بلعم المستمدة خارج الخلية سكسينات التراخيص الخلايا الجذعية العصبية لقمع Neuroinflammation المزمن

 

يسلط الضوء
• NSCs من الأنسجة الجسمية أو إعادة برمجة المباشرة قمع بالتساوي neuroinflammation
• خارج الخلية السكسينات ينشط SUCNR1 / GPR91 على NSCs
• NSCs المنشط تفرز PGE2 ومسح السكسينات, نوع بالتالي إعادة برمجة 1 النواب
• خفضت Sucnr1 NSCs متحولة النشاط المضادة للالتهابات بعد الزرع
ملخص
الخلايا الجذعية العصبية (NSC) زرع يمكن أن تؤثر الاستجابات المناعية وقمع التهاب في الجهاز العصبي المركزي. الأيض, مثل السكسينات, تعدل النمط الظاهري وظيفة الخلايا المناعية, ولكن ما إذا وكيف يتم تنشيط NSCs أيضا مثل immunometabolites للسيطرة مناعية والتهابات الردود غير واضح. هنا, وتبين لنا أن جسدية المزروعة وNSCs الناجم مباشرة يخفف التهاب الجهاز العصبي المركزي المزمن عن طريق خفض مستويات السكسينات في السائل المخي الشوكي, مما يقلل بلعمية وحيدات النوى (MP) تسلل وتلف الجهاز العصبي المركزي الثانوي. نواب التهابات تطلق السكسينات, الذي ينشط مستقبلات السكسينات 1 (SUCNR1)/GPR91 على NSCs, مما يؤدي بهم إلى إفراز البروستاجلاندين E2 وكنس خارج الخلية السكسينات مع تأثيرات مضادة للالتهابات لاحقة. وهكذا, عملنا يكشف دورا غير متوقع للمحور السكسينات-SUCNR1 في جسدي والتي يسببها مباشرة NSCs, التي تسيطر على استجابة الخلايا الجذعية إلى إشارات الأيض التهابات صدر عن نوع 1 نواب في الدماغ الملتهبة بشكل مزمن.

المقدمة
وقد أثار التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية أمل أن أمراض الجهاز العصبي المركزي ويمكن التخفيف من حدتها عن طريق الأدوية الخلايا الجذعية المكونة للدم غير (مارتينو وPluchino, 2006). قدمنا ​​أدلة دامغة على أن زرع الخلايا الجذعية العصبية الجسدية (NSCs) يحسن من ميزات اكلينيكية المرضية من نماذج حيوانية من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي التهابات. ما وراء استبدال الهيكلي للخلايا الجهاز العصبي المركزي المصاب, وقد أظهرت عملنا أن NSCs زرع الانخراط في البرامج المعقدة الخلايا الجذعية الكسب غير المشروع إلى المضيف الاتصالات, مما يؤدي عموما إلى الدعم الغذائي وتعديل من التكيف والاستجابة المناعية الفطرية (Bacigaluppi وآخرون., 2009, Bacigaluppi وآخرون., 2016, Pluchino وCossetti, 2013, Pluchino وآخرون., 2005, Pluchino وآخرون., 2009ب). على وجه التحديد, زرع NSC تقلل من عبء التهاب في موقع الإصابة (Pluchino وآخرون., 2005, Pluchino وآخرون., 2009ا), خفض عدد من نوع 1 البالعات وحيدات النوى التهابات (النواب) (Cusimano وآخرون., 2012), وتعزيز الشفاء من الجهاز العصبي المركزي المصاب عن طريق الآليات بعد سيئة اتسمت.

ومع ذلك, لا يزال الترجمة السريرية لعلاج NSC تجريبية محدودة من المصادر التي NSCs الإنسان (hNSCs) مشتق (أندرسون وآخرون., 2017), القدرة المناعية الذاتية خطوط hNSC خيفي (راموس زونيجا وآخرون., 2012, رايس وآخرون., 2013), واستقرار ما يسمى ب "خلية الكثير السريري المقصود" (أندرسون وآخرون., 2017, رايت وآخرون., 2006). ذاتي وقابلة للتوسيع مستقر NSCs الناجم مباشرة (iNSCs) من الخلايا الليفية الجلدية المرضى والناشئة باعتبارها بديلا صالحا للعلاجات NSC (Lu et al., 2013, ماير وآخرون., 2015, ثير وآخرون., 2012). إعادة برمجة مباشرة إلى iNSCs تتجنب تطور شاقة من خلال دولة المحفزة والتمايز لاحق في الأنساب المطلوب وصفها لالخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) تقنية (ماير وآخرون., 2015, ثير وآخرون., 2012). وبالتالي, جعل iNSCs توسع ثابت من الخلايا الجسدية يمثل أكثر الطرق الممكنة للحصول على الخلايا الجذعية في الدماغ ذاتي لتطبيقات سريرية المصب (Wörsdörfer وآخرون., 2013). ومع ذلك, لم يتم اختبار فعالية iNSCs برمجتها مباشرة في علاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي التهابات.

في أشكال التدريجي لمرض التصلب المتعدد (الآنسة), وأصيب التهاب الجهاز العصبي المركزي المزمنة تفعيل نطاق واسع من النواب التي تشمل كلا من CNS الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين والوحيدات المستمدة من التسلل الضامة (Mallucci وآخرون., 2015). تم العثور على النواب في الآفات المادة الرمادية, بالقرب من التردي neurites التي وأجسام الخلايا العصبية (بيترسون وآخرون., 2001), وفي آفات المادة البيضاء, حيث يرتبط الحافة الخارجية لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة مع تلف الأنسجة المزمن (Bramow وآخرون., 2010, Prineas وآخرون., 2001). وتتميز مناطق طبيعية، تظهر المادة البيضاء أيضا تراكم MP, الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل عقيدات دبقية التي تدفع علم الأمراض مرض بغض النظر عن ما يصاحب ذلك تنشيط الخلايا T (مول وآخرون., 2011). ويدعم دور ضار من التهاب مزمن يحركها النائب في MS التدريجي أيضا بأدلة في نماذج الأمراض الحيوانية, حيث يرتبط عبء الكلي مع وظيفة الخلايا العصبية ضعف (لوح آخرون., 2017), ضمور الدماغ (Tambalo وآخرون., 2015), وانخفاض ردود التجدد (جيانغ وآخرون., 2014).

