Makrophagen-Derived extrazelluläre Succinate Lizenzen Neurale Stammzellen Chronic Neuroinflammation zu unterdrücken

 

Highlights
• NSC aus somatischen Geweben oder direkte Umprogrammierung gleichermaßen reprimieren neuroinflammation
• Die extrazelluläre Succinat aktiviert SUCNR1 / GPR91 auf NSCs
• Aktiv NSCs PGE2 absondern und scavenge Succinat, so Neuprogrammierung Art 1 MPs
• Sucnr1 Mutante NSCs haben reduzierte anti-inflammatorische Aktivität nach der Transplantation
Zusammenfassung
Neuronale Stammzellen (NSC) Transplantation kann Immunreaktionen beeinflussen und unterdrückt die Entzündung im ZNS. Metabolite, wie Succinat, den Phänotyp und Funktion von Immunzellen modulieren, aber, ob und wie NSCs werden auch durch solche immunometabolites aktiviert Immunreaktivität und Entzündungsreaktionen zu steuern, ist unklar,. Hier, wir zeigen, dass transplantierte somatische und direkt induzierte NSCs durch Reduktion Succinat Spiegels im Liquor chronische ZNS-Entzündung zu lindern, mononukleäre Phagozyten abnehm wodurch (MP) Infiltration und sekundäre ZNS-Schäden. Entzündliche MPs lösen Succinat, die aktiviert Succinat Rezeptor 1 (SUCNR1)/GPR91 auf NSCs, führt sie Prostaglandin E2 absondern und extrazelluläre Succinat mit Folge anti-inflammatorische Effekte scavenge. So, unsere Arbeit zeigt eine unerwartete Rolle für die Succinat-SUCNR1 Achse in somatischen und direkt induziert NSCs, die steuert, die Reaktion von Stammzellen zu Entzündungs ​​metabolischer Signale von Typ freigesetzt 1 MPs im chronisch entzündeten Gehirn.

Einführung
Fortschritte in der Stammzellenbiologie haben Hoffnungen geweckt, die Krankheiten des ZNS kann durch nicht-hämatopoetischen Stammzellen Medikamente gelindert werden (Martino und Pluchino, 2006). Wir haben vorgesehen, zwingende Beweise dafür, dass die Transplantation von somatischen Nervenstammzellen (NSCs) verbessert die klinisch-pathologischen Merkmale von Tiermodellen von entzündlichen ZNS-Erkrankungen. Jenseits der strukturellen Ersatz der verletzten ZNS-Zellen, Unsere Arbeit hat gezeigt, dass transplantierte NSC in komplexen Stammzelltransplantat-zu-Host-Kommunikationsprogramme greifen, was zu Gesamt trophische Unterstützung und Modulation der adaptiven und angeborene Immunantwort (Bacigaluppi et al., 2009, Bacigaluppi et al., 2016, Pluchino und Cossetti, 2013, Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009b). Speziell, NSC-Transplantationen verringern die Belastung der Entzündung an der Stelle der Verletzung (Pluchino et al., 2005, Pluchino et al., 2009ein), verringert die Anzahl des Typs 1 entzündliche einkernigen Phagozyten (MPs) (Cusimano et al., 2012), und fördern die Heilung des verletzten ZNS über noch schlecht charakterisiert Mechanismen.

jedoch, die klinische Übersetzung von experimentellen NSC Therapien wird immer noch von den Quellen, aus denen menschlichen NSCs begrenzt (hNSCs) hergeleitet (Anderson et al., 2017), die intrinsische Immunogenität von allogenen HNSC Linien (Ramos-Zuniga et al., 2012, Rice et al., 2013), und die Stabilität des so genannten „beabsichtigten klinischen Zelle viel“ (Anderson et al., 2017, Wright et al., 2006). Autologe und stabil expandierbaren direkt induziert NSC (iNSCs) von Patienten dermalen Fibroblasten als Alternative zu NSC Therapien entstehen (Lu et al., 2013, Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Die direkte Umprogrammierung in iNSCs vermeidet die mühsame Progression durch einen pluripotenten Zustand und nachfolgende Differenzierung in der gewünschten Abstammungslinien für induzierte pluripotente Stammzelle beschrieben (IPSC) Technologie (Meyer et al., 2015, Thier et al., 2012). Deshalb, stabil expandierbaren iNSCs aus somatischen Zellen machen stellt den gangbaren Weg Schaft autologe Gehirn des Erhaltens Zellen für nachgelagerte klinische Anwendungen (Wörsdörfer et al., 2013). jedoch, die Wirksamkeit von direkt umprogrammiert iNSCs bei entzündlichen ZNS-Erkrankungen Behandlung wird noch nicht getestet.

In fortschrittlichen Formen der Multiplen Sklerose (FRAU), chronische Entzündung des ZNS durch weit verbreitete Aktivierung von MPs aufrechterhalten wird, die sowohl CNS resident Mikroglia und umfassen Monozyten abgeleiteten Makrophagen infiltrieren (Mallucci et al., 2015). MPs sind in der grauen Substanz Läsionen gefunden, zu degenerieren Neuriten und neuronalen Zellkörper schließen (Peterson et al., 2001), und in Läsionen der weißen Substanz, wobei der äußere Rand der aktivierten Mikroglia mit chronischen Gewebeschädigung assoziiert (Bramow et al., 2010, Prineas et al., 2001). Bereiche der weißen Substanz normal erscheine werden auch durch MP Akkumulation gekennzeichnet, was zu der Bildung von Mikroknollen, die Krankheitspathologie Antrieb unabhängig von Begleit T-Zell-Aktivierung (Moll et al., 2011). Die schädliche Rolle der chronischen MP-driven Entzündung in progressiver MS wird auch durch Beweise in Tierkrankheitsmodellen unterstützt, wo seine Gesamtbelastung korreliert mit einer eingeschränkten neuronalen Funktion (Plank et al., 2017), Gehirnschwund (Tambalo et al., 2015), und Regenerationsreaktionen vermindert (Jiang et al., 2014).

