulador inmune pleiotrópica bien establecida, cuya función se dirige a múltiples tipos de células en el microambiente inflamado, incluyendo parlamentarios (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). Por otra parte, señalización en iNSCs y NSC-succinato SUCNR1 condujo a la regulación al alza de dos miembros de la familia SLC13 de los co-transportadores (es decir, SLC13A3 y SLC13A5) y la adopción de succinato extracelular.

In vivo, demostramos barrido eficaz de succinato extracelular local mediante NSCs inyecta en ratones EAE través de la circulación CSF, que es predominante, en comparación con la secreción de PGE2. La pérdida de la señalización de SUCNR1-dependiente en NSCs trasplantados condujo a una reducción significativa en sus efectos anti-inflamatorios y neuroprotectores, mientras que Sucnr1 - / - injertos NSC no mostraron diferencias de supervivencia, distribución, y la diferenciación frente a NSCs de control.

entonces la hipótesis de que el succinato extracelular secretada por tipo 1 MPs inflamatorias inicia un comportamiento de eliminación que trasplanta NSCs ajustar en respuesta a un aumento de la disponibilidad de sustrato (Srisawang et al., 2007). Este novedoso acoplamiento metabólico intercelular encaja bien con la proyección literatura disponible que, dentro de microambientes específicos, células compiten por los nutrientes disponibles, que afecta a la función y el destino de cada uno (Pearce y Pearce, 2013).

Anticipamos que el agotamiento del succinato por SUCNR1 que expresan iNSCs y NSC podría desempeñar un papel crucial en la reducción de la disponibilidad de una señal metabólica clave en contextos inflamatorios en las interacciones entre las células madre trasplantadas y albergar células inmunes se vuelven complementarios (Pluchino y Cossetti, 2013). Más generalmente, Nuestros resultados están en línea con la provocación, sin embargo, todavía emergente, concepto de NSCs como guardianes ancestrales del cerebro capaces de ejercer varios moduladores y del tejido inmune efectos tróficos complementarios (Martino y Pluchino, 2007).

Se necesitan estudios adicionales para caracterizar aún más la función del eje de succinato-SUCNR1 en las interacciones neuro-inmune, proporcionar información adicional de la función crítica de metabolismo celular para las células neurales madre / progenitoras (Knobloch y Jessberger, 2017), y desarrollar intervenciones farmacológicas complementarias dirigidas a esta vía en el cerebro inflamado crónicamente.

En conclusión, se muestra aquí que las NSC sentido, el succinato extracelular que se acumula en la inflamación crónica del SNC para mejorar la neuroinflamación a través de mecanismos de succinato-SUCNR1-dependientes. Nuestro trabajo identifica un mecanismo anti-inflamatorio novela que sustenta el potencial regenerativo de somático y NSCs inducidas directamente, allanando así el camino para una nueva era de medicamentos de células madre personalizadas para las enfermedades neurológicas crónicas inflamatorias y degenerativas.


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