تفعيل النواب من المحفزات الموالية للالتهابات يؤدي إلى التحول الأيضي نحو تحلل وانخفاض الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) (كيلي وأونيل, 2015). وتشير الأدلة الحديثة إلى أن, ضمن هذا تغيير الأسلاك الكهربائية الأيض, اكتب 1 نواب التهابات تتراكم السكسينات, مع الآثار المرضية الهامة (Tannahill وآخرون., 2013). سكسينات داخل الخلايا ويحول دون نشاط prolyl hydroxylases الانزيمات (الدكتوراه), وبالتالي استقرار نقص الأكسجين عنصر استجابة (مؤسسة الحرمين)-1ألفا وحمل نسخ من انترلوكين (IL)-1ب (Tannahill وآخرون., 2013). علاوة على ذلك, أكسدة السكسينات بواسطة نازعة سكسينات (SDH) repurposes الميتوكوندريا من تركيب ATP إلى أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الإنتاج وإضافية إشارة الموالية للالتهابات (مطاحن وآخرون., 2016). اكتب 1 نواب التهابات أيضا إطلاق سراح السكسينات خارج الخلية وupregulate مستقبلات المشابهة لها السكسينات 1 (SUCNR1), مستقبلات البروتين يقترن G- (المعروف أيضا باسم GPR91), الذي يعمل بمثابة جهاز استشعار autocrine ونظير الصماوي لتعزيز إنتاج IL-1β (يتلوود إيفانز وآخرون., 2016).

كما, الأيض تبرز باعتبارها هدفا علاجيا هاما لتعديل تفعيل كلا الضامة (كيلي وأونيل, 2015) والخلايا الدبقية الصغيرة (أوريويلا وآخرون., 2016), والممرات المتصلة السكسينات لها وظائف تغييري المناعية الرئيسية للأمراض الالتهابية الحادة والمزمنة (ريو وآخرون., 2003, Tannahill وآخرون., 2015).

ونظرا لإنشاء خصائص تغييري المناعية للNSCs (Pluchino وCossetti, 2013), افترضنا أن NSCs قد بذل الآثار العلاجية في neuroinflammation المزمن عن طريق تحوير النائب الأيض نحو الحد من الضرر CNS الثانوي.

في هذا العمل, نحن التحقيق في الآليات الجزيئية التي تعزز قدرة NSCs الجسدية والتي يسببها مباشرة لمواجهة التغيرات الأيضية من نوع 1 نواب التهابات سواء في المجراة في المختبر. وتبين لنا أن iNSCs وNSCs زرع ما يعادل وظيفيا في تحسين neuroinflammation المزمن في الفئران مع التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). iNSCs المزروعة / NSCs التبديل في التشكيل تفعيل الجهاز العصبي المركزي الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة والوحيدات المستمدة من التسلل الضامة نحو النمط الظاهري المضادة للالتهابات, فضلا عن تقليل مستويات السكسينات immunometabolite في السائل المخي الشوكي (CSF). iNSCs / NSCs أيضا تقليل السكسينات خارج الخلية الصادرة عن نوع 1 نواب التهابات لإعادة برمجة عملية الأيض لديهم نحو OXPHOS في المختبر. ميكانيكيا, وتبين لنا أن السكسينات التي يفرزها نوع 1 نواب يتسبب في iNSCs / NSCs ويشير سلسلة المصب SUCNR1, والتي تمكن نشاطهم المضادة للالتهابات. وتتوسط هذه الوظيفة المرخصة السكسينات المضادة للالتهابات من iNSCs / NSCs من إفراز البروستاجلاندين (PG) E2, فضلا عن الكسح كبير من السكسينات خارج الخلية. فقدان وظيفة Sucnr1 في NSCs يؤدي إلى انخفاض كبير في الأنشطة المضادة للالتهابات في المختبر والمجراة بعد زرع في EAE.

دراستنا تكشف محور السكسينات-SUCNR1 يوضح كيف تستجيب لإشارات NSCs التمثيل الغذائي للالتهابات لمنع تفعيل نوع 1 نواب في neuroinflammation المزمن.

النتائج
NSC زراعة إلى التقليل Neuroinflammation المزمن ويقترن الحد من Immunometabolite سكسينات في السائل المخي الشوكي
علينا أولا بتقييم الآثار المترتبة على intracerebroventricular (ICV) زرع في ذروة المرض (PD) من iNSCs أو NSCs في الفئران مع MOG35-55 الناجم عن EAE المزمن ومقارنته تحكم تعامل PBS الفئران EAE. قبل الزرع, تم توسيع iNSCs وNSCs, تتميز (شخصية S1), وصفت مع farnesylated (F)GFP في المختبر. في 30 يوما بعد زرع (استرجاع), iNSC وNSC زرع نجا, وزعت, ومتكاملة داخل الدماغ والحبل الشوكي EAE (الرقم S2). أقلية فقط من fGFP + الخلايا التي تم استردادها (iNSCs: 2.1% ± 0.9%; NSCs: 1.7% ± 0.1%) والمتكاثرة (الشكل 1A) أو التعبير عن العصبية (الشكل 1B), astroglial (الشكل 1C), أو oligodendroglial (الشكل 1D) علامات النسب (الرقم S2). الأغلبية (~75٪) من iNSCs على قيد الحياة لزرع وجدت بدلا من ذلك لا يمكن التعبير عن أي من علامات النسب العصبية اختبارها وتوطين حول مناطق تشبه مكانة المحيطة بالأوعية السحائية قريبة من F4 / + 80 نواب الذاتية (الشكل 1E), كما لوحظ في ترقيع NSC الجسدية (Cusimano وآخرون., 2012, Pluchino وآخرون., 2003). زرع iNSCs يسببها وكبيرة وطويلة الأمد (يصل إلى 90 استرجاع) تحسين عشرات EAE, التي بدأت من 15 إلى 20 DPT فصاعدا (أرقام 1F وS2). وأكد الانتعاش وظيفية أيضا عن طريق تحليل مشية الآلي بمساعدة الحاسوب (الرقم S2). بصورة شاملة, كانت iNSCs ICV المزروعة آمنة وأدت إلى انتعاش السلوكية والمرضية.