Die Aktivierung von MPs durch proinflammatorische Stimuli verursacht einen metabolischen Schalter auf Glykolyse und reduzierte oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) (Kelly und O'Neill, 2015). Aktuelle Hinweise darauf, dass, innerhalb dieser metabolischen Neuverkabelung, Art 1 entzündliche MPs akkumulieren Succinat, wichtige pathophysiologische Implikationen (Tannahill et al., 2013). Intrazelluläres Succinat hemmt die Aktivität der Enzyme prolyl Hydroxylasen (PHDs), Stabilisierungs dadurch Hypoxie reagierendes Element (HIF)-1a und Induzieren der Transkription von Interleukin (IL)-1b (Tannahill et al., 2013). Außerdem, Oxidation von Succinat durch Succinatdehydrogenase (SDH) repurposes von ATP-Synthese Mitochondrien reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion als zusätzliches proinflammatorischer Signal (Mills et al., 2016). Art 1 entzündliche MPs löst auch Succinat extrazellulär und seinen verwandten Succinat Rezeptor upregulate 1 (SUCNR1), ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (auch als GPR91 bekannt), welche als autokrine und parakrine Sensor zu verbessern IL-1β-Produktion (Littlewood-Evans et al., 2016).

So wie, Stoffwechsel zeichnet sich als ein wichtiges therapeutisches Ziel die Aktivierung beiden Makrophagen zu modulieren (Kelly und O'Neill, 2015) und Mikroglia (Orihuela et al., 2016), und Succinat bezogene Wege haben Schlüssel immunmodulatorischen Funktionen für akute und chronische entzündliche Erkrankungen (Ryu et al., 2003, Tannahill et al., 2015).

Angesichts der etablierten immunmodulatorischen Eigenschaften von NSCs (Pluchino und Cossetti, 2013), Wir vermuten, dass NSCs ihre therapeutische Wirkung bei chronischer neuroinflammation durch Modulation MP Stoffwechsel in Richtung Verringerung der sekundären ZNS-Schäden ausüben.

In dieser Arbeit, Wir untersuchten die molekularen Mechanismen, die die Fähigkeit der somatischen und direkt induzierten NSC untermauern die metabolischen Veränderungen des Typs entgegenzuwirken 1 Entzündungs ​​MPs sowohl in vivo und in vitro. Wir zeigen, dass transplantierte iNSCs und NSC funktionell äquivalent ist, mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis bei Mäusen chronische neuroinflammation Lindern (EAE). Transplantierte iNSCs / NSC Schalter in dem Aktivierungsprofil von CNS-resident Mikroglia und Monocyten abgeleiteten Makrophagen zu einem anti-inflammatorischen Phänotyps Infiltrieren, sowie die Pegel des immunometabolite Succinat in der Zerebrospinalflüssigkeit senken (CSF). iNSCs / NSCs verringern auch extrazelluläre Succinat nach Typ freigegeben 1 entzündliche MPs ihren Stoffwechsel in Richtung OXPHOS in vitro umprogrammieren. mechanistisch, Wir zeigen, dass Succinat nach Typ sezerniert 1 MPs entlockt in iNSCs / NSC eine Signalkaskade nachgeschalteten SUCNR1, die es ermöglicht, ihre entzündungshemmende Wirkung. Die Succinat-lizenzierten antiinflammatorische Funktion der iNSCs / NSC wird durch die Sekretion von Prostaglandin-vermittelt (PG) E2, sowie durch erhebliche Abfangen von extrazellulären Succinat. Der Verlust der Sucnr1 Funktion in NSCs führt zu deutlich anti-inflammatorischen Aktivitäten in vitro reduziert und in vivo nach der Transplantation in EAE.

Unsere Studie deckt eine Succinat-SUCNR1 Achse, die verdeutlicht, wie NSCs auf entzündliche Stoffwechselsignale reagieren, um die Aktivierung von Typ zu hemmen 1 MPs bei chronischer neuroinflammation.

Ergebnisse
NSC Transplantation mildert chronische Neuroinflammation und mit Reduktion des Immunometabolite Succinate in der Zerebrospinalflüssigkeit Gekoppelt
Wir untersuchten zunächst die Auswirkungen der intracerebroventricular (iCV) Transplantation auf Höhepunkt der Krankheit (PD) von iNSCs oder NSC in Mäusen, die mit chronischer EAE und verglich sie mit PBS behandelten Kontroll EAE Mäuse MOG35-55 Induzierte. Vor der Transplantation, iNSCs und NSCs wurden erweitert, dadurch gekennzeichnet, (Fig S1), und markiert mit farnesylierte (f)GFP in vitro. Beim 30 Tage nach der Transplantation (abrufbar), Insc und NSC-Transplantationen überlebt, verteilt, und integriert innerhalb des EAE Gehirn und Rückenmark (Abbildung S2). Nur eine Minderheit der abgerufenen fGFP + Zellen (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSCs: 1.7% ± 0.1%) wurden wuchernden (1A) oder exprimierenden neuronalen (1B), Astroglia (1C), oder oligodendroglial (1D) Lineage Marker (Abbildung S2). Die Mehrheit (~ 75%) von iNSCs bis zur Transplantation überlebten, wurden stattdessen nicht zu exprimieren, eine der neuronalen Linie Marker getestet und lokalisierende um meningeal perivaskuläre nischenartigen Bereiche in der Nähe F4 / 80 + endogenen MPs gefunden (1E), wie in somatischer NSC Transplantaten beobachtet (Cusimano et al., 2012, Pluchino et al., 2003). Die Transplantation von iNSCs induzierte eine deutliche und dauerhafte (bis zu 90 abrufbar) Verbesserung der EAE-Scores, die begann aus 15 zu 20 dpt Weiter (Figuren 1F und S2). Funktionelle Erholung wurde auch durch computergestützte automatische Ganganalyse bestätigt (Abbildung S2). Insgesamt, ICV-transplantierten iNSCs waren sicher und führte zu Verhaltens- und pathologischen Erholung.

