Humanen embryonalen Stammzellen Anbau Protokoll

 

HES (er ist) Zellen müssen überwacht und gepflegt werden, um gesund zu halten, undifferenzierte Kulturen.

Mindestens, die Kulturen müssen täglich gefüttert werden, indem eine komplette Mediumwechsel durchführen verlorene Nährstoffe wieder aufzufüllen und die Kulturen frei von unerwünschten Differenzierungsfaktoren zu halten. Obwohl eine kleine Menge der Differenzierung ist normal und erwartet in Stammzellkulturen, die Kultur sollte routinemäßig von Hand gereinigt werden entfernt, oder “Ernte” differenzierte Bereiche. Die Identifizierung und überschüssige Differenzierung von hES-Zellkulturen werden wesentliche Techniken bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Population von Zellen zu entfernen.

Protokoll

1. Instandhaltung: Beobachten Kulturen unter dem Mikroskop

Entfernen eine Platte von hES-Zellen aus dem Inkubator 37 C ° und bringen zum Mikroskop.
Beachten Sie die Kolonien mit geringer Leistung, unter Verwendung von 2 × oder 5 × Vergrößerung, die Gesamtkultur Qualität zu beurteilen. Beachten Sie das Folgende: normale Medium Farbe, Fehlen von sichtbaren Verschmutzung, Gesamtkoloniegröße, Qualität und Dichte, und alle anderen Beobachtungen.
Beachten mittlere Farbänderungen.

Aufgrund der Änderung des pH-Werts und die Erschöpfung der Nährstoffe in dem Medium nach einer Inkubation über Nacht mit den hES-Zellen, das Medium wird von einem roten Farbton zu einer Änderung “Stroh” Farbe. Wenn das Medium erscheint lila, eine basische pH-Verschiebung stattgefunden hat,. Wenn das Medium erscheint extrem gelb, Das Medium hat angesäuert. Sehr gelb Medium kann das Ergebnis der extrem überfüllter Kolonien in der gut oder Kontamination sein.

Das Medium sollte jederzeit erscheinen klar. Obwohl ein gewisses Maß an Zelltrümmer im Medium ist normal, es sollte nie trüb erscheinen. Wenn ein hohes Maß an Zelltrümmer beobachtet, die Kultur ist nicht gesund und kontaminiert sein können.
Wenn die Kulturen benötigen keine Wartung oder Passagierung, sie können zur biologischen Sicherheitsschrank genommen werden gefüttert werden

Wenn die Kulturen enthalten mehr als etwa 10% Differenzieren Kolonien, die Zellen sollten “aufgeräumt” durch manuelles Entfernen von Bereichen der differenzierten

Wenn die Kulturen enthalten große oder dichte Kolonien, oder die MEF feeder Schicht mehr als 12 Tage alt, die Zellen sollten agiert werden

2. Feeding hES-Zellen

In einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank, den Deckel der Kulturschale entfernen und das verbrauchte Medium absaugen. Sie nicht die Spitze der Pipette erlauben einen Teil der Platte zu berühren andere als direkt in den Vertiefungen. Wenn es irgendein Anliegen der Kontamination, Wechsel zu einem neuen, sterile Pipetten.
Unter Verwendung eines sterilen Glaspipette, die entsprechende Menge an gewärmt hES-Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu. Für Kulturen in einer 6-Well-Platte, hinzufügen 2.5 ml Medium pro Well.
Die Platte wird zurück in den Inkubator bei 37 ° C zu bleiben und 5% CO2.

3. Entfernen Differenzierung von hES-Zellkulturen

Verwandeln 9 Zoll-Glaspasteurpipetten in picking Werkzeuge durch die Spitzen über der gesteuerten Flamme eines Brenners Alkohol Formens. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Pipette eine Kontamination zu verhindern abgedichtet ist und abgerundet Kratzen der Kunststoff der Kulturschale zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Kommissionierung Werkzeuge vor dem Einsatz mit Hilfe der UV-Lichtquelle in dem biologischen Sicherheitsschrank oder Gehäuse Kommissionierung.
Entfernen Sie die differenzierte Bereiche. Die Differenzierung erfolgt oft in nur einem Teil einer hES-Zellkolonie, in der Regel an den Rändern oder als isolierte Flecken in der Mitte. Wenn nur ein Abschnitt einer Kolonie differenziert, nur die differenzierte Bereich muss entfernt werden. Die Differenzierung kann oft die Platte in einer abheben “klebrig” Blatt, und es ist hilfreich, zunächst die differenzierten Zellen aus dem Rest der Kolonie getrennt durch eine Linie durch die Kolonie mit dem Ende des Auswahlwerkzeuges Zeichnung.
Sobald die Stücke der Kolonie getrennt, sanft gleiten entlang der Platte den Kommissioniervorgang Werkzeug die unerwünschten Zellen abzulösen. Achten Sie darauf, nicht weg zu viel von der MEF Feeder-Schicht zwischen den Kolonien in diesem Prozess zu kratzen.
Wenn alle der differenzierten Zellen werden von der Platte entfernt (und schwebend in dem Medium), Rückkehr der Kultur zur biologischen Sicherheitsschrank. Absaugen Medium, um die differenzierten Zellen enthalten, und ersetzen mit frischem hES-Zellkulturmedium.