نحن ثم تحليلها وتكوين الجهاز العصبي المركزي تتسرب التهابات عبر المجراة سابقا التدفق الخلوي في iNSC- وNSC-زرعها مقابل السيطرة تعامل PBS-EAE الفئران. كان زرع iNSCs أو NSCs أي آثار على جزء من الجهاز العصبي المركزي تسلل خلايا T, خلايا B, ومجموع النواب, وكذلك في أن مجموعات فرعية خلية CD3 + / CD4 + T (بما في ذلك TH1, Th2, Treg, ThGM-CSF, وفرعية Th17) في 30 استرجاع (الشكل S3). في حين أن, NSC- أو NSC-زرع أظهرت الفئران EAE تحولا جذريا في التشكيل تفعيل CX3CR1 + الخلايا مع انخفاض ~1.5 أضعاف من CD80 + نوع 1 الخلايا الدبقية الصغيرة التهابات وزيادة موازية من MRC1 + الخلايا الدبقية الصغيرة المضادة للالتهابات (الشكل 1G). بطريقة مماثلة, CNS-التسلل (المشتقة من الوحيدات) CCR2 + الضامة من iNSC- خضع أو NSC-زرع EAE الفئران تحولا جذريا النمط الظاهري مع انخفاض ~1.3 أضعاف من CD80 + نوع 1 الضامة التهابات وبالتوازي مع زيادة-~1.8 حظيرة MRC1 + المضادة للالتهابات الضامة (الشكل 1H). ورافق هذا التأثير عن طريق خفض كبير للتعبير عن نوع 1 النائب التهابات علامة النيتريك محرض سينسيز أكسيد (iNOS) بواسطة F4 / 80 + النواب في الجسم الحي (أرقام 1I وS3).

ثم نقوم بتحليل مستويات التعبير عن المؤيد الرئيسي- والجينات المضادة للالتهابات في الجهاز العصبي المركزي كله. NSC- وNSC زرع الفئران EAE كلا عرضت انخفاضا كبيرا مستويات انترلوكين 1 بيتا (Il1b) في مستويات الدماغ والحبل الشوكي وزيادة مستقبلات المانوز نوع C 1 (Mrc1) في الحبل الشوكي, سواء في 10 استرجاع (الشكل 1J).

لم نعثر على أي اختلافات كبيرة في حاجز الدم في الدماغ (BBB) نفاذية في 30 DPT عند مقارنة iNSC- / NSC المزروعة مع تحكم تعامل PBS-EAE الفئران (الشكل S3).

أخيرا, NSC- وNSC زرع الفئران EAE المتراكمة انخفاض كبير في فقدان محور عصبي (الشكل 1K) وإزالة الميالين (الشكل 1L) في الحبل الشوكي.

ونظرا لأهمية المتبعة في عملية التمثيل الغذائي في تنظيم النمط الظاهري ووظيفة النواب, ونحن التحقيق ما إذا كان زرع NSC أثرت المكروية الأيض neuroinflammatory. لهذة النهاية, أجرينا التنميط الأيضية تشتته الأيض القطبية التي اللوني السائل إلى جانب لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) من عينات CSF والبلازما مطابقة (الجدول S1). أظهر تحكم تعامل PBS-EAE الفئران زيادة كبيرة في العديد من CSF (ولكن ليس البلازما) الأيض, من بينها السكسينات بلغت ذروتها إلا في 45 يوما بعد التحصين (نقطة في البوصة) (المقابلة ل 30 استرجاع; الشكل 1M). وأظهرت الفئران EAE لا تخضع لعملية جراحية أيضا زيادة كبيرة السكسينات فقط في CSF في 45 نقطة في البوصة (مقابل السيطرة على الفئران صحية), الذي لم يكن يختلف عن مستويات السكسينات في السيطرة تعامل PBS-CSF الفئران EAE (الشكل S3).

في حين أننا لم يكشف عن أي تغيير كبير في مستويات الأيض البلازما بين iNSC / NSC-زرع والسيطرة الفئران EAE PBS المعاملة (الجدول S1), وجدنا أن زرع iNSCs أو NSCs أدى إلى انخفاض كبير في السكسينات CSF في 30 استرجاع (الشكل 1M; الجدول S1).

بالإضافة إلى ذلك, لم نعثر على أي فروق ذات دلالة إحصائية في السكسينات CSF عند مقارنة تعامل PBS الفئران EAE مقابل EAE حقن الفئران ICV مع الخلايا الليفية الماوس (MFS) كما الخلايا السيطرة (الشكل S3).

وهكذا, iNSCs وNSCs حقنه مباشرة في EAE CNS لحث على التحول النمط الظاهري محدد من النواب, الذي يرتبط مع الحد من السكسينات immunometabolite في CSF فقط وتحسينها من neuroinflammation المزمن.