Wir analysierten dann die Zusammensetzung von ZNS-entzündlichen Infiltraten über ex vivo Durchflusszytometrie in Insc- und NSC-transplantierten gegen PBS behandelten Kontroll EAE Mäuse. Die Transplantation von iNSCs oder NSCs hatte keine Auswirkungen auf den Anteil von ZNS-infiltrierenden T-Zellen, B-Zellen, und insgesamt MPs, sowie in dem von CD3 + / CD4 + T-Zell-Subsets (einschließlich Th1, Th2, Treg, ThGM-CSF, und Th17 Subsets) beim 30 abrufbar (Abbildung S3). Stattdessen, NSC- oder NSC-transplantierten Mäusen EAE einen signifikanten Schalter in dem Aktivierungsprofil von CX3CR1 + Zellen mit ~ 1,5-fachen Abnahme der CD80 + Typ zeigten 1 Entzündungs ​​Mikroglia und parallel Erhöhung des MRC1 + anti-inflammatorischen Mikroglia (1G). Gleichfalls, CNS-Infiltrations (Monocyten stamm) CCR2 + Makrophagen aus Insc- oder NSC-transplantierten Mäuse EAE unterzogen signifikante Phänotyp Schalter mit ~ 1,3-fachen Abnahme des CD80 + -Typs 1 entzündlichen Makrophagen und parallel ~ 1,8-fachen Anstieg der MRC1 + anti-inflammatorischen Makrophagen (Abbildung 1 H). Dieser Effekt wurde durch eine signifikante Reduktion der Expression des Typs begleitet 1 inflammatorischer Marker MP induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) durch F4 / 80 + MPs in vivo (Figuren 1I und S3).

Wir analysierten dann die Expressionsniveaus des Haupt Pro- und entzündungshemmende Gene im gesamten ZNS. NSC- und NSC-transplantierten EAE Mäuse zeigten beide signifikant reduzierte Mengen von Interleukin-1 beta (IL1B) im Gehirn und Rückenmark und die erhöhten Konzentrationen an Mannose-Rezeptor Typ C 1 (MRC1) im Rückenmark, sowohl bei 10 abrufbar (Abbildung 1J).

Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilität bei 30 dpt, wenn sie mit PBS behandelten Kontroll EAE Mäuse iNSC- / NSC-transplantierten Vergleichens (Abbildung S3).

Endlich, NSC- und NSC-transplantierten EAE Mäuse akkumulierten signifikant reduziert Verlust von Axonen (Abbildung 1 K) und Demyelinisierung (Abbildung 1L) im Rückenmark.

Angesichts der etablierten Bedeutung des Stoffwechsels bei der Regulierung der Phänotyp und Funktion von MPs, wir untersuchten, ob NSC Transplantationen das neuroinflammatorische metabolische Mikro betroffen. Zu diesem Zweck, führen wir ein ungezielte metabolischen Profile polarer Metaboliten durch Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie gekoppelt (LC-MS) angepaßter CSF und Plasmaproben (Tabelle S1). PBS-behandelten Kontroll EAE Mäuse zeigten eine signifikante Zunahme von mehreren CSF (aber nicht Plasma) Metaboliten, unter denen Succinat kulminierte nur an 45 Tage nach der Immunisierung (dpi) (korrespondierend zu 30 abrufbar; Abbildung 1 M). EAE Mäuse unterzogen nicht zu der Operation zeigten auch einen signifikanten erhöhte Succinat nur im Liquor bei 45 dpi (im Vergleich zu gesunden Kontrollmäuse), das war nicht verschieden von den Ebenen von Succinat in den CSF PBS-behandelten Kontroll EAE Mäuse (Abbildung S3).

Während wir keine signifikante Veränderung der Plasma Metabolitspiegeln nicht erkannt wurde zwischen Insc / NSC-transplantierten und Kontroll EAE Mäuse-PBS behandelt (Tabelle S1), Wir fanden heraus, dass die Transplantation von iNSCs oder NSCs zu einem deutlichen Rückgang in CSF Succinat führte bei 30 abrufbar (Abbildung 1 M; Tabelle S1).

Des Weiteren, wir fanden keine signifikanten Unterschiede in CSF Succinat, wenn PBS-behandelten Mäusen EAE Vergleich gegen EAE Mäuse mit Maus-Fibroblasten icv injizierte (MFS) Als Kontrollzellen (Abbildung S3).

So, iNSCs und NSC direkt in das ZNS EAE injiziert, um einen spezifischen Phänotyp Schalter von MPs induzieren, die mit Reduktion des immunometabolite Succinat im Liquor nur und Linderung von chronischer neuroinflammation assoziiert.