4. Passagierung hES-Zellen

Enzyme Incubation
In einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank, Entfernen Sie den Deckel der 6-Napf-Kulturschale und aspirieren das verbrauchte Medium von den Vertiefungen passagiert werden,. Sie nicht die Spitze der Pipette erlauben einen Teil der Platte zu berühren andere als direkt in den Vertiefungen.
Unter Verwendung eines sterilen Glaspipette, hinzufügen 1 ml warmen Kollagenase IV in jede Vertiefung werden agierte.
Die Platte wird zurück in den 37 ° C Inkubator für 5 Protokoll.
Schaben und Bündelung der hES-Zellen

Nachdem die Zellen mit Kollagenase inkubiert, beachten Sie die Kolonien unter dem Mikroskop. Das Enzym sollte eine subtile, aber beobachtbare Veränderung in der Kolonie Kanten verursacht.
In dem biologischen Sicherheitsschrank, aspirieren sanft das Enzym aus jeder Vertiefung und ersetzen mit 2.0 mL hES Zellkulturmedium.
Zünglein an der Kulturplatte in Richtung Sie leicht und nehmen die 2.0 ml Medium in der ersten Wanne mit einem 5 ml Glaspipette.

Halte die Pipette senkrecht zum Boden der Platte, sanft gleiten über die gut die Pipettenspitze, während langsam das Medium Freigabe.
Wiederholen Sie das Kratzen und Pipettieren Bewegung 3-4 mal, bis alle der Kolonien wurden aus dem Bohrloch entfernt. Pipettieren vorsichtig die Kolonien in zu kleine Stücke brechen zu vermeiden. Wenn die Zellen wurden aus dem ersten Bohrloch entfernt, lassen Sie den Inhalt in den Brunnen und beginnen die Zellen Abkratzen des nächsten wohlhabend.

Wenn alle Vertiefungen zu haben agiert gekratzt worden, bündelt das Medium um die Kolonie Stücke aus jeder Vertiefung in einem sterilen, enthaltend 15 ml konischen Röhrchen.
Spülen Sie die geschabt Vertiefungen durch Zugabe 1 mL von HES-Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung. Sammeln diese Spülung und Transfer zum konischen Rohr.

Pipettieren die Zellen sanft in die Röhre der Kolonie Stücke bis auf die gewünschte Größe zu brechen.
Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 x g.

Plattierung der hES-Zellen-Zellen

Während die hES-Zellen sind in der Zentrifuge, eine neue 6-Well-MEF Einspeiseplatte vorbereiten. Beschriften, die Platte mit den entsprechenden Zelleninformationen hES: Zelllinie, neue Passage-Nummer, und Passage Datum. Absaugen MEF Medium aus den Vertiefungen und fügen 1.0 ml PBS zu jedem Well. verwirbeln sanft den Puffer um die Vertiefungen und absaugen PBS waschen. Hinzufügen 1.5 mL hES-Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte gesetzt beiseite.

Wenn die hES-Zellen beendet Zentrifugieren, bringt das Rohr zurück zur biologischen Sicherheitsschrank. Den Überstand aspirieren, wobei darauf geachtet, nicht die lose gepackte Zellpellet zu stören.
Resuspendieren der Zellen in dem Pellet mit ausreichend Medium für 1 ml hES-Zellkulturmedium pro Vertiefung plattiert werden. Wenn die Aufteilung in 6 neue Brunnen, das Pellet in 6 ml Medium.

Sanft und gleichmäßig hinzufügen 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der vorbereiteten MEF-Zuführplatte.
Die Platte wird in den 37 ° C-Inkubator und vorsichtig die Platte nach vorne gleiten zu sichern, und von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig im ganzen gut zu verteilen.
Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C befestigen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Undifferenzierte hES-Zellen sind klein, dicht gepackt, und in der Regel bestehen aus größeren, mehr ausgebreitet Zellen.