NSCs خفض مستويات سكسينات وإعادة برمجة والأيض من نوع 1 التهابات Mφ في المختبر
ثم نقوم بالتحقيق في الآليات الجزيئية التي من خلالها iNSCs / NSCs عرض الأنشطة المضادة للالتهابات على نوع 1 النواب, باستخدام النظام في المختبر الذي يلخص التفاعل بين النواب وiNSCs / NSCs. الضامة السذاجة المستمدة من النخاع العظمي. (Mφ) تم الاستقطاب إلى نوع 1 النمط الظاهري التهابات مع LPS (MφLPS), كما وصفت (Tannahill وآخرون., 2013). كانت MφLPS ثم شارك في تربيتها مع iNSCs (MφLPS-iNSCs) أو NSCs (MφLPS-NSCs) في نظام العابر جيدا أن يتجنب الاتصالات خلية إلى خلية (الشكل 2A). استخدمت Unpolarized Mφ والضوابط.

أظهر التنميط التعبير الجيني ميكروأري التغييرات النسخي كبيرة في MφLPS مع 7,401 الجينات تتأثر (مقابل Mφ; قيمة احتمالية المعدلة < 0.1; الشكل 2B; الجدول S2) و 51 الجينات وأعرب تفاضلي في MφLPS-iNSCs أو MφLPS-NSCs (مقابل MφLPS; قيمة احتمالية المعدلة < 0.1; الأرقام 2B و2C; الجدول S2). وقد أثرت هذه المجموعة الأخيرة من الجينات في العمليات الحيوية المتعلقة التنظيم الإيجابي للتنشيط الكريات البيض (اذهب: 0002696), النخاعي التمايز الكريات البيض (اذهب: 0002761), وعمليات الجهاز المناعي (اذهب: 0002376). وأكد التحقق من صحة QRT-PCR مستقلة عن Mφ الجينات الموالية للالتهابات اختيار downregulation كبير من مستويات التعبير عن Il12b, Il15, Il15ra, وCD69, فضلا عن الجينات الالتهابية الكلاسيكية Nos2, عامل نخر الورم (تنف), وIl1b في MφLPS-iNSCs وMφLPS-NSCs (مقابل MφLPS; الشكل 2D). واقترن هذا التأثير مع upregulation يصاحب ذلك من مستويات التعبير عن الجينات المرتبطة النمط الظاهري Mφ المضادة للالتهابات, مثل uronyl-2-ناقلة السلفات (فقرة) ونخاع العظام مستضد الخلايا اللحمية 1 (Bst1) (آل Shabany وآخرون., 2016, مارتينيز وآخرون., 2015), وكذلك أرجيناز 1 (ARG1) وMrc1 (مقابل MφLPS; الشكل 2E). عندما كانت iNSCs / NSCs شارك في تربيتها مع lipopolysaccharide في (LPS)-تنشيط خلايا فأر BV2 دبيقي كما كان من قبل, وقد لوحظ انخفاض كبير في مستويات التعبير عن الجينات الموالية للالتهابات Nos2 وIl1b أيضا (الشكل 2F).

لربط ملامح التعبير الجيني مع الدول التمثيل الغذائي وظيفية, قمنا بتقييم معدل استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (ECAR) من MφLPS كما قراءات من حامض على الكربوكسيليك (TCA) أنشطة دورة وحال السكر, على التوالي. لقد وجدنا انخفاض كبير في OCR وزيادة كبيرة في ECAR في MφLPS (مقابل Mφs). في حين أن, خضع MφLPS-iNSCs وMφLPS-NSCs ترميم كبيرة من كلا القيم OCR وECAR (مقابل MφLPS; أرقام 2G و 2H), كما لوحظ في التحول Mφ إلى النمط الظاهري المضادة للالتهابات (أونيل وبيرس, 2016).

في محاولة لتوضيح المحددات الأيضية لهذه التأثيرات المضادة للالتهابات, أجرينا تحليلا LC-MS تشتته للجزيء صغير محتوى أيض الخلية والخلايا من MφLPS. كما هو متوقع, LPS تحفيز تغييرا عميقا في الوسط الأيض الخلية والخلايا من Mφ (MφLPS) (مقابل Mφ; الجدول S3). في المشترك الثقافات, أظهرت MφLPS-iNSCs وMφLPS-NSCs كلا الحد بدرجة كبيرة من الصوديوم خارج الخلية, GABA, والسكسينات (مقابل MφLPS; الشكل 2I; الجدول S3). علاوة على ذلك, كما عرض MφLPS-iNSCs وMφLPS-NSCs انخفاض كبير في سكسينات داخل وitaconate (مقابل MφLPS; الشكل 2J; الجدول S3).

وتمشيا مع خفض مستويات السكسينات, وجدنا أن MφLPS-iNSCs وMφLPS-NSCs معارضها انخفاض كبير في مستويات مؤسسة الحرمين، 1α, من المنبع بروتين كيناز البيروفات ايزوزيم M2 (PKM2) (بالسون-ماكديرموت وآخرون., 2015; الشكل 2K), وكذلك IL-1β (مقابل MφLPS; الشكل 2L).

تماما, وتوفر هذه البيانات في المختبر دليل على أن iNSCs / NSCs تقلل من تراكم كلا سكسينات داخل الخلايا وخارج الخلية في المشترك الثقافات مع نوع 1 نواب التهابات, إعادة برمجتهم نحو النمط الظاهري OXPHOS المضادة للالتهابات.

إشارات السكسينات عبر SUCNR1 / GPR91 في الفأر والإنسان NSCs
ونظرا لأهمية السكسينات كإشارة immunometabolic, ونحن التحقيق سواء السكسينات أفرجت عن طريق نوع 1 نواب الموالية للالتهابات يمكن أن ينظم نشاط الخلايا المحيطة في الموقع, بما في ذلك زرع iNSCs / NSCs.

وجدنا أن iNSCs المزروعة / NSCs الكشف على مقربة من السحائي المناطق المحيطة بالأوعية (أرقام 3A و 3B ) وF4 / 80 + النواب (الشكل 3C) أعرب SUCNR1 في الجسم الحي في الجهاز العصبي المركزي. وأعرب عن SUCNR1 أيضا في مستوى البروتين في كل iNSCs وNSCs في المختبر, ولكن ليس في MFS (الشكل 3D).