NSCs reduzieren Succinate Levels und umprogrammieren den Stoffwechsel von Typ 1 Entzündliche M & phi; In-vitro
Wir untersuchten dann die molekularen Mechanismen, durch die iNSCs / NSCs auf Art anti-inflammatorische Aktivitäten anzeigen 1 MPs, Verwendung eines in vitro-System, das die Wechselwirkungen zwischen MPs und iNSCs / NSC rekapituliert. Naive Knochenmark stammenden Makrophagen (M & phi;) wurden in einen Typ polarisierten 1 entzündlichen Phänotyp mit LPS (MφLPS), wie beschrieben (Tannahill et al., 2013). MφLPS wurden dann cokultiviert mit iNSCs (MφLPS-iNSCs) oder NSCs (MφLPS-NSCs) in einem trans gut-System für das vermeidet Zell-zu-Zell-Kontakte (2A). Unpolarisiertes M & phi; wurden als Kontrollen verwendet.

Microarray-Genexpressionsprofile zeigten signifikante transkriptionelle Veränderungen in MφLPS mit 7,401 Gene betroffen (im Vergleich zu M & phi;; p-Wert eingestellten < 0.1; 2B; Tabelle S2) und 51 differentiell exprimierte Gene in MφLPS-iNSCs oder MφLPS-NSC (gegen MφLPS; p-Wert eingestellten < 0.1; Figuren 2B und 2C; Tabelle S2). Diese letztere Gruppe von Genen wurde in biologischen Prozessen zu positiver Regulation der Leukozytenaktivierung bezogen angereichert (GEHEN: 0002696), myeloischen Leukozytendifferenzierung (GEHEN: 0002761), und Immunsystem Prozesse (GEHEN: 0002376). Unabhängige qRT-PCR-Validierung ausgewählter M & phi; proinflammatorischen Gene bestätigt signifikante Herabregulation der Expression von IL12B, IL-15, Il15ra, und CD69, sowie die klassischen Entzündungsgenen NOS2, Tumornekrosefaktor (tnf), und IL1B in MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs (gegen MφLPS; 2D). Dieser Effekt wurde mit der gleichzeitigen Heraufregulierung der Expression von Genen verbunden ist, die mit einem anti-inflammatorischen Phänotyps M & phi;, wie uronyl-2-Sulfotransferase (Absatz) und Knochenmark-Stromazellen Antigen 1 (bst1) (Al-Shabany et al., 2016, Martinez et al., 2015), sowie arginase 1 (arg1) und MRC1 (gegen MφLPS; 2E). Wenn iNSCs / NSCs wurden cokultiviert mit Lipopolysaccharid (LPS)-aktivierten Maus BV2 Mikroglia-Zellen wie zuvor, signifikante Reduktion der Expression von proinflammatorischen Genen NOS2 und IL1B wurde auch beobachtet, (2F).

Genexpressionsprofile mit funktionellen metabolischen Zuständen zu verbinden, Wir untersuchten die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und extrazelluläre Ansäuerungsgeschwindigkeit (ECAR) von MφLPS als Auslesungen ihrer tricarbonsäure (TCA) Zyklus und glykolytischen Aktivitäten, beziehungsweise. Wir fanden eine signifikante Reduktion der OCR und eine deutliche Steigerung von ECAR in MφLPS (gegen Mφs). Stattdessen, MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSC unterzog signifikante Wiederherstellung der beiden OCR und ECAR Werte (gegen MφLPS; Die Figuren 2g und 2h), wie es in M ​​& phi; Umschalten zu einem anti-inflammatorischen Phänotyps beobachtet (O'Neill und Pearce, 2016).

Im Bemühen, die metabolischen Determinanten dieser anti-inflammatorischen Effekte zu klären, führen wir eine ungezielte LC-MS-Analyse des extra- und intrazellulären niedermolekularen Metaboliten Gehalt an MφLPS. Wie erwartet, LPS-Stimulation verändert tiefgreifend die extrazelluläre und intrazelluläre Stoffwechsel Milieu der M & phi; (MφLPS) (im Vergleich zu M & phi;; Tabelle S3). In Co-Kulturen, MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs zeigten beide signifikante Reduktion der extrazellulären Glutamat, GABA, und Succinat (gegen MφLPS; 2I; Tabelle S3). Außerdem, MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs auch eine signifikante Reduktion des intrazellulären Succinat angezeigt und Itaconats (gegen MφLPS; 2J; Tabelle S3).

In Übereinstimmung mit der Reduktion von Succinat Ebenen, wir fanden, dass MφLPS-iNSCs und MφLPS-NSCs Ebene von HIF-1α deutlich reduziert zeigten, des Upstream-Protein Pyruvatkinase-Isoenzyms M2 (PKM2) (Palsson-McDermott et al., 2015; Abbildung 2K), sowie von IL-1β (gegen MφLPS; 2L).

Insgesamt, Diese in-vitro-Daten belegen, dass iNSCs / NSCs die Ansammlung von sowohl intra- und extrazellulären Succinat in Co-Kulturen mit Typ reduzieren 1 entzündliche MPs, Neuprogrammierung sie zu einem OXPHOS entzündungshemmende Phänotyp.

Succinate Signale über SUCNR1 / GPR91 in Maus und Mensch NSCs
Angesichts der Bedeutung von Succinat als immunometabolic Signal, wir untersuchten, ob Succinat nach Typ freigegeben 1 proinflammatorischen MPs die Aktivität von umgebenden Zellen in situ regulieren, einschließlich von transplantierten iNSCs / NSC.