Verschiedene morhopologies können unter geringer Vergrößerung unter dem Mikroskop zu sehen. Eine gute Zellmorphologie enthält kleine, dicht gepackt Zellen, die in einer Monoschicht wachsen. Die Zellen sollten sauber, definierten Kanten, mit wenig bis gar keine Differenzierung.

Sterility muss jederzeit aufrechterhalten werden, wenn mit hES-Zellen arbeiten. Sauber und den biologischen Sicherheitsschrank sterilisieren und alle Geräte vor dem Gebrauch.

Alle Reagenzien müssen gefiltert werden, eine mit 0.22 um Porengrße-Filter vor der Verwendung. Die Verwendung von antiboiotics in hES-Zellkultur ist nicht notwendig und sollte vermieden werden.

 

Eine separate Umgebung sollte als eine bestimmte Aufnahmestation eingestellt werden. Die sterile Umhüllung für die Station kann ein statisches Gehäuse sein, (wie beispielsweise eine PCR-Workstation) mit einer UV-Lichtquelle, eine Laminarströmungshaube, oder einem biologischen Sicherheitsschrank.

Ein Präpariermikroskop im Innern der Aufnahmestation benötigt wird, um die Kolonien als die differenzierten Bereiche entfernt werden zu beobachten,. Die vordere Glasscheibe aus einem statischen Gehäuse oder einen biologischen Sicherheitsschrank muß für die Okulare des Mikroskops ohne Beeinträchtigung der Sterilität ausreichenden Luftstrom und durch die Platte zu erstrecken, damit modifiziert werden.

Zur Erhaltung der gesunden hES-Zellkulturen, Zellen müssen zum optimalen Zeitpunkt agiert werden, typischerweise alle 4-7 Tage. Zu diesem Zeitpunkt haben die Kolonien ihre maximale Größe erreicht und können beginnen, werden zu fusionieren. Fusionierten Kolonien können die Geschwindigkeit der Differenzierung in der Kultur erhöhen. Split-Verhältnisse fallen im allgemeinen zwischen 1:3 und 1:5, in Abhängigkeit von der Anzahl der Kolonien plattiert, Expansionsrate, und Kulturbedingungen.

überplattiert Kolonien (Split-Verhältnis zu niedrig) wahrscheinlich vorzeitig fusionieren und agiert werden müssen, bevor sie ihre maximale Größe erreicht.

Kulturen auf einem feeder layer MEF, die mehr als 2 Wochen alt müssen neue MEFs agierten auf, die undifferenzierte Wachstum und die Vermehrung unterstützen.

Da Differenzierung kommt natürlicherweise in hES-Zellkulturen, eine kleine Menge wird erwartet,. Häufiger oder übermäßige Differenzierung kann auftreten, wenn die Kulturen nicht angemessene Versorgung erhalten. Die Zellen müssen täglich gefüttert werden, Überwucherung zwischen den Passagen sollte vermieden werden. Verwenden Sie immer frische Reagenzien.

Alle von den Medien, MEFs und Reagenzien werden innerhalb verwendet werden 14 Tage undifferenzierten hES Zellwachstum zu vermeiden. Neue Reagenzienchargen, wie Knockout Serum Replacement, FBS und MEFs, sollte abgeschirmt vor der Verwendung. Denken Sie daran, dass alle differenzierten Zellen vor der Passage nicht entfernt werden, um die neuen Kulturen übertragen werden.

Ebenfalls, bei 37 ° C versuchen, um die Zellen zu halten, wann immer möglich. Minimieren Sie die Zeit die Zellen außerhalb des Inkubators verbringen (z.B.. auf dem Mikroskoptisch oder in dem biologischen Sicherheitsschrank.) Ein beheizter Mikroskoptisch kann sehr vorteilhaft sein, wenn die Zellen des Inkubators für längere Zeit sein werden,.

Wenn die Beobachtung der Zelle hES Kulturen unter dem Mikroskop, zunächst prüfen, um die allgemeine Qualität und Größe der Kolonien mit einer eigenen Low-Power mit (2x oder 5x) Zielsetzung. Wenn potentiell sind differenzierte Zellen bei geringer Leistung beobachtet, bestätigen die differenzierte Morphologie eine höhere Vergrößerung Ziel mit (10X).

 


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Stammzellen Therapie