لمزيد من تقييم ما إذا SUCNR1 في iNSCs / NSCs تم تفعيل وظيفيا من قبل السكسينات, ونحن التحقيق سلسلة المصب لها إشارات في المختبر. عندما تتعرض لالسكسينات (الشكل 3E; Rubic وآخرون., 2008), 34.2% (± 7.4٪) من iNSCs و 31.7% (± 6.5٪) من NSCs أظهر بيان من مخازن الكالسيوم داخل الخلايا (أرقام S4 و 3F). وأعقب هذا الرد من قبل upregulation كبير من الفوسفات-P38-تنشيط بروتين كيناز mitogen (الشكل الجيل الثالث 3G), يدل على تفعيله. أكدنا التعبير عن SUCNR1 وSUCNR1 أيضا في الجنين البشري NSCs (hNSCs) وiNSCs الإنسان (hiNSCs) (أرقام 3H و3I). كما هو الحال في iNSCs الماوس, وقد أثار السكسينات التي تعتمد P38 الإشارات في hiNSCs, ولكن ليس في hiNSCs قبل المعاملة مع مثبط 4C SUCNR1 انتقائية (الشكل 3J).

وهكذا, الفأر والإنسان iNSCs وNSCs التعبير عن SUCNR1 ظيفية, الذي يؤدي الى مسار الإشارات المصب من التحفيز لها مع السكسينات immunometabolite.

SUCNR1 تحفيز يبدأ إفراز البروستاجلاندين E2 كتبها NSCs
لتوضيح العواقب الوظيفية من SUCNR1 يشير في NSCs, ولدت لنا NSCs من الفئران التي تفتقر Sucnr1 (Sucnr1 - / - NSCs) (Rubic وآخرون., 2008; الشكل S4). مقارنة للسيطرة على NSCs, Sucnr1 - / - أظهرت NSCs منحنيات النمو والتمايز مماثلة في المختبر (الشكل S4). ومع ذلك, عندما تتعرض لالسكسينات في نقاط زمنية مختلفة، وتركيزات, Sucnr1 - / - أظهرت NSCs لا upregulation من الفوسفات-P38 (الشكل S4). التحفيز مع الغلوتامات أو ATP + thapsigargin يتسبب في Sucnr1 - / - NSCs استجابة الكالسيوم مماثلة لتلك التي NSCs السيطرة (الشكل S4). على العكس تماما, لم العلاج السكسينات لا تثير إطلاق الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا (الشكل S4), التي أشارت إلى SUCNR1 عيب يشير في Sucnr1 - / - NSCs.

نحن ثم تنفيذ عملية التعبير الجيني التنميط ميكروأري بعد العلاج مع السكسينات في NSCs السيطرة وSucnr1 - / - NSCs (الجدول S4). وجدنا أن سينسيز البروستاجلاندين-endoperoxide 2 (Ptgs2), إنزيم أساسي في PG الحيوي ترميز PTGS2 محرض, كان هذا الجين أكثر upregulated في NSCs ضبط حفز السكسينات (تغيير أضعاف log2 1.05), ولكن ليس في Sucnr1 السكسينات حفز - / - NSCs (log2 تغيير أضعاف -0.43; الشكل 4A). نحن التحقق من صحة هذه النتائج على Ptgs2 التي كتبها QRT-PCR, مؤكدا أن مستويات التعبير عنها وupregulated بشكل ملحوظ (2.1- إلى 2.7 أضعاف التغيير) في iNSCs حفز السكسينات وNSCs, في حين أنها لم تكن في Sucnr1 السكسينات المعالجة - / - NSCs (الشكل 4B).

ونظرا للدور PGE2 كمنظم للآثار المثبطة للمناعة الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) (Vasandan وآخرون., 2016, يانيز وآخرون., 2010), اختبرنا تراكمه في وسائل الإعلام زراعة الأنسجة من iNSCs, NSCs, وSucnr1 - / - NSCs بعد التحفيز مع السكسينات. iNSCs وNSCs, ولكن ليس Sucnr1 - / - NSCs, أظهرت أهمية (>2.5-يطوى) زيادة الإفراج القاعدية لها من PGE2 في أقرب وقت 30 دقيقة بعد السكسينات. تم إلغاء هذا التأثير الناجم عن السكسينات لما قبل العلاج مع لا رجعة فيه PTGS2 مانع SC-58125 (الشكل 4C). كما هو الحال في iNSCs الماوس, تعرض hiNSCs إلى السكسينات أثارت زيادة كبيرة في تركيزات PGE2 في وسائل الإعلام زراعة الأنسجة, في حين مرة أخرى قبل المعالجة إما SC-58125 أو 4C منع صدوره (الشكل 4D).

لتوسيع مدى أهمية هذه النتائج للمشاركة في الثقافات بين NSCs وMφLPS, قمنا بتحليل مستويات PGE2 في وسائل الإعلام زراعة الأنسجة. وجدنا أن MφLPS-NSCs المتراكمة مستويات أعلى من PGE2 مقارنة MφLPS, في حين ما قبل المعالجة من NSCs المشارك مثقف مع SC-58125 انخفاض كبير في مستويات PGE2 (الشكل 4E). واقترن SC-58125 المعالجة المسبقة من NSCs أيضا مع زيادة كبيرة في التعبير Il1b في MφLPS (الشكل 4F) ومع تخفيض OCR القيم يدل على النمط الظاهري الموالية للالتهابات (الشكل 4G). ومع ذلك, لاحظنا أن NSCs قبل تعامل مع SC-58125 احتفظت بعض الآثار المضادة للالتهابات المتبقية على MφLPS مقارنة Sucnr1 - / - NSCs (الشكل 4F). على العكس تماما, فقدان Sucnr1 وظيفة في NSCs ألغيت تماما آثارها المضادة للالتهابات على MφLPS (الأرقام 4F و 4G). وتبين لنا أيضا أن القدرة احظ تعتمد على PGE2 المضادة للالتهابات من NSCs وحفظها وصلة NSCs الإنسان.