Wir fanden, dass transplantierte iNSCs / NSC in der Nähe erfasst perivaskulären Bereichen meningealen (Figuren 3A und 3B ) und F4 / 80 + MPs (3C) SUCNR1 in vivo im ZNS exprimiert. SUCNR1 wurde auch auf Proteinebene auf beiden iNSCs und NSCs in vitro exprimiert, aber nicht in MFS (Abbildung 3D).

Zur weiteren Beurteilung, ob SUCNR1 in iNSCs / NSCs wurde funktionell aktiviert durch Succinat, untersuchten wir seine stromabwärtigen Signalkaskade in vitro. Wenn ausgesetzt Succinat (3E; Rubic et al., 2008), 34.2% (± 7,4%) von iNSCs und 31.7% (± 6,5%) eine Freisetzung von intrazellulären Calciumvorräte NSC zeigten (Figuren S4 und 3F). Diese Antwort wurde durch eine signifikant erhöhte Expression des Phospho-p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase gefolgt (Abbildung 3G), indikativ für seine Aktivierung. Wir bestätigten die Expression von SUCNR1 und SUCNR1 auch in menschlicher fetaler NSCs (hNSCs) und menschliche iNSCs (hiNSCs) (Figuren 3H und 3I). Wie in Maus iNSCs, Succinat-p38-abhängige Signalgebung wurde in hiNSCs evozierten, aber nicht in hiNSCs mit dem selektiven Inhibitor SUCNR1 4c vorbehandelte (3J).

So, Maus und Mensch iNSCs und NSCs exprimieren funktionelle SUCNR1, das induziert einen Signalweg stromabwärts seiner Stimulation mit dem Succinat immunometabolite.

SUCNR1 Stimulation Leitet die Sekretion von Prostaglandin E2 durch NSCs
Um die funktionellen Konsequenzen von SUCNR1 zu klären in NSCs Signalisierung, wir erzeugen NSCs von Mäusen fehlen Sucnr1 (Sucnr1 - / - NSCs) (Rubic et al., 2008; Abbildung S4). Im Vergleich NSCs zu steuern, Sucnr1 - / - NSC zeigten ähnliche Wachstumskurven und die Differenzierung in vitro (Abbildung S4). jedoch, wenn ausgesetzt zu verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen Succinat, Sucnr1 - / - NSCs zeigte keine upregulation von Phospho-p38 (Abbildung S4). Stimulation mit Glutamat oder ATP + Thapsigargin induzierte in Sucnr1 - / - NSC eine Calcium-Reaktion ähnlich der NSC Steuer (Abbildung S4). Andererseits, Succinat Behandlung nicht Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speicher entlocken (Abbildung S4), das ergab eine defekten SUCNR1 in Sucnr1 Signalisierung - / - NSC.

Wir führten dann eine Expressionsgen Microarray Profilierungs nach der Behandlung mit Succinat in Steuer NSC und Sucnr1 - / - NSC (Tabelle S4). Wir fanden heraus, dass Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase 2 (PTGS2), das Schlüsselenzym in PG-Biosynthese codiert, das induzierbar PTGS2, war die hochregulierten Gens in Succinat-stimulierten Kontroll NSC (log2 fache Veränderung 1.05), aber nicht in Succinat-stimulierte Sucnr1 - / - NSCs (log2 fache Veränderung -0,43; 4A). Wir validiert diese Ergebnisse auf PTGS2 durch qRT-PCR, bestätigt, dass seine Expressionsniveaus signifikant hochreguliert (2.1- bis 2,7-fache Veränderung) in Succinat-stimulierte iNSCs und NSC, während sie nicht in Succinat behandelten Sucnr1 waren - / - NSCs (4B).

Angesichts der Rolle von PGE2 als Regulator der immunsuppressiven Wirkungen von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) (Vasandan et al., 2016, Yañez et al., 2010), testeten wir die Ansammlung des Gases in Gewebekulturmedien von iNSCs, NSCs, und Sucnr1 - / - NSCs nach Stimulation mit Succinat. iNSCs und NSCs, aber nicht Sucnr1 - / - NSCs, zeigten eine signifikante (>2.5-falten) Erhöhung ihrer basalen Freisetzung von PGE2 bereits 30 min nach Succinat. Der Succinat-induzierter Effekt wurde durch die Vorbehandlung mit den irreversiblen PTGS2 blocker SC-58125 abgeschafft (4C). Wie in Maus iNSCs, Exposition von hiNSCs Succinat einen signifikanten Anstieg der PGE2-Konzentrationen in Gewebekulturmedien hervorgerufen, während wieder Vorbehandlung entweder mit SC-58125 oder 4c verhindert seine Freigabe (Figur 4D).

Um die Relevanz dieser Ergebnisse zu erweitern, um Kokulturen zwischen NSCs und MφLPS, analysierten wir die Ebene von PGE2 in Gewebekulturmedien. Wir fanden, dass MφLPS-NSCs höhere PGE2 akkumulierten im Vergleich zu MφLPS, wohingegen die Vorbehandlung von cokultiviert NSC mit SC-58125 deutlich reduziert PGE2 Ebenen (4E). SC-58125 Vorbehandlung von NSC wurde auch mit einer signifikanten Erhöhung der Expression in IL1B MφLPS gekoppelt (4F) und mit einer Reduktion von OCR Wert indikativ für einen pro-inflammatorischen Phänotyps (4G). jedoch, bemerkten wir, dass NSCs vorbehandelt mit SC-58125 einige Restentzündungshemmende Wirkung auf MφLPS im Vergleich zu Sucnr1 beibehalten - / - NSCs (4F). Andererseits, Sucnr1 Verlust der Funktion in NSCs vollständig abgeschafft ihre entzündungshemmende Wirkung auf MφLPS (Figuren 4F und 4G). Wir zeigen auch, dass die beobachtete PGE2 abhängige entzündungshemmende Fähigkeit von NSCs konserviert ist und relevant für die menschliche NSCs.