كما, الناجم hiNSCs انخفاض كبير في التعبير Il1b في MφLPS في المشترك الثقافات (الشكل 4H), الذي اقترن مع استعادة القيم OCR (الشكل 4I) وزيادة مستويات PGE2 في وسائل الإعلام زراعة الأنسجة (الشكل 4J). قمعت تماما هذه الآثار لما قبل علاج hiNSCs مع المانع 4C SUCNR1 انتقائية (الأرقام 4H-4J).

وهكذا, تفعيل SUCNR1 إشارات الطريق في الماوس وNSCs الإنسان يؤدي الافراج عن PGE2 مما يؤدي إلى تأثيرات مضادة للالتهابات على نوع 1 النواب.

ومع ذلك, تجارب تثبيط تستهدف إما PTGS2 أو SUCNR1 نتوقع أن إضافية SUCNR1-تعتمد على PGE2-آليات مستقلة من المرجح أن يلعب دورا رئيسيا في تأثيرات مضادة للالتهابات من NSCs.

SUCNR1 تحفيز مشغلات امتصاص سكسينات من NSCs
كشفت صفائف التعبير الجيني من NSCs السكسينات حفز أن, إلى جانب Ptgs2, كان NaCT / Slc13a5 بين الجينات الأكثر upregulated في البرية من نوع (WT) NSCs (تغيير أضعاف log2 = 0.49), ولكن ليس في Sucnr1 - / - NSCs (log2 تغيير أضعاف = -0.12). SLC13A5 هو dicarboxylate شارك في نقل المعروف أن تشارك في نقل السكسينات (Srisawang وآخرون., 2007). ونظرا لنضوب ثابت من السكسينات وجدت سواء في الجسم الحي في CSF من iNSC- أو NSC زرع الفئران EAE في المختبر في المشترك الثقافات مع MφLPS, افترضنا أن iNSCs / NSCs من شأنها تفعيل SLC13A5 لمسح السكسينات.

وجدنا أن التعبير عن SLC13A5, وكذلك من عالية تقارب dicarboxylate شارك في نقل SLC13A3, وزادت بشكل ملحوظ في iNSCs وNSCs, ولكن ليس في Sucnr1 - / - NSCs, على التحفيز السكسينات (الشكل 5A). وبالمثل, hiNSCs تتعرض لالسكسينات upregulated مستويات بروتين تعبير كل من هذه SLC13 المشارك النقل في المختبر (الشكل 5B).

ونحن التحقيق بجانب دور هذه شارك في النقل عن طريق قياس امتصاص السكسينات في iNSCs وNSCs. لقد وجدنا أن كلا iNSCs وNSCs تراكمت بشكل كبير [14C]-السكسينات (الشكل 5C) مع الحد من كمية خارج الخلية [14C]-السكسينات في وسائل الإعلام زراعة الأنسجة (الشكل 5D). Sucnr1 - / - NSCs لا المتراكمة [14C]-سكسينات داخل الخلية كما أنها لم تستنفد ذلك خارج الخلية (الأرقام 5C و5D). ومن المثير للاهتمام, Sucnr1 - / - NSCs, الذي أظهرنا أن له أي آثار على التعبير Il1b في MφLPS (الشكل 4F), فشلت في خفض مستويات السكسينات خارج الخلية في المشترك الثقافات مع MφLPS (الشكل 5E). يعتبر دليلا آخر على أهمية نضوب السكسينات في تحوير النمط الظاهري من نوع 1 نواب الموالية للالتهابات, وتبين لنا أن العلاج مع المؤتلف نشط (ص)SDH معقدة فرعية A قادر على خفض كبير في التعبير عن Il1b في MφLPS (الشكل S5).

وهكذا, SUCNR1 الإشارات في NSCs يطالب امتصاص من السكسينات immunometabolite, وبالتالي استنزاف تجمع خارج الخلية متاح الحفاظ على تفعيل autocrine ونظير الصماوي من نوع 1 النواب.

زرع Sucnr1 الخسارة من وظيفة NSCs يظهر ضعف القدرة على تحسين Neuroinflammation المزمن في فيفو
لتأكيد دور المحور SUCNR1 السكسينات في التوسط في استجابة الطعوم NSC إلى السكسينات في الجسم الحي, قمنا بتقييم الآثار المترتبة على زرع ICV من Sucnr1 - / - NSCs في الفئران مع EAE المزمن.

في 30 استرجاع, Sucnr1 - / - نجا NSCs, وزعت, ومتكاملة داخل الدماغ والحبل الشوكي EAE مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة للسيطرة على NSCs (الشكل S6). ومع ذلك, زرع Sucnr1 - / - NSCs يتسبب سوى انتعاش طفيف من EAE العجز السلوكية مقابل السيطرة تعامل PBS الفئران EAE (EAE درجة-Sucnr1 - / - NSCs: 2.9 ± 0.2; PBS: 3.6 ± 0.4), الذي كان إلى حد كبير أقل وضوحا (50% تأثير) من تلك التي لوحظت في الفئران EAE المزروعة مع NSCs السيطرة (EAE درجة-NSCs: 2.1 ± 0.3; الشكل 6A).

أظهر خارج الحي التحليل القائم التدفق الخلوي للتكوين CNS تتسرب التهابات التي زرع الفئران EAE مع Sucnr1 - / - فشل NSCs لتحويل النسب من نوع 1 التهابات ومضادة للالتهابات النواب، بما في ذلك CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة وCCR2 + التسلل الضامة في تناقض مع آثار NSCs ضبط الوحيدات المستمدة (الأرقام 6B و6C). كذلك أكد آخر الأنسجة بعد الوفاة أمراض خفض الآثار الأنسجة الواقية من Sucnr1 - / - ترقيع NSC (الأرقام 6D و6E).

ثم نقوم بالتحقيق في مستويات PGE2 والسكسينات في عينات CSF والبلازما يقابل من NSC-زرعها ومراقبة تعامل PBS-EAE الفئران. لقد وجدنا أن كلا Sucnr1 - / - NSCs وNSCs السيطرة فشلت في إحداث تغييرات كبيرة في مستويات PGE2 في CSF. زيادة البلازما PGE2 بشكل ملحوظ في الفئران EAE فقط (مقابل الاصحاء), مع عدم وجود تأثير العلاج لوحظ (الشكل 6F). الأهم, في حين زرع NSCs السيطرة خفض CSF السكسينات (HC: 5.524 × 107 a.u. ± 0.19; PBS: 9.35 × 107 a.u. ± 0.14; NSCs: 5.64 × 107 a.u. ± 0.44), Sucnr1 - / - أظهرت ترقيع NSC أي آثار (Sucnr1 - / - NSCs: 10.40 × 107 a.u. ± 2.59; الشكل 6G).

وتؤكد هذه البيانات متطلبات وظيفية SUCNR1 إشارات الطريق في تنظيم تأثيرات مضادة للالتهابات واعصاب من زرع NSC في الجسم الحي وتؤكد على أهمية نظافتها السكسينات كآلية السائدة المضادة للالتهابات عمل NSCs.

نقاش
وهناك حاجة السريرية غير الملباة لوضع نهج الخلوية والجزيئية لاستهداف السائقين جوهر الفيزيولوجيا المرضية لظروف neuroinflammatory المزمنة التي تشمل أشكال التدريجي لMS (فولبي وآخرون., 2016). في المبدأ, الخلايا الجذعية تمتلك الإمكانات العلاجية والتي تختلف عن تلك الجزيئات الصغيرة والبيولوجية وتمتد إلى أبعد من الكلاسيكية الساحة الطب التجديدي. المخدرات جزء وجزء جهاز, الخلايا الجذعية يمكن أن تعمل وكلاء المعدلة للمرض كما البيولوجي (مناطق السوق المحددة) أن إشارات الإحساس المختلفة, الهجرة إلى مواقع محددة في الجسم, دمج المدخلات لاتخاذ القرارات, وتنفيذ السلوكيات استجابة معقدة في سياق المكروية الأنسجة محددة (المسعف وآخرون., 2013). يمكن تسخيرها كل هذه الصفات لعلاج العديد من العمليات المرض, بما في ذلك يحركها النائب استمرار التهاب الأنسجة والانحطاط التي تحدث في MS التدريجي.

هنا, كنا الوصول إليها, ذاتي, وiNSCs توسع ثابت (ثير وآخرون., 2012), وكذلك NSCs الجسدية, للتحقيق في الآثار المترتبة على زرع الخلايا الجذعية في الدماغ في نموذج الفأر من neuroinflammation المزمن, الذي يحاكي تتالي الالتهابات التي لوحظت في MS التدريجي.

وجدنا أن زرع iNSCs إلى الدورة الدموية CSF من EAE الفئران يعزز النتائج تعادل تلك التي لوحظت من قبل في الفئران المزروعة مع جسدية NSCs (Pluchino وآخرون., 2003). iNSCs المزروعة أو NSCs الناجم عن تحسن سريري كبير, فضلا عن انخفاض محور عصبي وتلف المايلين, مع عدم وجود انخفاض كبير في BBB نفاذية في 30 استرجاع. وإجراء المزيد من الدراسات على توضيح ما إذا كانت التغييرات من BBB نفاذية أو توظيف حيدات التهابات في الجهاز العصبي المركزي تحدث مباشرة بعد زرع iNSCs / NSCs. إذا كان هذا التأثير المحتمل لتغيير النتائج السريرية الرئيسية من الأمراض التي تنتشر فيها ظاهرة CNS تسلل الخلايا الالتهابية, مثل EAE / MS, من الصعب أن نتوقع.

في حين أن, وجدنا أن لدينا نموذج للزراعة كان مرتبطا مع مفتاح محدد في ملف التعريف تفعيل كل من CX3CR1 + خلايا دبقية وCCR2 + الوحيدات المستمدة الضامة التسلل وذلك بانخفاض قدره على CD80 + نوع 1 نواب التهابات وزيادة موازية من MRC1 + المضادة للالتهابات النواب. iNSCs المزروعة / NSCs وزعت ونجا في الجهاز العصبي المركزي من الفئران EAE, حين تتراكم بشكل تفضيلي على مستوى المناطق المحيطة بالأوعية السحائي في تجاور للنواب الذاتية. تماما, فإن هذه النتائج تعني وجود بعض الآليات غير معروف حتى الآن من اقتران بين الخلايا بين الخلايا الجذعية المطعمة والنواب التهابات. إذا كانت هذه الاتصالات iNSC / NSC-MP في الجسم الحي يحدث فقط في المنافذ المحيطة بالأوعية أو أيضا على مستوى الهياكل المناعة الناشئة الأخرى مثل أجهزة الاستشعار في الدماغ والتي تشمل الضفيرة المشيمية يبقى أن تعالج (جنرال الكتريك وآخرون., 2017).

ثم نقوم بالتحقيق في آليات المناعية الأساسية الدافعة الآثار المفيدة من NSCs على النواب خلال neuroinflammation المزمن. كشفت تشتته تحليل جزيء صغير من عينات CSF والبلازما يقابل التغيرات الأيضية عميقة في CSF من الفئران EAE, مع وجود اختلافات بين وقت مبكر وتأخر مراحل المرض.