So wie, hiNSCs induzierte eine signifikante Reduktion der IL1B Expression in MφLPS in Co-Kulturen (4H), die mit einer Wiederherstellung der OCR-Werte gekuppelt (4I) und erhöhte PGE2 Ebenen in Gewebekulturmedien (4J). Diese Effekte wurden vollständig durch eine Vorbehandlung mit dem selektiven hiNSCs SUCNR1 Inhibitor 4c unterdrückt (Figuren 4H-4J).

So, die Aktivierung von SUCNR1 Signalwegs in Maus und Mensch NSC löst die Freisetzung von PGE2 was zu anti-inflammatorische Effekte auf Art 1 MPs.

jedoch, Hemmexperimente entweder PTGS2 oder SUCNR1 erwarten, dass zusätzliche SUCNR1-abhängige-PGE2-unabhängige-Mechanismen sind wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei den anti-inflammatorischen Effekten von NSCs Targeting spielen.

SUCNR1 Stimulation Löst die Aufnahme von Succinat durch NSCs
Genexpressionsarrays von Succinat-stimulierte NSCs ergab, dass, neben PTGS2, Nist / Slc13a5 gehörte zu den am meisten nach oben regulierten Gene in Wildtyp (WT) NSCs (log2 fache Änderung = 0.49), aber nicht in Sucnr1 - / - NSCs (log2 fache Änderung = -0,12). SLC13A5 ist ein Dicarboxylat Co-Transporter bekannt in Succinat Transport beteiligt zu sein (Srisawang et al., 2007). In Anbetracht fand der konsequente Abbau von Succinat sowohl in vivo im Liquor von Insc- oder NSC-transplantierten EAE Mäuse und in vitro in Co-Kulturen mit MφLPS, Wir vermuten, dass iNSCs / NSCs SLC13A5 Succinat auszuspülen aktivieren würde.

Wir fanden heraus, dass die Expression von SLC13A5, sowie der hochaffinen dicarboxylat Co-Transporter SLC13A3, wurden in iNSCs und NSCs deutlich erhöht, aber nicht in Sucnr1 - / - NSCs, auf Succinat Stimulation (5A). Ähnlich, hiNSCs zu Succinat ausgesetzt aufreguliert die Proteinexpressionsniveaus beide dieser SLC13 Co-Transporter in vitro (5B).

Wir untersuchten als nächstes die Rolle dieser Co-Transporter durch Succinat Aufnahme in iNSCs Messen und NSCs. Wir fanden heraus, dass beide iNSCs und NSCs deutlich akkumulierte [14C]-Succinat (5C) bei gleichzeitiger Reduzierung der Menge an extrazellulären [14C]-Succinat in Gewebekulturmedien (5D). Sucnr1 - / - NSCs weder akkumulierte [14C]-Succinat intrazellulär noch haben sie verarmen es extrazellulär (5C und 5D). Interessant, Sucnr1 - / - NSCs, die wir haben gezeigt, in MφLPS keine Auswirkungen auf IL1B Ausdruck haben (4F), nicht gelungen, die extrazelluläre Succinat Ebene in Co-Kulturen mit MφLPS zu reduzieren (5E). Als weiterer Beweis für die Bedeutung von Succinat Abreicherung des Phänotyps des Typs modulierenden 1 proinflammatorischen MPs, wir zeigen, dass die Behandlung mit aktiven rekombinanten (r)SDH-Komplex A-Untereinheit in der Lage, signifikant die Expression von IL1B in MφLPS zu reduzieren (Abbildung S5).

So, SUCNR1 Signalisierung in NSCs fordert die Aufnahme des immunometabolite Succinat, abbau wodurch die verfügbar extrazellulären Pool die autokrine und parakrine Aktivierung von Typ erhalt 1 MPs.

Die Transplantation von Sucnr1 Loss-of-Function NSCs Zeigt beeinträchtigte Fähigkeit, chronische Neuroinflammation In Vivo abzumildern
die Rolle der Succinat-SUCNR1 Achse bei der Vermittlung der Reaktion von NSC-Transplantaten zur Bestätigung in vivo Succinat, Wir untersuchten die Auswirkungen der ICV Transplantation von Sucnr1 - / - NSCs bei Mäusen mit chronischem EAE.

Beim 30 abrufbar, Sucnr1 - / - NSCs überlebt, verteilt, und integriert innerhalb des EAE Gehirn und Rückenmark keine signifikanten Unterschiede im Vergleich NSCs zu steuern (Abbildung S6). jedoch, die Transplantation von Sucnr1 - / - NSCs nur eine leichte Erholung von EAE Verhaltensdefizite im Vergleich zu PBS-behandelten Kontroll EAE Mäusen induziert (EAE-Grad-Sucnr1 - / - NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), Das war deutlich weniger ausgeprägt (50% der Effekt) als die in EAE Mäuse transplantiert mit Steuer NSCs beobachtet (EAE-Score-NSCs: 2.1 ± 0.3; 6A).