كارنيتين, يسين + آيسولوسين, سيترولين, آلانتوين, الأورنيثين, وحمض اليوريك وزادت عن حد كبير في السيطرة EAE الفئران التي عولجت PBS-في ذروة المرض. نتائجنا تتفق مع الأدلة المنشورة تبين أن ليسين, وكذلك حمض اليوريك وآلانتوين كل منتجاتها, تزداد كل في CSF من الموضوعات مع MS (Amorini وآخرون., 2009, هوبر وآخرون., 1998, موناكو وآخرون., 1979). في حين لم يتم الإبلاغ عن زيادة الكارنيتين CSF في MS, وقد وصفت زيادات مهمة في غير MS-حالات التهاب الجهاز العصبي المركزي, مثل التهاب الدماغ (Wikoff وآخرون., 2008) والتهاب السحايا (الشناوي وآخرون., 1998).

العكس بالعكس, فقط أظهرت السكسينات تأخر (أي, 45 نقطة في البوصة) زيادة في السائل النخاعي من السيطرة تعامل PBS-EAE الفئران. السكسينات أصبحت قيمة في العلامات البيولوجية الجسم الحي الضيق التمثيل الغذائي والنشاط الالتهابي (يتلوود إيفانز وآخرون., 2016, مطاحن وأونيل, 2014). الأهم, وجدنا أن السكسينات وقد انخفضت بشكل ملحوظ في CSF من الفئران زرع NSC-iNSC- /. وكان الحد من السكسينات CSF التالية iNSC أو زرع NSC المصالح وقد يكون لها دور بارز في التدخل في neuroinflammation المزمن.

السكسينات صدر من نوع 1 نواب التهابات هي إشارة التهابات الرئيسية التي تتفاعل مع مستقبلات محددة في جانب G-البروتين SUCNR1. يعمل SUCNR1 بمثابة كشف المبكر عن الإجهاد التمثيل الغذائي في العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية, بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الرينين, نقص التروية / إصابة ضخه, التهاب, تراكم الصفائح الدموية, والأوعية الدموية في شبكية العين (كاسترو فونسيكا وآخرون., 2016, جليسين وآخرون., 2016). والجدير بالذكر, وجدنا أن هناك حاجة للتعبير عن SUCNR1 عن الآثار العلاجية لNSCs المزروعة في الجسم الحي.

السكسينات بوساطة تفعيل SUCNR1 على القوارض وiNSCs البشرية وNSCs ينشط إشارات الكالسيوم وتنشيط mitogen بروتين كيناز (Nafk) الفسفرة في المختبر, وبالتالي انتزاع الاستحواذ على النمط الظاهري منسقة المضادة للالتهابات في NSCs. على يدا واحدة, تنشيط SUCNR1 إفراز PGE2, راسخة المغير المناعة عديد المظاهر, وتستهدف وظيفة التي أنواع الخلايا متعددة داخل المكروية الملتهبة, بما في ذلك النواب (كوتا وآخرون., 2017, Vasandan وآخرون., 2016). من ناحية أخرى, أدى السكسينات-SUCNR1 يشير في iNSCs وNSCs إلى upregulation اثنين من عائلة SLC13 من شارك في نقل الأعضاء (أي, SLC13A3 وSLC13A5) والإقبال على السكسينات خارج الخلية.

في الجسم الحي, علينا أن نبرهن الكسح الفعال للالسكسينات المحلية خارج الخلية التي كتبها NSCs حقنه في الفئران EAE من خلال تداول CSF, وهو الغالب, مقارنة مع إفراز PGE2. أدى فقدان إشارة SUCNR1 التي تعتمد في NSCs المزروعة إلى انخفاض كبير في تأثيرات مضادة للالتهابات واعصاب بهم, في حين Sucnr1 - / - أظهرت ترقيع NSC لا فرق من البقاء على قيد الحياة, توزيع, والتمايز مقابل NSCs السيطرة.

ثم أننا نفترض أن السكسينات خارج الخلية يفرز عن طريق نوع 1 نواب التهابات يبادر سلوك الكسح التي زرعها NSCs ضبط استجابة لزيادة توافر الركيزة (Srisawang وآخرون., 2007). هذا اقتران الأيض بين الخلايا رواية يناسب بشكل جيد مع الاداء الأدب المتاحة التي, داخل microenvironments محددة, خلايا تتنافس للحصول على المواد الغذائية المتاحة, التي تؤثر على وظيفة كل منهما ومصير (بيرس وبيرس, 2013).

ونحن نتوقع أن نضوب السكسينات التي كتبها SUCNR1، معربا عن iNSCs وNSCs قد تلعب دورا حاسما في الحد من توافر إشارة الأيض الأساسية في سياقات التهابات حيث تصبح التفاعلات بين الخلايا الجذعية المزروعة واستضافة الخلايا المناعية التكميلية (Pluchino وCossetti, 2013). بشكل عام, النتائج التي توصلنا إليها هي في خط مع استفزازية, حتى الآن لا يزال الناشئة, مفهوم NSCs حراسا الأجداد من الدماغ قادرة على ممارسة عدة تغييري المناعة والأنسجة آثار التغذية التكميلية (مارتينو وPluchino, 2007).

هناك حاجة لدراسات إضافية لزيادة توصيف وظيفة للSUCNR1 سكسينات محور في التفاعلات العصبية المناعة, تقديم رؤى إضافية على الدور الحاسم للالأيض الخلوي للخلايا الجذعية العصبية / السلف (نوبلوخ وJESSBERGER, 2017), وتطوير التدخلات الدوائية التكميلية التي تستهدف هذا المسار في الدماغ التهاب مزمن.

فى الختام, نعرض هنا أن NSCs الشعور السكسينات خارج الخلية التي تتراكم في الجهاز العصبي المركزي التهاب مزمن لتحسين neuroinflammation عبر آليات السكسينات-SUCNR1 التي تعتمد على. ويحدد عملنا آلية مضادة للالتهابات الرواية التي تدعم إمكانات التجدد الجسدي وNSCs الناجم مباشرة, مما يمهد الطريق لحقبة جديدة من الأدوية الخلايا الجذعية شخصية للأمراض العصبية والتهابات التنكسية المزمنة.


NBScience

منظمة بحثية العقد

العلاج بالخلايا الجذعية