Ex-vivo-Durchflusszytometrie-basierte Analyse der Zusammensetzung von ZNS-entzündlichen Infiltraten zeigte, dass die Transplantation von EAE Mäusen mit Sucnr1 - / - NSC nicht gelungen, die Anteile von Typ zu verschieben, 1 inflammatorische und anti-inflammatorische MPs-einschließlich CX3CR1 + Mikroglia und CCR2 + Monozyten abgeleiteten Makrophagen-im Gegensatz zu den Wirkungen der Steuer NSC Infiltrieren (6B und 6C). Post mortem Gewebe Pathologie bestätigte ferner die reduzierte gewebeschützende Wirkung von Sucnr1 - / - NSC Transplantate (Figuren 6D und 6E).

Wir untersuchten dann die Ebenen von PGE2 und Succinat in abgestimmt CSF und Plasmaproben von NSC-transplantierten und PBS-behandelten Kontroll EAE Mäuse. Wir fanden heraus, dass beide Sucnr1 - / - NSCs und Kontrolle NSCs signifikanten Veränderungen der Höhe der PGE2 in der CSF induzieren fehlgeschlagen. nur Plasma PGE2 deutlich erhöht in EAE-Mäusen (im Vergleich zu gesunden Kontrollen), ohne Wirkung der Behandlung beobachtet (6F). Wichtig, während der Transplantation von Steuer NSC CSF Succinat reduziert (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSCs: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1 - / - zeigte NSC Transplantate keine Auswirkungen (Sucnr1 - / - NSCs: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; 6G).

Diese Daten bestätigen die Anforderung eines funktionellen SUCNR1 Signalwegs in der Regulation der entzündungshemmenden und neuroprotektiven Wirkungen von NSC-Transplantationen und in vivo unterstreichen die Bedeutung von Succinat Fänger als vorherrschendem entzündungshemmende Wirkmechanismus von NSC.

Diskussion
Es gibt einen ungedeckten klinischen Bedarf zelluläre und molekulare Ansätze zu entwickeln Kerntreiber der Pathophysiologie chronischer neuroinflammatorische Bedingungen zu zielen, die progressive Formen der MS umfassen (Volpe et al., 2016). Allgemein gesagt, Stammzellen besitzen ein therapeutisches Potential, das sich von der kleinen Moleküle und Biologika und erstrecken sich weit über die klassischen regenerativen Medizin Arena getrennt ist. Teil Droge und ein Teil Gerät, Stammzellen können als biologische disease modifying Agenten arbeiten (DMAs) dass Sinn diverse Signale, auf bestimmte Stellen im Körper wandern, Integration von Eingaben, Entscheidungen zu treffen, und führen komplexe Antwortverhalten im Zusammenhang mit einer spezifischen Gewebe-Mikroumgebung (Fischbach et al., 2013). Alle diese Attribute können nutzbar gemacht werden, um mehrere Krankheitsprozesse zu behandeln, einschließlich der persistente Entzündung und Gewebedegeneration MP-angetrieben, die in progressiver MS auftreten.

Hier, wir verwenden zugänglich, autologe, und stabil expandierbaren iNSCs (Thier et al., 2012), sowie somatische NSCs, die Effekte von Gehirn Stammzelltransplantation in einem Mausmodell der chronisch neuroinflammation zu untersuchen, die ahmt die Entzündungskaskade in progressiver MS beobachtet.

Wir fanden, dass die Transplantation von iNSCs in die CSF Zirkulation von EAE Mäuse äquivalente Ergebnisse zu denjenigen fördert zuvor in Mäusen beobachtet, die mit somatischen NSC transplantiert (Pluchino et al., 2003). Transplantierte iNSCs oder NSCs signifikante klinische Verbesserung induziert, sowie reduzierte axonalen und Myelinschäden, ohne signifikante Reduktion der BHS-Permeabilität bei 30 abrufbar. Weitere Studien zur Klärung, ob Änderungen von BHS-Permeabilität oder Rekrutierung von Entzündungs ​​Monozyten an das ZNS sofort auftreten, nach der Transplantation von iNSCs / NSCs. Ob ein solcher Effekt ist wahrscheinlich die wichtigsten klinischen Ergebnisse von Erkrankungen mit hoher Prävalenz von ZNS-Infiltration von Entzündungszellen ändern, wie EAE / MS, ist schwer zu antizipieren.

Stattdessen, fanden wir, dass unser Paradigma der Transplantation mit einem bestimmten Switch in dem Aktivierungsprofil beide CX3CR1 + Mikroglia-Zellen und CCR2 + Monocyten stamm infiltrierenden Makrophagen, die mit einer Abnahme des CD80 + Typs zugeordnet wurde 1 entzündliche MPs und paralleler Anstieg des MRC1 + anti-entzündliche MPs. Transplantierte iNSCs / NSCs verteilt und überlebte im ZNS von EAE Mäuse, während vorzugsweise auf der Ebene der meningeal perivaskuläre Bereiche nebeneinander zu endogenen MPs Akkumulieren. Insgesamt, Diese Ergebnisse würden die Anwesenheit von einigen noch unbekannten Mechanismen der interzellulären Kopplung zwischen gepfropft Stammzellen und Entzündungs ​​MPs implizieren. Ob diese Insc / NSC-MP-Kommunikation in vivo findet nur in perivaskulären Nischen oder auch auf der Ebene der anderen Schwellenimmunsensor artige Strukturen des Gehirns, die den Plexus gehören bleibt zu richten (Ge et al., 2017).

Wir untersuchten dann die zugrunde liegenden immunologischen Mechanismen die positiven Wirkungen von NSCs auf MPs während der chronischen neuroinflammation Fahr. Ungezielte kleine Molekülanalyse angepaßten CSF und Plasmaproben ergab profunde metabolische Veränderungen im Liquor von EAE-Mäusen, mit den Unterschieden zwischen den frühen und den verzögerten Phasen der Krankheit.

Carnitin, Leucin + Isoleucin, Citrullin, Allantoin, Ornithin, und Harnsäure wurden alle deutlich in der PBS-behandelten Kontroll EAE Mäuse auf dem Höhepunkt der Krankheit erhöht. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit den veröffentlichten Beweise dafür, dass Leucin zeigt, sowie Harnsäure und dessen Nebenprodukt Allantoin, sind alle in der CSF von Patienten mit MS erhöht (Amorini et al., 2009, Hooper et al., 1998, Monaco et al., 1979). Während erhöhte CSF Carnitin wurde in MS nicht gemeldet, wichtige Erhöhungen wurden in nicht-MS entzündlichen Erkrankungen des ZNS beschrieben, wie Enzephalitis (Wikoff et al., 2008) und Meningitis (Shinawi et al., 1998).

Umgekehrt, nur zeigte Succinat ein verzögertes (d.h., 45 dpi) Erhöhung in der CSF von PBS-behandelten Kontroll EAE Mäuse. Succinat ist ein wertvolles In-vivo-Biomarkers von metabolischer Not immer und inflammatorischer Aktivität (Littlewood-Evans et al., 2016, Mills und O'Neill, 2014). Wichtig, wir fanden, dass Succinat deutlich wurde in der CSF von iNSC- / NSC-transplantierten Mäusen verringert. Die Reduktion von CSF Succinat folgenden Insc oder NSC Transplantation war von Interesse und könnte eine wichtige Rolle bei störenden mit chronischer neuroinflammation hat.

Succinat von Typ freigegeben 1 Entzündungs ​​MPs ist ein Schlüsselsignal, das inflammatorische SUCNR1 mit seinen spezifischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor interagiert. SUCNR1 fungiert als Früh Detektor von metabolischem Stress in verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen, einschließlich Renin-Hypertension induzierte, Ischämie / Reperfusion, Entzündung, Thrombozytenaggregation, und retinalen Angiogenese (Castro Fonseca et al., 2016, Gilissen et al., 2016). Vor allem, wir fanden, dass die Expression von SUCNR1 für die therapeutische Wirkung von transplantierten NSCs in vivo erforderlich ist.

Succinat-vermittelte Aktivierung von SUCNR1 auf Nagetier- und menschlichen iNSCs und NSC aktiviert Calcium-Signalisierung und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (Nafk) Phosphorylierung in vitro, so Hervorrufen des Erwerbs einer konzertierten entzündungshemmende Phänotyp in NSCs. Auf der einen Seite, SUCNR1 aktiviert, um die Sekretion von PGE2, ein gut etabliertes pleiotropes Immunmodulator, deren Funktion zielt mehrere Zelltypen innerhalb des entzündeten Mikro, einschließlich MPs (Kota et al., 2017, Vasandan et al., 2016). Andererseits, Succinat-SUCNR1 in iNSCs und NSCs Signalisierung führte zur Heraufregulierung von zwei Mitgliedern der SLC13 Familie von Co-Transportern (d.h., SLC13A3 und SLC13A5) und die Aufnahme von extrazellulären Succinat.

in vivo, we demonstrate effective scavenging of extracellular local succinate by NSCs injected in EAE mice through the CSF circulation, which is predominant, compared to the secretion of PGE2. The loss of SUCNR1-dependent signaling in transplanted NSCs led to significant reduction in their anti-inflammatory and neuroprotective effects, whereas Sucnr1−/− NSC grafts showed no difference of survival, distribution, and differentiation versus control NSCs.

We then hypothesize that the extracellular succinate secreted by type 1 inflammatory MPs initiates a scavenging behavior that transplanted NSCs adjust in response to increased substrate availability (Srisawang et al., 2007). This novel intercellular metabolic coupling fits well with the available literature showing that, within specific microenvironments, cells compete for available nutrients, affecting each other’s function and fate (Pearce and Pearce, 2013).

Wir gehen davon aus, dass Succinat Verarmung durch SUCNR1-exprimierenden iNSCs und NSCs könnte bei der Verringerung der Verfügbarkeit eines wichtigen metabolischen Signal in Entzündungs ​​Kontexten eine entscheidende Rolle spielen, wenn die Wechselwirkungen zwischen transplantierten Stammzellen und Wirtsimmunzellen sich ergänzen (Pluchino und Cossetti, 2013). Allgemeiner, unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit dem provokanten, dennoch Schwellen, Konzept von NSCs als Vorfahren Hüter des Gehirns kann mehrere komplementäre immunmodulatorischen und Gewebe trophischen Wirkungen ausüben (Martino und Pluchino, 2007).

Additional studies are needed to further characterize the function of the succinate-SUCNR1 axis in neuro-immune interactions, provide additional insights on the critical role of cellular metabolism for neural stem/progenitor cells (Knobloch and Jessberger, 2017), and develop complementary pharmacological interventions targeting this pathway in the chronically inflamed brain.

In conclusion, Wir zeigen hier, dass NSCs die extrazelluläre Succinat erfassen, die im chronisch entzündeten ZNS ansammelt neuroinflammation über Succinat-SUCNR1-abhängige Mechanismen zur Verbesserung. Unsere Arbeit identifiziert einen neuen anti-inflammatorischen Mechanismus, der das Regenerationspotential von somatischen und direkt induzierten NSC untermauert, und damit den Weg für eine neue Ära der personalisierten Stammzellen Medikamente für chronisch-entzündliche und degenerative neurologische Erkrankungen.


NBScience

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Stammzellen Therapie